一种石斑鱼重组神经肽Y的融合表达载体、制备方法以及其本身与流程

本发明涉及具有促进动物摄食及生长发育的活性多肽领域，具体涉及一种重组神经肽y的制备方法。

背景技术

我国海水养殖产业不断发展，其中石斑鱼养殖规模在近5年增长迅速，2016年产量达10.83万吨[农业部渔业渔政管理局.2017中国渔业统计年鉴.中国农业出版社]，成为南方重要的海水养殖鱼类，从曾经的名贵海鲜变成如今普通家庭也能消费的水产品，这主要得益于苗种繁育技术的不断突破，学术界与养殖产业界对此贡献巨大。但养殖产业的健康持续发展尚需进一步改进养殖技术，促进养殖鱼类的摄食、生长、抗病力以进一步提高养殖效益。但目前石斑鱼人工养殖中还没有一种能够有效促进其生长的基因工程产品饵料添加剂。

神经肽y(neuropeptidey，npy)是1982年tatemoto首次从家猪大脑中分离出的一种多肽，该多肽的天然构象为发卡型，在肽链中存在许多酪氨酸，因此它也被称为神经肽酪氨酸[tatemotoketal.neuropeptidey:anovalbrainpeptidewithstructuralsimilaritiestopeptideyyandpancreaticpolypeptide.nature,1982,296(5858):659-660]。npy基因编码由约98个氨基酸组成的npy前体，npy前体储存于神经纤维的分泌囊泡中，经酶解释放为有活性的npy成熟肽[施广璞等.神经肽y的基因及其表达调控.国外医学:分子生物学分册,1994,16(3):139-142]。npy是一种内源性促食因子，属于胰多肽家族成员，与两种消化系统内分泌肽(胰腺肽和肽yy)同源，在不同种类的鱼类中同源性也较高。npy具有2个相互逆平行的螺旋结构，螺旋区都具有两性电离特点，2个螺旋之间借疏水作用维持其稳定的三级结构。当npy的三级结构发生改变时，其生物活性即减弱甚至丧失。npy广泛表达与中枢及外周神经系统中，同时也存在与心脏、肝脏、骨骼肌、肾上腺等器官中。大量研究表明，哺乳动物npy能够刺激摄食，改变机体代谢，激活脂肪组织的脂肪酶，促进脂肪的合成与储存。在鱼类，npy除了同样能够促进摄食，并能够促进生长发育，调节繁殖等生理过程，还能够促进鱼体免疫机能[zukowskaz,etal.neuropeptidey:anewmediatorlinkingsympatheticnerves,bloodvesselsandimmunesystem.canadianjournalofphysiologyandpharmacology,2003,81(2):89-94.]，因此npy在水产养殖上具有较大的应用潜力。

npy的获取可通过天然提取、化学合成和基因工程技术重组表达3种途径。前两种得率低、价格贵，无法满足大规模生产饲料添加剂的需求，基因工程技术重组表达npy是必须探索之路。目前已有基因工程重组表达哺乳动物和鱼类npy的报道，但存在一系列问题，主要是：(1)目的肽npy均带有标签或其他额外氨基酸，如融合表达的组氨酸标签、起分子伴侣作用的融合蛋白切除不能刚好在目的肽和融合蛋白之间切除以使目的肽不带任何额外氨基酸；(2)容易形成包涵体，而不能够获得稳定的可溶性表达；(3)酵母表达系统的表达量较低，且存在分泌到胞外过程中信号肽序列不能有效切除或目的肽被降解等问题。这些问题都都影响了npy的活性、制备过程的稳定性及大规模制备等。

技术实现要素：

本发明的目的是根据现有技术的不足，提供一种神经肽ecnpy(石斑鱼npy)重组融合表达载体，ecnpy表达方法，以及后续的纯化、酶切等工艺。

根据本发明的一方面，构建ecnpy的最优重组表达载体。

现有技术已构建许多npy表达载体，但都存在一些缺陷。

中国专利cn200910214231.1构建了基于酵母表达载体ppiczαa的，表达罗非鱼神经肽y的重组表达载体(见附图8)。其所表达npy的n端有信号肽，分泌至胞外是切割不一定能够非常准确切割，存在两种可能，一是残留氨基酸于npy上，二是过多切割使npy的n端丢失一两个氨基酸；另外，其所表达的npy的c带有组氨酸标签。

