本发明涉及化学分析检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针及制备方法与应用的方法。
背景技术
生物硫醇是许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞生命活动过程中具有重要作用。生物硫醇包括半胱氨酸(cysteine，cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)和谷胱甘肽(glutataione，gsh)等。半胱氨酸不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶和牛磺酸的前体，而且还使生物体硫铁络合物中硫配体的提供者，人体中缺少半胱氨酸会导致生长缓慢、毛发色素脱色、水肿、嗜睡、肝功能损伤、肌肉松弛、身体虚弱等症状，同时，半胱氨酸的浓度异常也可能会引起阿尔兹海默氏症、心血管疾病、癌症的发，具体包括细胞内氧化还原活性、异型生物质的代谢、以及细胞内信号转导和基因调控等。半胱氨酸和谷胱甘肽在生物体内含量的变化与许多疾病密切联系，并且在体内生物酶的作用下半胱氨酸和谷胱甘肽能相互转化，因此对半胱氨酸和谷胱甘肽的检测具有十分重要的意义。
溶酶体具单层膜，形状多种多样，是0.5微米到几个微米的泡状结构，内含许多水解酶，溶酶体在细胞中的功能，是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子，因此检测溶酶体内半胱氨酸和谷胱甘肽的浓度变化，对研究溶酶体中的半胱氨酸和谷胱甘肽的生理功能具有十分重要的科研价值。
目前，用于检测区分半胱氨酸和谷胱甘肽的探针大多不具备靶向溶酶体的功能，因此开发一种既对溶酶体具有靶向定位作用，同时又能识别半胱氨酸和谷胱甘肽的探针具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针及制备方法与应用。该荧光探针不仅能靶向溶酶体，而且能识别半胱氨酸和谷胱甘肽，且荧光探针的制备合成路线简单、反应条件温和，同时该荧光探针用于环境或生物样品中半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光检测和分析。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针，探针的结构为化学式(ⅰ)：
本发明还提供了一种上述识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
s1、以3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素和3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺为原料进行反应，得到中间体，中间体的结构为化学式(ⅱ)：
s2、以中间体与对硝基苯酚为原料进行反应，得到探针。
优选的是，以3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素和3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺为
原料进行反应得到中间体，具体过程包括：
a1、向3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素中加入无水二氯甲烷搅拌溶解，然后依次加入草酰氯、无水dmf，在氩气保护下室温反应2-2.5小时，除去溶剂，再加入无水二氯甲烷溶解，得到第一反应液，其中，3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素、草酰氯、无水dmf的用量比为1mmol：8-10mmol：3-5μl，3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素与每次使用无水二氯甲烷的用量比为1mmol：3-5ml；
a2、将3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺、无水三乙胺加入无水二氯甲烷搅拌溶解，得到第二反应液，其中，3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素与3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺、无水三乙胺、二氯甲烷的用量比为1mmol：0.5-1mmol：20-30mmol：3-5ml；
a3、在-10-0℃条件下，将第一反应液加入第二反应液中，并反应20-40min，经纯化得到淡黄色固体，淡黄色固体即为中间体。
优选的是，以中间体和对硝基苯酚为原料进行反应得到探针反应得到探针的具体过程为：
向中间体、对硝基苯酚中加入无水乙腈搅拌溶解，再加入三乙胺，在氩气保护下，回流搅拌1-1.5h，经纯化得到淡黄色固体，淡黄色固体即为探针，其中，中间体、对硝基苯酚、无水乙腈、三乙胺的用量比为1mmol：0.5-1mmol：5-7ml：0.5-1mmol。
本发明还提供了一种上述识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针的应用，该探针用于环境或生物样品中半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光检测和分析。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明不仅合成路线简单，而且反应条件温和；
第二、本发明所述的荧光探针与对半胱氨酸(cys)响应后荧光增强16.5倍，与谷胱甘肽(gsh)响应后荧光增强29.7倍，即对半胱氨酸(cys)和谷胱甘肽(gsh)表现出较高的灵敏度；
