本发明属于基因克隆
技术领域：
，具体涉及一种普通小麦基因taspx3编码序列的克隆及其应用。
背景技术：
磷在植物生长发育过程中是一个重要的大量元素，但是由于磷在土壤中易形成其不溶的沉淀，很难被作物吸收，从而降低了磷的生物有效性，土壤中的有效磷远低于作物所需要的磷含量。而小麦作为我国的主要粮食作物之一，土壤中有效磷的缺乏严重制约着小麦产量的增加，所以寻找小麦耐低磷基因已成为解决该难题的有效方法。大量研究证明spx结构域与磷信号紧密相关，有可能在小麦的耐低磷机制中发挥重要作用。本发明人前期利用affymatrix基因芯片技术筛选出水培条件下受磷胁迫强烈诱导上调表达的基因taspx3，该基因属于磷稳态调控密切相关的植物spx家族，极有可能在小麦耐低磷机制中发挥重要作用。因此研究小麦taspx3的基因功能，提高作物对磷的利用率，能更好的为分子育种奠定基础。大量研究证明spx结构域与磷信号紧密相关，有可能在小麦的耐低磷机制中发挥重要作用。因此研究小麦taspx3的基因功能，提高作物对磷的利用率，能更好的为分子育种奠定基础。小麦taspx基因具有双重调控角色，不但参与磷调控，还参与小麦抗病过程，这对小麦抗病及免疫调控研究提供了新的抗性基因资源。然而由于普通小麦是复杂的六倍体基因组，包括spx基因在内的磷调节基因的功能分析及应用非常困难，现有技术缺乏一种小麦基因taspx3编码序列的克隆及应用。技术实现要素：本发明提供的一种普通小麦基因taspx3编码序列的克隆及其应用，获得了小麦基因taspx3编码序列的克隆，提供了小麦基因taspx3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。本发明的第一个目的是提供一种普通小麦基因taspx3编码序列的克隆，所述小麦基因taspx3编码序列的克隆是按照以下方法获得的：(1)提取小麦总rna，并合成小麦cdna；(2)以小麦cdna为模板pcr扩增基因taspx3全长cdna，其中，pcr扩增所用引物序列如下：taspx3上游引物：5’-gctctagaatgaagtttgggaagaggctcaag-3’；taspx3下游引物：5’-gggtcgactcaaaccacccggacaatacc-3’；(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的片段并测序鉴定，测序正确的即为小麦基因taspx3编码序列的克隆。本发明的第二个目的是提供一种所述的小麦基因taspx3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。优选的，根据所述的小麦基因taspx3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用，先构建出改进的重组植物表达载体，重组植物表达载体上连接有小麦基因taspx3编码序列的克隆和gfp基因，然后将所述重组表达载体转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因taspx3在植物耐低磷机制和遗传改良中的应用。优选的，根据所述的小麦基因taspx3编码序列的克隆在研究植物耐低磷机制和遗传改良中的应用，具体步骤如下：s1，t-taspx3重组质粒的构建连接所述小麦基因taspx3编码序列的克隆与-t载体：对纯化的小麦基因taspx3编码序列的克隆加a尾，得到带a尾的目的基因；然后将带a尾的目的基因与-t载体连接，得到重组质粒t-taspx3；s2，改进的重组植物表达载体t-p的构建利用xbai和sali分别对重组质粒t-taspx3和p1300-gfp载体进行双酶切，分别得到重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物；利用t4dna连接酶对重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物进行连接，得到改进的重组植物表达载体t-p；s3，农杆菌侵染植物体种植野生型植物体；制备农杆菌感受态细胞；然后用重组表达载体t-p转化农杆菌感受态细胞；挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染植物体；得到能有效克隆小麦基因taspx3编码序列的转基因植物体。优选的，根据上述应用，所述农杆菌为农杆菌gv3101。优选的，根据上述应用，所述植物体为拟南芥或者小麦。