余长宁，黄飞，文鑫，梁小龙，吴海武，陈国华，骆剑.波纹唇鱼神经肽y基因的克隆及原核表达.海南大学学报(自然科学版),2014,32(3):260-269.该论文构建了基于大肠杆菌表达载体pet-32a的表达罗非鱼神经肽y的重组表达载体(见附图9)，所表达npy带有融合蛋白硫氧还蛋白(thioredoxin)和组氨酸标签。

carpioy,acostaj,moralesa,herreraf,gonzálezlj,estradamp.cloning,expressionandgrowthpromotingactionofredtilapia(oreochromissp.)neuropeptidey.peptides.2006,27(4):710-718.构建了基于大肠杆菌表达载体ptyb1的表达罗非鱼神经肽y的重组融合表达载体。所表达npy的n端融合了intein，在intein的n端融合了几丁质结合区(chitinbindingdomain,cbd)作为亲和层析标签(见附图10)。所表达的融合蛋白若处于有巯基(如二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(mch)等)的溶液中，内含肽与目的肽间的肽键断裂(即intein的自剪切效应)，从而释放出npy，但是该自剪切效率不高，如加dtt经3天反应，断裂比例不到80％。

而本申请利用championpetsumoproteinexpressionsystem，将表达石斑鱼npy的cdna克隆连接至该表达系统的线性化质粒中，构建表达载体，建立重组表达石斑鱼npy的表达系统(见附图11)。序列来源于genbank带石斑鱼npymrna序列，登录号为ay626561(epinepheluscoioidesneuropeptideyprecursor,mrna,completecds)，编码区序列为：

其中，有下划线加黑的部分为表达npy成熟肽的mrna序列，推导的斜带石斑鱼npy成熟肽序列为

ypvkpenpgddapaedlakyysalrhyinlitrqry(seqidno.2)。在pcr扩增该成熟肽mrna序列时，下游引物加拟表达宿主菌大肠杆菌(e.colibl21(de3))的终止密码子taa。

即在反向引物5'端加aat，使得扩增的互补链3'端形成终止密码子(taa)，同时，利用taq酶自身特性，即在扩增出的dna3'端自行加一个腺嘌呤剪辑(a)，该dna片段刚好插入pet-sumo融合表达载体，该载体线性化的断裂位置为编码sumo的最后一个碱基(t)，扩增出的ecnpy的dna3'端多余的a刚好与编码sumo的最后氨基酸甘氨酸的密码子第三位碱基t配对。表达出融合蛋白sumo-npy，在sumo的n端带组氨酸标签用于亲和层析纯化融合蛋白，而sumo蛋白酶的切割位点刚好在sumo与目的肽npy的连接处(见附图11)，因此本发明获得的融合蛋白经sumo蛋白酶切割后，可以获得无额外氨基酸的npy。

构建成功的插入序列如下所示，其中下划线表示表达npy的基因序列，着重号表示为载体的基因序列：

根据本发明的另一方面，优化表达条件，避免表达产物形成包涵体，从而获得大量稳定的重组npy可溶性表达。可溶性表达量最高、包涵体形成最少的条件是25℃条件下培养诱导表达，温度高于25℃时，包涵体形成增多，低于25℃时，则总表达量下降。

根据本发明的再一个方面，优化酶切条件，获得高纯度、强活性的石斑鱼npy。融合蛋白酶切释放出目的肽的最佳条件是“将纯化收集的含500mmol/l咪唑的融合蛋白(sumo-ecnpy)液稀释一倍，4℃酶切20h，再透析”，从而获得高纯度的无任何额外氨基酸的重组石斑鱼npy(r-ecnpy)。

同时，本发明验证了所获得的r-ecnpy的生物学活性，证明序列来源于石斑鱼的r-ecnpy能够在亲缘关系较远的异种鱼类鲤鱼中发挥生物学效应。

有益效果：本发明首次构建表达斜带石斑鱼ecnpy的基于pet-sumo的融合表达载体，并优化出实现高效的可溶性表达和对融合蛋白酶切释放出目的肽的最佳条件，从而获得高纯度的无任何额外氨基酸的重组石斑鱼npy(r-ecnpy)，并证明r-ecnpy具有较强的生物学活性，能够在异种鱼类中发挥生物学效应，显示了广泛的应用价值。