第三、本发明所述的荧光探针能够从多种氨基酸(cys、gsh、tyr、val、gly、ala、asp、arg、iso、lys、met、his、phe、thr、ser、pro、glu)以及一些常见物质(kcl,cacl2，mgcl2，zncl2，nacl，h2s，h2o2)中识别区分半胱氨酸和谷胱甘肽，同时探针能够靶向溶酶体半胱氨酸、谷胱甘肽进行监测或者细胞成像的荧光探针。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述其中一个实施例的中间体的氢谱谱图；
图2为本发明所述其中一个实施例的中间体的碳谱谱图；
图3为本发明所述其中一个实施例的中间体的质谱谱图；
图4为本发明所述其中一个实施例的荧光探针的氢谱谱图；
图5为本发明所述其中一个实施例的荧光探针的碳谱谱图；
图6为本发明所述其中一个实施例的荧光探针的质谱谱图；
图7为本发明所述其中一个实施例的荧光探针对半胱氨酸(cys)的选择性谱图，纵坐标f490表示在发射波长为485nm时所测的荧光强度；
图8为本发明所述其中一个实施例的荧光探针对谷胱甘肽(gsh)的选择性谱图，纵坐标f550表示在发射波长为550nm时所测的荧光强度；
图9为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与不同浓度半胱氨酸(cys)作用后的荧光光谱谱图，横坐标wavelength(nm)表示波长(纳米)，纵坐标fl.intensity(a.u)表示荧光强度；
图10为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与半胱氨酸(cys)浓度的线性关系，横坐标cys(μm)表示半胱氨酸的浓度，纵坐标f485表示在发射波长为485nm时所测的荧光强度；
图11为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与不同浓度谷胱甘肽(gsh)作用后的荧光光谱谱图，横坐标wavelength(nm)表示波长(纳米)，纵坐标fl.intensity(a.u)表示荧光强度；
图12为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与谷胱甘肽(gsh)浓度的线性关系，横坐标ghs(μm)表示谷胱甘肽的浓度，纵坐标f550表示在发射波长为550nm时所测的荧光强度；
图13为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与半胱氨酸(cys)响应过程中荧光强度随时间的变化曲线，横坐标wavelength(nm)表示波长(纳米)，纵坐标fl.intensity(a.u)表示荧光强度；
图14为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与半胱氨酸(cys)响应过程中荧光强度最大值处490nm随时间的变化，横坐标time(min)表示时间(分钟)，纵坐标f485表示在发射波长为485nm时所测的荧光强度；
图15为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与谷胱甘肽(gsh)响应过程中荧光强度随时间的变化曲线，横坐标wavelength(nm)表示波长(纳米)，纵坐标fl.intensity(a.u)表示荧光强度；
图16为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在pbs缓冲溶液(10mm，vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，与谷胱甘肽(gsh)响应过程中荧光强度最大值处550nm随时间的变化，横坐标time(min)表示时间(分钟)，纵坐标f550表示在发射波长为550nm时所测的荧光强度；
图17为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在不同ph值缓冲溶液中，与半胱氨酸(cys)作用前后的荧光强度，纵坐标f485表示在发射波长为485nm时所测的荧光强度；
图18为本发明所述其中一个实施例的荧光探针(1.0×10-5mol/l)在不同ph值缓冲溶液中，与谷胱甘肽(gsh)作用前后的荧光强度，纵坐标f550表示在发射波长为550nm时所测的荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明所述的识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针的制备路线如下所示：
本发明的荧光探针与半胱氨酸作用后的荧光发射峰在485nm，与谷胱甘肽作用后的荧光发射峰在550nm。
本发明所述的识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针的响应机理为：荧光探针分子本身没有荧光，而荧光探针分子分别与半胱氨酸(cys)和谷胱甘肽(gsh)作用后，荧光探针中的芳香醚键部分从探针分子上离去，分别得到半胱氨酸响应产物和谷胱甘肽响应产物，谷胱甘肽响应产物发黄色荧光，而由于半胱氨酸响应产物会进一步发生分子内重排，半胱氨酸响应产物发绿色荧光，从而实现半胱氨酸和谷胱甘肽检测和区分。探针分子与半胱氨酸和谷胱氨酸的响应过程如下：
<实施例1>
中间体的制备
以3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素和3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺为原料进行反应，得到中间体，具体过程包括：