优选的，根据上述应用，s3中挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染植物体后，经过3代自交，筛选出含有小麦基因taspx3编码序列的植物体，用于研究小麦基因taspx3编码序列在植物体耐低磷机制和遗传改良中的应用。与现有技术相比，本发明的普通小麦基因taspx3编码序列的克隆及其应用，具有以下有益效果：本发明获得了普通小麦基因taspx3编码序列的克隆，利用克隆得到的小麦基因taspx3编码序列的全长cdna序列和改造后的带gfp标签的ps1300-gfp载体，构建taspx3过表达重组载体t-p，然后以农杆菌为媒介通过花絮侵染法转化拟南芥，并将检测获得阳性突变植株经逐代的分子鉴定与自交纯合，得到t3代(自交3代后的植株)纯合的转基因植株，构建成taspx3拟南芥过表达株系。普通小麦是复杂的六倍体基因组，包括spx基因在内的磷调节基因的功能分析非常困难，而拟南芥植株基因组小、易于转化。所以本发明首先在生物信息学的基础上预测spx基因，再利用植物表达载体使小麦taspx3基因在拟南芥里过量表达，通过研究生理表型及表达分析来初步明确小麦taspx3基因的功能，同时观察taspx3在转基因拟南芥中的组织定位，为之后小麦基因taspx3的克隆在植物体(尤其是小麦)耐低磷机制研究及遗传改良应用奠定基础。附图说明图1为小麦总rna的电泳检测图；其中所有的泳道均为小麦总rna样品；图2为目的小麦基因taspx3的全长cdna克隆；其中m泳道为dl2000marker；1、2泳道均为小麦基因taspx3的全长cdna克隆；图3为转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后的阳性菌落鉴定结果；其中m泳道为dl2000marker，1-6号泳道均为阳性菌落；图4为重组质粒t-taspx3的pcr验证电泳结果；其中m泳道为dl2000marker；1、2、3泳道均为重组质粒t-taspx3；图5为重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物的电泳图；其中m泳道为dl2000marker；1泳道为p1300-gfp载体双酶切产物，2泳道为重组质粒t-taspx3载体双酶切产物；图6为重组表达载体t-p的酶切鉴定结果及质粒pcr鉴定结果；其中m泳道为dl2000marker；1泳道为重组表达载体t-p的单酶切验证；2泳道为重组表达载体t-p的xbai、sali双酶切验证；3泳道为重组表达载体t-p的pcr验证；5泳道为1泳道的平行重复实验；6泳道为2泳道的平行重复实验；7泳道为3泳道的平行重复实验。图7为转基因植株的抗生素筛选图；图8为转基因植株的分子检测结果其中m泳道为dl2000marker；1-2泳道为野生型拟南芥(taspx3yg)；3-4泳道为野生型拟南芥(actin2)；5-6泳道为转基因拟南芥(taspx3yg)；7-8泳道为转基因拟南芥(actin2)。图9为转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况；其中，图9a为缺磷处理结果、图9b为低磷处理结果、图9c为高磷处理结果；图10为14天ms中的拟南芥根部taspx3基因的相对表达量；图11为14天ms中的拟南芥地上部taspx3基因的相对表达量；图12转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下成株期的生长状况；其中，图12a是转基因拟南芥t3-7的植株生长结果，图12b是野生型拟南芥的植株生长结果；图13为14天水培条件下的拟南芥根部taspx3基因的相对表达量；图14为14天水培条件下的拟南芥地上部taspx3基因的相对表达量。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。本发明提供的一种普通小麦基因taspx3编码序列的克隆及其应用，包括以下实施例。下述实施例中所用材料和试剂如下：材料：哥伦比亚野生型拟南芥、ps1300-gfp载体(invitrogen)、大肠杆菌dh5α(invitrogen)、农杆菌gv3101(invitrogen)。