附图说明

图1表达载体pet-sumo-ecnpy的测序峰图

下划线部分表示npy成熟肽序列，*表示终止密码子

图2不同条件下sumo-ecnpy表达的sds-page电泳图

泳道：1、proteinmarker；2、37℃诱导表达的上清；3、37℃诱导表达的沉淀；4、30℃诱导表达的上清；5、30℃诱导表达的沉淀；6、25℃诱导表达的上清；7、25℃诱导表达的沉淀；8、16℃培养诱导表达的上清；9、16℃培养诱导表达的沉淀

图3sumo-ecnpy经过sumo蛋白酶酶切后小分子蛋白sds-page电泳图

泳道：mproteinmarker；1、未纯化总蛋白；2、先透析-再30℃酶切5h；3、先透析-再4℃酶切20h；4、先1:1稀释-再4℃酶切20h；5、先1:1稀释-再30℃酶切5h

图4亲和层析纯化后获得的重组石斑鱼npy(r-ecnpy)电泳图泳道：m、proteinmarker；1、2、3表示3次平行纯化后的结果

图5重组石斑鱼npy(r-ecnpy)质谱(ls-ms/ms)的二级质谱峰图注：intensity为强度

图6重组石斑鱼npy对离体培养的鲤鱼下丘脑-垂体组织gh基因表达的影响

注：blank未添加刺激物；1、2、3分别添加1nmol/l、10nmol/l及100nmol/l的化学合成石斑鱼npy(s-ecnpy)；4、5、6分别添加1nmol/l、10nmol/l及100nmol/l的重组表达石斑鱼npy(r-ecnpy)；relativeexpression:相对表达量

图7重组石斑鱼npy对离体培养的鲤鱼下丘脑-垂体组织pss-ⅱ(pss-2)基因表达的影响

注：blank未添加刺激物；1、2、3分别添加1nmol/l、10nmol/l及100nmol/l的化学合成石斑鱼npy(s-ecnpy)；4、5、6分别添加1nmol/l、10nmol/l及100nmol/l的重组表达石斑鱼npy(r-ecnpy)；relativeexpression:相对表达量

图8基于载体ppiczαa的npy重组表达载体

图9基于载体pet-32a的npy重组表达载体

图10基于载体ptyb1的npy重组表达载体

图11基于载体petsumo的npy重组表达载体

具体实施方式

一、试验材料和设备

1、菌体来源

大肠杆菌(e.colitop10,e.colibl21(de3))购自宝生物工程(大连)有限公司。

2、实验鱼来源

斜带石斑鱼(epinpheluscoioides)购自广东省深圳市南山市场。

3、试剂

rnaisoplus试剂盒、primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒、takaraexpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒和质粒提取试剂盒、dl-2000dnamarker、dl-5000dnamarker均购自宝生物工程(大连)有限公司。重组蛋白表达系统championpetsumoproteinexpressionsystem(k30001)及sumoprotease、培养基m199购自invitrogenlifetechnologies公司(美国)。胎牛血清fbs购于gibco公司(美国)。抗生素penicillin-streptomycin购于生工生物工程(上海)股份有限公司。sybrgold染液购自bio-rad公司；proteinmarker(10-180kda)购于genstar公司(北京)，spectramulticolorlowrangeprotein(1.7-42kda)购于thermoscientific公司(美国)。nh4hco3/can、质谱级胰酶、乙腈购于宝生物工程(大连)有限公司。ni离子琼脂糖(6fastflow)购于gehealthcare(原安玛西亚(中国)有限公司)。

depc水、iptg、卡那霉素、nacl、蛋白胨、细菌培养用酵母提取物、琼脂粉、t-emed、aps过硫酸铵、37.5:1的40％聚丙烯酰胺、29:1的40％聚丙烯酰胺、19:1的40％聚丙烯酰胺、tris及sds等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

