一种旋孢腔菌醌B衍生物及其生产菌株和应用的制作方法

本发明涉及微生物学、有机化学和药物化学领域，具体涉及从一株丹参内生真菌麦根腐平脐蠕孢菌中分离得到的天然化合物—旋孢腔菌醌新化合物及该化合物的制备方法和应用。。

背景技术

作为重要的模式药用植物，丹参集很好的药用，食用，科研及经济等多种价值于一身，具有保护心肌、免疫调节、抗肿瘤、抗感染和抗心律失常等多种药理活性，入药部位为根。由于资源有限，生长周期长和环境保护等原因，其开发利用受到了很大限制。目前对丹参的研究多集中于化学成分及药理作用，对其内生真菌的关注也逐渐增强；而对其内生真菌次级代谢产物的物质分离，尚未见文献报道。

微生物具有分布广、种类多及生长快等特征，使得微生物的次级代谢产物更具有开发潜力和优势。平脐蠕胞菌(bipolaris)是一种重要的真菌类群，属半知菌亚门(deuteromycotina)、丝孢纲(hyphomycetes)、丝孢目(moniliales)、从梗孢科(moniliaceae)、蠕孢属(bipolaris)。分布极其广泛，寄生于多种植物或植物基质。近年来由真菌产生的次级代谢产物报道逐渐增加，研究内生真菌的次级代谢产物是研发新药及其先导结构的重要途径之一，具有重要的理论与现实意义。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种旋孢腔菌醌b衍生物。本发明的另一目的是提供该产生旋孢腔菌醌b衍生物的菌株klbmpsm007及其生产方法；本发明还提供了旋孢腔菌醌b衍生物在制备抑制或降解绿脓杆菌药物中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种旋孢腔菌醌b衍生物，所旋孢腔菌醌b衍生物的结构式如下所示：

本发明所述的一株产生旋孢腔菌醌b衍生物的菌株klbmpsm007，经鉴定为麦根腐平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2017年06月05日，保藏编号为cgmccno.13900。菌株klbmpsm007在固体平板上菌落形态为：颜色灰白、菌落绒毛状，中间略微凸起。菌株无鞭毛，革兰氏反应阳性，可以抗链霉素、青霉素。

本发明所述的菌株klbmpsm007在产生旋孢腔菌醌b衍生物中的应用。

其中，所述菌株klbmpsm007产生旋孢腔菌醌b衍生物的具体步骤为：

(1)将菌株从低温保存的斜面转接到新pda平板上进行活化，恒温培养箱培养；

(2)活化培养后挑取菌丝接种于pdb加富培养基中，恒温摇床振荡培养制备种子液；

(3)将种子液接种到大米固体培养基中，进行发酵得到菌株klbmpsm007的发酵产物；

(4)将发酵产物烘干，通过乙酸乙酯加热回流提取3-5次，合并萃取液后浓缩，所得乙酸乙酯浸膏自然风干；

(5)将乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析梯度洗脱，挑选明显色带组分进行薄层层析分析，再通过凝胶柱分离，馏出液收集，通过高效液相色谱法纯化，得到旋孢腔菌醌b衍生物，即通过高效液相色谱法纯化，得到旋孢腔菌醌b衍生物；

其中，步骤(3)所述大米固体培养基由大米加入营养液制成，所述大米固体培养基初始含水率45-50％，所述营养液初始ph为5.5～6.0，物料厚度3-4cm。即所述大米固体培养基刚配置好的含水量占45-50％，初始ph为5.5～6.0，培养基厚度3-4cm。

作为优选，步骤(3)所述发酵时间为35-40天。

本发明所述的旋孢腔菌醌b衍生物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用。

本发明所述的旋孢腔菌醌b衍生物在制备降解绿脓杆菌药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比较，本发明具有如下优点：

本发明经分离筛选获得一株麦根腐平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)klbmpsm007，该菌株能产生旋孢腔菌醌b衍生物，该化合物为一种新型天然化合物旋孢腔菌醌b衍生物cob1，通过动物实验检测发现该新型天然化合物旋孢腔菌醌b衍生物cob1显著增加了绿脓杆菌感染小鼠的存活率，降低了肺损伤和细菌扩散，显示出良好的抗绿脓杆菌感染的生物学效应。同时，还发现cob1处理能直接诱导肺泡巨噬细胞自噬作用的发生，促进巨噬细胞识别、吞噬和降解绿脓杆菌，从而抵御绿脓杆菌的侵染，说明cob1在诱导巨噬细胞自噬杀菌过程中具有重要的调节作用。