试剂：kod高保真酶试剂盒、taqdnapolymerase试剂盒(cwbio)、dna-marker(takara)、xbai限制性内切酶、sali限制性内切酶、dna纯化回收试剂盒(genemark)、-t载体(promega)、质粒小量制备试剂盒(generaytm)、t4dna连接酶(invitrogen)、taqmastermix(invitrogen)、rna纯化试剂盒(thermofisher)、hiscriptπ1ststrandcdnasynthesiskit(vazyme)、琼脂糖(promega)，其余试剂如trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、次氯酸钠、mes、蔗糖、琼脂等，均为国产分析纯。实施例1一种普通小麦基因taspx3编码序列的克隆，所述普通小麦基因taspx3编码序列的克隆是按照以下方法获得的：(1)提取小麦总rna，并合成小麦cdna；a1，提取小麦总rna：方法采用trizol法提取小麦总rna。a2，小麦总rna的质量检测①浓度的测定：取1μlrna溶液在nanodrop2000上测定其浓度，同时a260/a280和a260/a230的值代表其纯度。经检测后小麦总rna的浓度为1859ng/μl，a260/a280为1.93，a260/a230为1.98。②rna的琼脂糖凝胶电泳检测：1％的琼脂糖电泳检测rna，125v电压下20min，随后开始照胶，图1为小麦总rna的电泳检测图，能看到28s的条带,结果显示rna提取质量较好，可用于后续实验。a3，去除小麦总rna中的基因组dna：在rnase-free的离心管中利用rna纯化试剂盒去除基因组dna，按表1加入下列试剂。表1去除dna的试剂加入量a4，合成小麦cdnaa.rna模板变性：在rnase-free的离心管中加入下列表2中的试剂：表2rna模板变性的试剂加入量物质用量randomhexamers(50ng/μl)1μltotalrna1pg-5μgrnasefreeddh2oto8μl65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min，得rna变性液。b.配制第一链cdna合成反应液：rna变性液8μl2×rtmix10μlhiscriptiienzymemix2μlc.按下列条件进行第一链cdna合成反应25℃5min50℃45min85℃2min得到小麦cdna，放于-80℃保存。(2)以小麦cdna为模板pcr扩增taspx3基因全长cdna。表3taspx3全长引物序列以小麦cdna为模板pcr扩增taspx3基因全长，pcr管中所加的体系如表4所示。表4taspx3基因全长pcr体系物质用量10×pcrbufferforkod-plus-neo5μldntpmix5μlmgso43μltaspx3上游引物(见表3)2μltaspx3下游引物(见表3)2μlcdna1μlkod-plus-neo1μlddh2oto50μl按照下列程序开始扩增：94℃变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后延伸步骤为72℃5min，于4℃保存。扩增产物为小麦基因taspx3的全长cdna，作为目的基因taspx3。(3)回收并纯化(2)的扩增产物中目的基因taspx3(789bp)，该目的基因taspx3即为小麦基因taspx3编码序列的克隆。取50μls13中pcr反应产物，用dm2000dna-mraker为参照，在1％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统扫描成像。目的基因taspx3的全长cdna克隆如图2所示，图2结果显示在1％的琼脂糖凝胶中大约780bp左右有一条单一的清晰的条带，与taspx3大小相近，为taspx3的产物，可以用于下一步纯化步骤。纯化具体步骤按dna纯化回收试剂盒说明书进行。本发明还提供了一种所述的小麦基因taspx3的克隆在植物耐低磷机制和遗传改良中的应用，先构建出改进的重组植物表达载体，重组植物表达载体上连接有小麦基因taspx3编码序列的克隆和gfp基因，然后将所述重组表达载体转化入植物体内，得到转化植株，利用转化植株研究小麦基因taspx3的耐低磷机制和进行遗传改良。具体步骤如下：s1，t-taspx3重组质粒的构建连接所述小麦基因taspx3编码序列的克隆与-t载体：由于本实施例所用高保真酶扩增的基因是平末端，所以对在纯化的小麦基因taspx3编码序列的克隆加a尾，得到带a尾的目的基因。用如下方法：10μl纯化的基因taspx3+1μltaqmastermix，72℃孵育30min，得到带a尾的目的基因。目的基因taspx3与-t载体连接，连接体系如表5所示：表5taspx3与-t载体连接体系上述体系混匀在室温(最好是25℃)1h，4℃过夜连接，得到重组质粒t-taspx3。