4、仪器设备

表1.仪器设备

【实施例1】石斑鱼npy成熟肽基因的获得

1.1引物的设计与合成

根据斜带石斑鱼神npy的mrna序列(genbank:ay626561.1)，其成熟肽序列为dna序列：

tacccggtgaaaccggagaaccctggggatgacgccccggcggaggacctggccaagtactactcagccctgagacactacattaacctcatcacaaggcagaggtat(seqidno.4)，氨基酸序列：ypvkpenpgddapaedlakyysalrhyinlitrqry(seqidno.2)。依该序列两端设计引物，分别命名为ecnpy-f和ecnpy-r，反向引物5’末尾加入了tta引入终止密码子，另外设计sumo-f和sumo-r两对表达载体pet-sumo的引物，用于随后扩增测序验证插入基因的序列正确性。具体引物序列如下：

表2.引物序列表

所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2ecnpy基因扩增

1)斜带石斑鱼脑总rna的提取及cdna合成

斜带石斑鱼脑组织约50mg用液氮研磨成粉末加到1.5ml离心管中，采用rnaisoplus试剂盒提取样品总rna，具体操作依试剂盒说明书进行，离心获得的rna沉淀用30μl无rnase的水溶解，取总rna3μl用于1％的琼脂糖凝胶电泳，另取3μl用核酸蛋白测量仪测定rna的纯度和浓度，然后使用primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒，将rna反转录成cdna，具体操作依该反转录试剂盒说明书进行。

2)pcr扩增ecnpy基因

使用ex-taq酶扩增ecnpy基因，pcr反应条件为94℃5min，94℃30sec，(94℃30sec，53℃30sec，72℃1min，35cylces)，72℃10min。将pcr产物以2％的琼脂糖凝胶电泳，获得预期目的条带，并使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对目的条带进行切胶回收。回收的片段再一次使用2％琼脂糖凝胶电泳，检验有无出现目的条带，再将回收产物测浓度后放-20℃保存，备后续实验使用。

【实施例2】表达载体pet-sumo-ecnpy的构建

2.1目的基因ecnpy与pet-sumo载体的连接

将pcr扩增回收的目的基因ecnpy与championpetsumoproteinexpressionsystem表达试剂盒提供的载体pet-sumo(seqidno.15)连接，按照下表加至pcr管中混合，在pcr仪中于16℃连接4h，然后放入冰箱4℃过夜获得连接产物。

表3.目的基因与pet-sumo连接的反应体系

2.2质粒转化及测序验证

从-80℃冰箱取出购买的e.colibl21感受态细胞，置于冰上缓慢解冻，取5μl目的基因ecnpy与pet-sumo载体连接的产物，加入至50μl感受态细胞中，用小枪轻轻混匀，冰上静置30min后，转至42℃恒温水浴锅中，热激45s，热激后再次置于冰上5min，向离心管中加入200μllb液体培养基，吹打混匀后置于摇床中，37℃，200rpm，1h培养复苏，然后取其中100ul培养液到lb平板上(含抗生素卡那霉素，kana)均匀涂布，平板在37℃培养箱过夜倒置培养。挑取单菌落过夜扩大培养，第二天提取质粒，以质粒为模板、sumo-f和sumo-r为引物进行pcr，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，将扩增出预期大小片段的质粒送至深圳华大基因公司测序，以确定目的片段序列及连接方向是否正确。

结果如图1所示，表明成功构建表达斜带石斑鱼ecnpy的基于pet-sumo的融合表达载体。

【实施例3】ecnpy的重组表达

3.1iptg诱导ecnpy菌株表达

1)将测序正确的ecnpy菌株按1:1000的比例接种于10ml的lb液体培养基中(含kana)，设37℃、32℃、25℃及16℃4个温度梯度，分别于设置温度恒温振荡(200rpm)培养过夜。

2)温度梯度诱导表达：设37℃、32℃、25℃及16℃4个温度梯度，取过夜培养的菌液按1:100的比例分别接种于1l的lb液体培养基中(含kana)，分别于设置温度恒温振荡(250rpm)培养，待菌液od600≈0.6时，加入iptg(1mmol/l)，诱导6h。

3)收集菌液：将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min弃上清，用lysisbuffer(200mmnacl、50mmtris，ph8.0-8.1)重悬菌液(10mlbuffer/g菌)。

4)均质机破碎：使用均质机破碎lysisbuffer重悬的菌液，每瓶菌液循环破碎3次；

5)离心：破碎后于10000rpm，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀。

3.2蛋白表达检测

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)检测蛋白表达情况。sds-page蛋白胶配方如下表所示。