步骤一：向3-羧基-4-氯-7-二乙胺基香豆素(295mg，1mmol)中加入无水二氯甲烷(5ml)搅拌溶解，然后依次加入草酰氯(0.9ml，10mmol)、无水dmf(5μl)，在氩气保护下室温反应2.5小时，减压蒸馏除去溶剂，再加入无水二氯甲烷溶解(5ml)，得到第一反应液；
步骤二、将3-羟基-n-(2-乙基吗啉)苯甲酰胺(1mmol)、无水三乙胺(4.4ml，30mmol)加入无水二氯甲烷(5ml)搅拌溶解，得到第二反应液；
步骤三、在℃条件下，将第一反应液加入第二反应液中，在冰水浴下反应40min，减压蒸馏除去溶剂，经柱层析(meoh/ea，50/1v/v)，得到淡黄色固体，淡黄色固体即为中间体，产量为279mg，产率为50％，1hnmr谱图如图1所示，13cnmr谱图如图2所示，质谱谱图如图3所示。
<实施例2>
荧光探针的制备：
以中间体和对硝基苯酚为原料进行反应得到探针反应得到探针的具体过程为：
向中间体(577mg，1mmol)、对硝基苯酚(139mg，1mmol)中加入无水乙腈(7mll)搅拌溶解(具体为先将中间体和硝基苯酚加入反应器中，再向反应器中加入无水乙腈)，再加入三乙胺(5μl，1mmol)，在氩气保护下，回流搅拌1.5h，减压蒸馏出去溶剂，经柱层析得到淡黄色固体，淡黄色固体即为探针(probe)，产量577mg，85％，1hnmr谱图如图4所示，13cnmr谱图如图5所示，质谱谱图如图6所示。
<实施例3>
荧光探针的应用
将荧光探针溶于缓冲溶液(vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，并配制成多组1.0×10-5mol/l的溶液，然后向多组溶液中一一对应分别加入cys、gsh、tyr、val、gly、ala、asp、arg、iso、lys、met、his、phe、thr、ser、pro、glu、kcl、cacl2、mgcl2、zncl2、nacl、h2s、以及h2o2，并测试每组溶液的荧光强度，测试结果如图7和图8所示；
将荧光探针溶于缓冲溶液(vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，并配制成多组1.0×10-5mol/l的溶液，然后向多组溶液中一一对应加入不同质量的半胱氨酸(cys)，配制成半胱氨酸浓度为0-300μm的溶液，最后分别测试其荧光强度，结果如图9所示，图中的箭头指向表示半胱氨酸的浓度逐渐增大，并得到半胱氨酸(cys)浓度与荧光强度的线性关系，如图10所示；
将荧光探针溶于缓冲溶液(vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，并配制成多组1.0×10-5mol/l的溶液，然后向多组溶液中一一对应加入不同质量的谷胱甘肽(ghs)，配制成谷胱甘肽浓度为0-500μm的溶液，最后分别测试其荧光强度，结果如图11所示，图11中箭头指向表示谷胱甘肽的浓度逐渐增大，并得到谷胱甘肽浓度与荧光强度的线性关系，如图12所示；
将荧光探针溶于缓冲溶液(vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，并配制成1.0×10-5mol/l的溶液，然后向溶液中加入半胱氨酸(cys)，配制成半胱氨酸浓度为300μm的溶液，最后测试其不同时间点的荧光强度，结果如图13所示，并得到荧光强度与时间的关系，如图14所示；
将荧光探针溶于缓冲溶液(vdmso/vpbs＝2/8，ph＝7.4)中，并配制成1.0×10-5mol/l的溶液，然后向溶液中加入谷胱甘肽(ghs)，配制成谷胱甘肽浓度为500μm的溶液，最后测试其不同时间点的荧光强度，结果如图15所示，并得到荧光强度与时间的关系，如图16所示；
将荧光探针溶于不同ph的pbs缓冲溶液中，并配制成1.0×10-5mol/l的溶液，测试不同ph条件下的荧光探针的荧光强度，然后向溶液中加入半胱氨酸(cys)，并配制成半胱氨酸浓度为300μm的溶液，最后测试荧光强度随ph的变化情况如图17所示；
将荧光探针溶于不同ph的pbs缓冲溶液中，并配制成1.0×10-5mol/l的溶液，测试不同ph条件下的荧光探针的荧光强度，然后向溶液中加入谷胱甘肽(ghs)，并配制成谷胱甘肽浓度为500μm的溶液，最后测试荧光强度随ph的变化情况如图18所示。
结果表明：
1、由图7和图8可以看出，向溶液中加入tyr、val、gly、ala、asp、arg、iso、lys、met、his、phe、thr、ser、pro、glu、kcl、cacl2、mgcl2、zncl2、nacl、h2s、以及h2o2，与溶液中只加入荧光探针相比，荧光强度没有发生变化，而溶液中分别加入两种cys和ghs两种氨基酸，荧光探针与cys响应后荧光增强16.5倍，与gsh响应后荧光增强29.7倍，这表明该荧光探针对半胱氨酸和谷胱甘肽表现出高灵敏度、高选择性的识别，同时也可以说明该荧光探针可用于环境中半胱氨酸和谷胱氨酸的荧光检测与分析；
2、如图9、图10、图13和图14所示，在半胱氨酸浓度为0-300μm范围内时，荧光强度随着半胱氨酸的浓度增大而增强，并且在0-60min范围内，与荧光探针发生响应的半胱氨酸的量增多，荧光强度逐渐增强；
3、如图11、图12、图15和图16所示，在谷胱甘肽浓度为0-300μm范围内时，荧光强度随着谷胱甘肽的浓度增大而增强，并且在0-60min范围内，与荧光探针发生响应的谷胱甘肽酸的量增多，荧光强度逐渐增强；
4、如图17、18可以说明在ph为5至11的范围内，荧光探针与半胱氨酸、谷胱甘肽响应后都表现出一定的荧光强度，表示荧光探针对半胱氨酸、谷胱甘肽的检测与分析适用于不同ph条件下的检测环境。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。