将所述重组质粒t-taspx3转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中保存，使用时提取重组质粒t-taspx3。s11，制备大肠杆菌dh5α感受态细胞：大肠杆菌dh5α感受态细胞按照常规分子实验方法进行，-80℃保存备用。s12，t-taspx3重组质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：s12步骤按照常规分子实验方法进行s13，菌落pcr鉴定挑取划线菌落进行菌落pcr的初步鉴定，pcr反应体系如表6所示：表6菌落pcr鉴定的体系物质用量2×taqmastermix10μltaspx3上游引物1μltaspx3上游引物1μlddh2oto20μl菌落pcr的pcr反应程序为：94℃变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后延伸步骤为72℃5min，于4℃保存。图3为转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后的阳性菌落鉴定结果。s14，提取质粒、质粒pcr鉴定及测序挑取划线菌阳性菌落进行摇菌，10mllb+10μlamp，37℃，220rpm过夜培养，然后按照质粒小量制备试剂盒质粒提取说明书提质粒，取3μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。之后进行质粒pcr鉴定，pcr体系如下：2×taqmastermix10μl，taspx3上游引物1μl，taspx3上游引物1μl，质粒1μl，ddh2o补足20μl。质粒pcr的pcr反应程序为：94℃变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后延伸步骤为72℃5min，最后于4℃保存。同时送公司测序。重组质粒t-taspx3的pcr鉴定如图4所示，图4为重组质粒t-taspx3的pcr验证电泳结果。结果显示，以重组质粒t-taspx3为模板可以扩增得到taspx3的产物且条带清楚单一，之后测序结果也证明该产物与taspx3的序列一样，所以可以用于下一步实验。s2，重组表达载体t-p的构建选取测序正确的重组质粒t-taspx3，对重组质粒t-taspx3和p1300-gfp载体进行扩大培养，37℃，220rpm，过夜培养，后进行质粒提取，分别得到重组质粒t-taspx3和p1300-gfp质粒。利用xbai和sali分别对重组质粒t-taspx3和p1300-gfp载体进行双酶切，分别得到重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物；利用t4dna连接酶对重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物进行连接，重组表达载体t-p；具体构建步骤如下：(1)利用xbai和sali分别对重组质粒t-taspx3和p1300-gfp载体进行双酶切，双酶切步骤如下：a.用xbai对质粒进行酶切，重组质粒t-taspx3的酶切体系如表7所示。表7重组质粒t-taspx3的酶切体系物质用量10×quickcutbuffer5μlquickcutxbai1.5μl重组质粒t-taspx330μlddh2oupto50μl酶切条件37℃，3h，酶切结束后纯化：酶切体系补足到100μl，加入1/10体积的naac(3m，ph-5.2)，加入二倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h，4℃，12000rpm离心10min，取上清晾干，加入35μl的ddh2o，得到xbai酶切产物。b.用sali对质粒继续酶切，体系如表8所示：表8sali的酶切体系酶切条件37℃，5h，酶切结束后进行电泳检测和割胶回收，得到重组质粒t-taspx3双酶切产物。p1300-gfp载体双酶切产物(10000bp左右)的制备与重组质粒t-taspx3双酶切产物(780bp左右)的制备过程相同，区别在于将重组质粒t-taspx3更换为p1300-gfp载体。重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物的电泳图如图5所示。