表4.sds-page蛋白胶配方

取蛋白样品各25μl，加入5μl等体积的5×的蛋白加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，加样，60mv电泳至样品进入分离胶，再调至80mv，待溴酚兰移动至凝胶下边界约2cm时停止电泳，将分离胶移入考马斯染色溶液中。在室温下放在摇床上平缓摇动，染色30min，然后将胶置于适量脱色液中，在水平摇床上平缓摇动2-4h，其间应视情况换脱色液3-4次，直到条带清晰。将已脱色的蛋白胶置于凝胶成像仪拍照保存，观察结果并进行分析。

结果如图2所示，对于采用大肠杆菌重组表达外源蛋白，实现高效的可溶性表达(表达产物存在于上清中)对于目的蛋白的后续纯化及活性保持尤为重要。不同培养温度下的诱导表达结果表明，温度过高可溶性表达量下降，温度过低则总表达量下降。25℃为最佳培养温度，在该温度培养诱导，上清中目的蛋白含量最高其占总目的蛋白的绝大部分，随着温度的升高，目的蛋白以包涵体形式表达的量急剧升高，而培养温度下降为16℃时，蛋白的整体表达量下降。

【实施例4】融合蛋白sumo-ecnpy的纯化、酶切

4.1亲和层析纯化融合蛋白sumo-ecnpy

利用sumo自带的组氨酸标签(6×his)，采用镍离子琼脂糖亲和介质(ni-ida)亲和层系统对融合蛋白sumo-ecnpy进行纯化。具体步骤如下：

1)将亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/lnaoh溶液活化柱子，流速为5ml/min，柱床体积为20m；

2)5倍柱体积的ddh2o洗去naoh溶液，此时亲和层析仪cond％(即电导率)＝0；5倍柱体积的niso4过柱子，使亲和介质吸附ni²⁺至cond％平稳；ddh2o清洗去未结合ni²⁺，洗至cond％＝0；balancebuffer(20mmol/lna2hpo4-nah2po4,ph7.4,500mmol/lnacl,5mmol/l咪唑)平衡柱子，至cond％平稳，此时流速改为3ml/min；

3)将总蛋白溶液上样，控制其流速为1ml/min，用5倍柱体积的balancebuffer清洗，至280吸收值稳定，再用100mmol/l咪唑溶液清洗去除非特异性结合杂蛋白；

4)用500mmol/l咪唑溶液洗脱，收集样品峰对应洗脱液，sds-page分析。

4.2融合蛋白sumo-ecnpy的酶切

使用championpetsumoproteinexpressionsystem表达试剂盒推荐使用的蛋白酶sumoprotease(1u/μl)，酶活单位oneunitofsumoproteasecleaves≥85％of2μgcontrolsubstratein1hat30℃。由于含融合蛋白的洗脱液中含有高达500mmol/l的咪唑，需要降低或去除咪唑后进行切割实验，温度对酶活力及酶的稳定性也有影响，最优酶切条件采用以下4种方法探索。

方法一：使用balancebuffer将含融合蛋白的洗脱液过夜透析，然后测定蛋白浓度，加入sumoprotease(终浓度200u/mg蛋白)，30℃酶切5h。

方法二：使用balancebuffer将含融合蛋白的洗脱液过夜透析，然后测定蛋白浓度，加入sumoprotease(终浓度200u/mg蛋白)，4℃酶切20h。

方法三：按照1:1将含融合蛋白的洗脱液加入balancebuffer，然后测定蛋白浓度，加入sumoprotease(终浓度200u/mg蛋白)，30℃酶切5h。

方法四：按照1:1将含融合蛋白的洗脱液加入balancebuffer，然后测定蛋白浓度，加入sumoprotease(终浓度200u/mg蛋白)，4℃酶切20h。

将酶切后的样品采用sds-page检测酶切效果，结果如图3所示。

发现最佳的酶切条件是先将亲和层析收集的蛋白液(含500mmol/l咪唑)用balancebuffer对半稀释，在4℃酶切20h，再透析(见图3第3泳道)；而30℃酶切效果不好，先将咪唑透析后再酶切，效果也会变差(见图3第2泳道)。

【实施例5】ecnpy的纯化及质谱鉴定

5.1酶切后ecnpy的纯化

1)镍离子琼脂糖亲和柱的活化、平衡等按照“实施例4”的方法进行；

2)上样：将按实施例4酶切后蛋白溶液小心上柱，控制其流速为1ml/min，收集样品流出液。

5.2小分子蛋白sds-page分析纯度

采用小分子蛋白凝胶tris-tricinesds-page检测目的蛋白纯度。

表5.tris-tricinepage蛋白胶配方

上样后的电泳条件，60mv电泳至样品进入分离胶，再调至200mv，待溴酚兰移动至凝胶下边界约2cm时停止电泳。胶的染色、脱色、观测等步骤与“实施例3”的sds-page方法相同。

结果表明，通过酶切后，再用亲和层析去除sumo，能够获得高纯度的目的肽(见图4，除目的肽之外未发现任何其他杂蛋白)。

5.3纯化ecnpy的质谱鉴定

将纯化的目的蛋白经脱盐柱脱盐后，送深圳大学生命与海洋科学学院质谱室采用液相色谱质谱联用仪(lc-ms/ms)进行鉴定，结果如图5所示。

对实施例5.2获得的目的肽采用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析，结果表明与ecnpy序列100％一致。对于多肽的重组表达制备，获得无任何额外标签的高纯度目的肽是，获得活性多肽的重要保证。质谱结果表明本发明制备ecnpy符合这一技术指标。

【实施例6】ecnpy的活性鉴定

6.1化学合成ecnpy

化学合成斜带石斑鱼ecnpy(syntheticorange-spottedgrouper(epinepheluscoioides)npy,s-ecnpy)用于活性鉴定对照试验。该多肽委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用固相化学合成法合成，反相高效液相色谱纯化(纯度>95％)、电喷射质谱(electrospraymassspectroscopy,es-ms)鉴定。

6.2下丘脑-垂体组织碎片的离体培养

将鲤鱼(cyprinuscarpio)(购自广东省深圳市南山区桃园路人人乐超市，体重500～650g，共3尾)放置冰水中低温麻醉，待其不活跃时取出，对其体表喷洒酒精消毒，解剖取出下丘脑及垂体，置于m199(含fbs)培养基中，用培养基清洗两次后，用解剖刀切碎垂体及下丘脑，将下丘脑碎片及垂体碎片均匀分配到24孔培养板内混合，每孔加入1ml的m199(含fbs)培养液，置于co2培养箱中过夜培养，然后去除培养液，用m199(无fbs)培养液清洗两次待用。

6.3重组表达ecnpy(r-ecnpy)和化学合成ecnpy(s-ecnpy)的刺激实验

在“6.2下丘脑-垂体组织碎片的离体培养”中获得的离体培养组织的培养体系中分别加入浓度1nm、10nm和100nm的r-ecnpy或s-ecnpy，。空白对照组不添加任何蛋白液，每组设有3个实验重复。在培养箱中培养6h后收集下丘脑-垂体混合物。

6.4荧光定量pcr检测下丘脑-垂体组织碎片中gh和pss-ⅱ基因表达水平

采用trizol法提取“6.3重组表达ecnpy(r-ecnpy)和化学合成ecnpy(s-ecnpy)的刺激实验”收集的实验样品的总rna。采用【实施例1】中1.2部分的方法将rna反转录为cdna。采用荧光定量pcr(qpcr)检测下丘脑-垂体组织碎片中生长激素(growthhormone,gh)和生长抑素前体蛋白-2(preprosomatostatin，pss-ⅱ)基因表达水平，内参基因采用鲤鱼β-actin。qpcr所用试剂盒为premixextaq^tmii(tlirnasehplus)，依其说明书进行操作，采用2^-△△ct法计算目的基因相对表达量。具体引物信息如下表：

表6.荧光定量pcr引物

6.5统计学分析

采用spss19.0统计分析软件进行统计分析，得到的数值以平均数±标准差(m±sd)表示，采用单因素方差分析(one-wayanalysisofvariance)、duncan法多重比较显著性水平，检验经npy刺激后，下丘脑-垂体组织碎片中gh和pss-2基因表达量的变化，p<0.05表示有显著性差异。