利用t4dna连接酶对经过双酶切回收的重组质粒t-taspx3双酶切产物和p1300-gfp载体双酶切产物进行连接，连接体系如表9所示：表9连接体系物质用量5×t4dnaligasebuffer4μlt4dnaligase1μl酶切回收目的片段12μl酶切回收gfp表达载体3μl使用金属水浴锅控温16℃连接，24h后连接反应完成，得到重组表达载体t-p。连接产物转入到大肠杆菌dh5α感受态细胞进行转化。(2)重组表达载体t-p菌落pcr、质粒pcr鉴定、酶切验证连接后的产物经菌落pcr和质粒pcr鉴定，提取大肠杆菌dh5α感受态细胞中重组表达载体t-p，进行pcr，方法同s13、s14。同时进行双酶切鉴定，图6为重组表达载体t-p的酶切鉴定结果及质粒pcr鉴定结果。然后将重组载体t-p的单克隆接种到含有kan的lb液体培养基中摇菌，37℃，220rpm培养过夜，提取质粒，得到重组载体t-p备用。s3，农杆菌侵染拟南芥s31，种植野生型拟南芥按常规方法种植野生型拟南芥，备用。s32，制备农杆菌感受态细胞按常规方法制备农杆菌gv3101感受态细胞，置于-80℃冰箱保存备用。s33，用重组表达载体t-p转化农杆菌感受态细胞①取农杆菌感受态细胞置于冰上，加入2μl重组表达载体t-p，混匀放在液氮中速冻，然后放在冰上冰浴。②42℃热激90s，加入800μl无抗生素的lb液体培养基，28℃，160rpm培养3h。③5000r/min离心4min，吸取700μl上清，剩余部分混匀，涂在含有rif和kan的lb平板上，28℃培养。④随机挑选单菌落进行划线生长，28℃培养。⑤对阳性菌落进行pcr鉴定，挑取得到阳性克隆的转化农杆菌。s34，采用花絮侵染法，将挑取得到阳性克隆的转化农杆菌侵染拟南芥①将含有阳性克隆的转化农杆菌接种于10ml含有利福平及卡那霉素的lb液体培养液中，28℃，180rpm震荡培养至od600＝0.6左右。②5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。③用200mlms盐溶液(1/2ms，5％蔗糖，200μl/lsilwetl-77，ph5.8)悬浮菌体。④将提前一天浇透水的拟南芥花序浸入上述悬浮液30s后，套上保鲜袋置于黑暗中保湿1天后，放到光照培养架上正常培养至收种。⑤挑取阳性克隆的转化农杆菌侵染植物体后，经过3代自交，筛选出含有taspx3基因的植物体，作为能有效克隆小麦taspx3基因的转基因植物体，筛选步骤如下：a.抗生素筛选：收取成熟的t1代种子并在相应的潮霉素抗性ms培养基上筛选转基因植株；图7为转基因植株的抗生素筛选图；在含有潮霉素的ms培养基上不是转基因的种子都不发芽，只有转基因的种子才能正常生长之后把这些发芽的幼苗进行培养，经逐代的分子鉴定与自交纯合，得到t3代纯合的转基因植株。b.转基因拟南芥分子水平上的检测：将上述筛选出来的转基因植株移到营养土中培养，培养14天后取叶片提取rna，进行反转录合成cdna，之后进行pcr鉴定，所用引物为设计的taspx3特异性分子检测序列引物(表10)，鉴定成功的转基因植株进行单株收种，再逐代进行筛选。图8为转基因植株的分子检测结果。表10taspx3特异性分子检测序列引物为了验证本发明方法的可行性，我们参照实施例1的方法制备了t3代转基因拟南芥幼苗，并研究了磷胁迫对转基因拟南芥幼苗期形态的影响，如下：1、ms培养基中转基因拟南芥的培养1.1在ms培养基缺磷、低磷及高磷条件下培养t3代的转基因拟南芥与野生型拟南芥，观察鉴别taspx3基因的功能。首先拟南芥种子在1/2ms培养基上萌发，配方见表11，5天之后移苗，分别进行缺磷、低磷(5μm)、高磷(500μm)处理，配方见表11、表12和表13。表111/2ms培养基配方(1l)物质用量ms粉2.165gmes0.43g蔗糖20g琼脂10g表12常用营养元素100×母液配方100×母液kno3190(g/l)100×母液nh4no3165(g/l)100×母液kh2po417(g/l)100×母液k2so410.88(g/l)表13不同磷浓度的1/2ms培养基配方(1l)1.2转基因拟南芥在幼苗期不同磷条件下的生长状况在不同磷条件下的ms培养基上生长14天后进行观察，分别取根和地上部分别液氮速冻，-80℃保存。结果如图9所示，图9为转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下幼苗期的生长状况，其中图9a为缺磷处理结果、图9b为低磷(5μm)处理结果、图9c为高磷(500μm)处理结果，其中，t3-2表示转基因拟南芥，wt表示野生型拟南芥。幼苗期转基因与野生型拟南芥在不同磷条件下的生长状况显示：在缺磷、低磷条件下转基因拟南芥与野生型相比，地上部仍保持鲜绿，而野生型则是墨绿色；野生型的根部侧根较转基因的多，长度差别不大。