结果如图6、7所示，重组表达的r-ecnpy能够显著刺激鲤鱼下丘脑/垂体的gh表达上调，同时能够抑制pss-ⅱ基因表达，刺激效应和抑制效应均比化学合成的s-ecnpy更强，因此一方面表明本发明获得的重组表达r-ecnpy具有比化学合成s-ecnpy具有更强的生物学活性，另一方面，证明序列来源于石斑鱼的r-ecnpy能够在鲤鱼中发挥生物学效应，显示了广泛的应用价值。

sequencelisting

<110>深圳大学

深圳市检验检疫科学研究院

<120>一种石斑鱼重组神经肽y的表达载体、制备方法以及其本身

<130>sz1137-18p121987

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<223>石斑鱼npy的编码区序列

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tgcctgggcgccctgacggagggatacccggtgaaaccggagaaccctggggatgacgcc120

ccggcggaggacctggccaagtactactcagccctgagacactacattaacctcatcaca180

aggcagaggtatgggaagaggtccagtcctgagattctggacacactggtctcagagctg240

ctgttgaaggaaagcacagacacgctcccacagtcaagatacgacccatcattgtggtga300

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<212>prt

<213>artificial

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<223>石斑鱼npy成熟肽序列

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tyrprovallysprogluasnproglyaspaspalaproalagluasp

151015

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35

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<213>artificial

<220>

<223>重组载体的编码区序列

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<223>石斑鱼npy成熟肽的核酸序列

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<223>引物ecnpy-f

<400>5

tacccggtgaaaccggagaacc22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物ecnpy-r

<400>6

ttaatacctctgccttgtgatg22

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物sumo-f

<400>7

agattcttgtacgacggtattag23

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物sumo-r

<400>8

tagttattgctcagcggtgg20

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qf-cpact

<400>9

gcaagcaggagtatgatgagtc22

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qr-cpact

<400>10

gccaatgttgtcgtttgaagt21

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qf-cpgh

<400>11

cggaaccgtctcaaacagc19

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qr-cpgh

<400>12

caaaaggcagcggcaag17

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qf-cppss2

<400>13

tcgaagtcgttgtagctcctg21

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物qr-cppss2

<400>14

agaccgcactttaactccaact22

<210>15

<211>5643

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>载体pet-sumo的序列

<400>15

caaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaa60

acaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgat120

ataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgta180

gaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcg240

gataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgg300

gcagcagccatcatcatcatcatcacggcagcggcctggtgccgcgcggcagcgctagca360

tgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctg420

agactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaaa480

agaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatgg540

actccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagatt600

tggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtagacaag660

cttaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttagtcgagcacca720

ccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgc780

tgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgagggg840

ttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggc900

gcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgcc960

ctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccc1020

cgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctc1080

gaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacg1140

gtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaact1200

ggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatt1260

tcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaa1320

atattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctattt1380

gtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaac1440

tcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttt1500

tgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggca1560

agatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttc1620

ccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggt1680

gagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgc1740

tcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcg1800

agacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccgg1860

cgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaat1920

acctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagta1980

cggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgacc2040

atctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggc2100

gcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcga2160

gcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaa2220

gacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagac2280

agttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga2340

ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg2400

cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc2460

aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttct2520

agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc2580

tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggtt2640

ggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg2700

cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct2760

atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag2820

ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag2880

tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg2940

gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg3000

gccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattac3060

cgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt3120

gagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtat3180

ttcacaccgcaatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccag3240

tatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacac3300

ccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtga3360

ccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggc3420

agctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcat3480

ccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcggg3540

ccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttc3600

tgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactg3660

atgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc3720

ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtag3780

gtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagg3840

gcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttg3900

ttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtg3960

attcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacagga4020

gcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccga4080

aacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaata4140

ccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatga4200

cccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtg4260

cggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctca4320

agggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgc4380

gctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc4440

aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagt4500

gagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcgg4560

tccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggata4620

taacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgc4680

agcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagc4740

atcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatg4800

gcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatattta4860

tgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcg4920

atttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgg4980

gagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaaca5040

ttagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatc5100

agcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccg5160

cttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatc5220

gccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagc5280

aacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgcc5340

atcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacg5400

cgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggt5460

ttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaag5520

gttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat5580

taggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgc5640

atg5643