但是在高磷条件下转基因与野生型几乎没有差异。1.3转基因拟南芥中taspx3基因的qrt-pcr检测转基因拟南芥与野生型拟南芥在ms培养基里培养14天的根和地上部rna的提取，反转录成cdna，后续用于荧光定量。并用拟南芥actin2引物检测cdna的完整性，引物序列见表14。琼脂糖凝胶电泳结果显示，在108bp左右有一条清晰的条带，证明cdna完整性较好，可以用于下一步实验。表14拟南芥看家基因actin2的引物序列荧光定量检测taspx3基因的相对表达量。所用试剂盒为tiageng公司的quantifastsybrgreenpcr试剂盒，按说明书进行qrt-pcr扩增，所用引物为表10的引物序列。每个混合样品重复3次，计算各个基因的相对表达量，计算公式为：目的基因＝2-δδct。图10为14天ms中的拟南芥根部taspx3基因的相对表达量，图11为14天ms中的拟南芥地上部taspx3基因的相对表达量，不同磷条件下同时培养过表达拟南芥和野生型拟南芥，14天后小麦taspx3的荧光定量结果显示：野生型中检测不到taspx3的表达；而在过表达植株中，缺磷、低磷培养下，taspx3的表达量与高磷条件下相比明显上升，说明taspx3可能在小麦中是低磷诱导的基因。2磷胁迫对转基因拟南芥成株期形态的影响2.1不同磷条件下转基因拟南芥的水培选用t3代的拟南芥在不同磷条件下水培，观察鉴别taspx3基因的功能。首先转基因拟南芥在正常磷条件的ms培养基上生长，直至四叶期开始移苗，在缺磷、低磷(5μm)、高磷(500μm)条件下进行水培，水培拟南芥配方见表15。表15水培拟南芥营养液配方2.2转基因拟南芥在成株期不同磷条件下的生长状况在不同磷条件下水培生长14天后进行观察，分别取根和地上部分别液氮速冻，-80℃保存。图12为转基因拟南芥与野生型拟南芥在不同磷条件下成株期的生长状况，其中图12a是转基因拟南芥t3-7的植株生长结果，图12b是野生型拟南芥的植株生长结果。水培14天后，过表达拟南芥与野生型拟南芥在成株期生长过程中具有较大差异，在拟南芥成株期的研究中，低磷、高磷条件下转基因植株地上部几乎都抽穗、开花，而野生型大部分无此特征。在缺磷条件下，转基因与野生型植株都抽穗，但是转基因植株的长势较野生型更好，这表明过表达taspx3可以促进拟南芥缺磷胁迫下的生长，而在高磷和低磷条件下促进生物量效应不明显，但均促使花期提前。2.3转基因拟南芥中taspx3基因的qrt-pcr检测(1)转基因拟南芥与野生型拟南芥14天根与地上部rna的提取，反转录成cdna，用看家基因actin2检测cdna的完整性。荧光定量检测taspx3基因的相对表达量。图13为水培生长14天后的拟南芥根部taspx3基因的相对表达量，图14为水培生长14天后的拟南芥地上部taspx3基因的相对表达量，不同磷条件下同时培养过表达拟南芥和野生型拟南芥，14天后小麦taspx3的荧光定量结果显示：野生型wt中没有检测到taspx3基因的表达，而转基因拟南芥t3-2的表达量在不同磷条件下表达量存在一定的差异，taspx3基因在缺磷、低磷条件下的表达量较高磷条件下的表达量高。需要说明的是，当本发明给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<110>河南农业大学<120>普通小麦基因taspx3编码序列的克隆及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列<400>1gctctagaatgaagtttgggaagaggctcaag32<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2gggtcgactcaaaccacccggacaatacc29<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctcgtccgactcgtctccg20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4cgccttcaccgtctcccttac21<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<400>5attcagatgcccagaagtcttgtt24<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6tttgctcatacggtcagcgata22当前第1页12