本发明的菌株klbmpsm007生产并分离筛选旋孢腔菌醌b衍生物的方法生产成本低，使用方便，适用于生产应用。

附图说明

图1为该旋孢腔菌醌新化合物的化学结构式；

图2为化合物核磁共振谱碳谱；

图3为化合物核磁共振谱氢谱；

图4为化合物核磁共振dret谱；

图5为化合物核磁共振h-hcosy谱；

图6为化合物核磁共振c-h相关谱；

图7为化合物核磁共振hsqc谱；

图8为cob1对绿脓杆菌感染小鼠存活率的影响；

图9为cob1对绿脓杆菌在小鼠肺部扩散速率的影响；

图10为cob1和cob处理鼠肺泡巨噬细胞mh-s，ii型上皮细胞，骨髓巨噬细胞bmdm和巨噬细胞raw264.7，2h后细胞相对存活率。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

菌株klbmpsm007的分离和鉴定：

采集了江苏邳州地区和山东乳山地区的丹参作为样本，对其根、茎叶和花整理分类，样品经表面消毒处理后，将样品切成0.5×0.5cm大小的块状，分类放置于分离培养基上。每天按时观察菌落生长情况，待有真菌菌落生长出时，尽快将组织块边缘长出的真菌转接到新鲜培养基，纯化2～3次，获得真菌klbmpsm007。菌株klbmpsm007在固体平板上菌落形态为：颜色灰白、菌落绒毛状，中间略微凸起。菌株无鞭毛，革兰氏反应阳性，可以抗链霉素、青霉素。

扩增该菌株klbmpsm007的its区全序列并进行测序，pcr扩增得到的rdnaits序列全序列，如seqidno1所示，通过在ncbi上进行比对发现，结果表明菌株klbmpsm007与麦根腐平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)菌株的同源性最近，同源性达到99％，结合形态和生理生化特征，将菌株klbmpsm007初步鉴定为麦根腐平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)，命名为麦根腐平脐蠕孢菌klbmpsm007(bipolarissorokiniana)，将该菌株klbmpsm007送交位于中国北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2017年06月05日，保藏编号为cgmccno.13900。

seqidno.1：

ttcctccgcttattgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaaaagttaaaaatgtagagtcttgatggattaccgtccttttctcctgatacaaagcgcaaaatatgtgctgcgctccgaaaccagtaggccggctgccaatcgttttaaggcgagtctcccagaaagagggagacaaaaaacgcccaacaccaagcaaagcttgaaggtacaaatgacgctcgaacaggcatgccctttggaataccaaagggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacactacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttgtaataattacattgtttttactgacgctgattgcaactgcataaaaaaaaggtttatggtttggtcctggwggcgggcgaacccgcccaggaaacaacaagtgcgcaaaagacatgggtgaaaaaaatatttcagccggccgcgaagccaggccttcatattttgttgtgtaatgatccctccgcaggttcacctacggagaccttgttgttacgacttttacttca

实施例2

菌株发酵及产物分离纯化

种子培养基

pdb加富培养基：土豆200g，葡萄糖20g，kh2po41g，mgso40.5g，双蒸水1l，ph自然，115℃灭菌30min。

发酵培养基

大米固体培养基：30g大米置于培养瓶，加入营养液，每升营养液含双蒸水1l，kh2po41.0g，mgso40.5g，充分混匀浸泡约4h，121℃灭菌30min。

菌株发酵具体流程：

将菌株从低温保存的斜面转接到新pda平板上进行活化，于28℃恒温培养箱培养3-5天；

挑取少量菌丝接种于pdb加富培养基中，28℃、120r/min恒温摇床振荡培养48h制备种子液；

按体积比8％的比例将种子液接种到大米固体培养基中，培养基的初始含水率45-50％，营养液初始ph为5.5～6.0，，培养基厚度3-4cm，发酵时间35-40天得到菌株klbmpsm007的发酵产物。

有效成分的萃取、分离纯化

萃取：将发酵产物烘干，通过乙酸乙酯加热回流，温度80℃。提取3-5次，合并萃取液后浓缩，所得浸膏至于通风橱中自然风干；

分离纯化：将上述得到的乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以氯仿：甲醇＝100：1，50：1，20：1，10：1，5：1，1：1逐级梯度洗脱，然后以氯仿：甲醇＝1：10，1：50，0：100逐级梯度洗脱。粗分得到的70个组分(fr.1～fr.70)；从中挑选明显色带组分上样于小硅胶柱，将fr.17经薄层层析分析，选择石油醚-乙酸乙酯体系，体积比5:1，上样于硅胶柱，得fr.17-1和fr.17-5；fr.17-5进一步用sephadexlh-20凝胶柱分离，选择甲醇为洗脱剂，流速设置为0.2ml/min，馏出液用青霉素瓶按每小瓶7ml收集，通过高效液相色谱法，按照乙腈：水＝(60：40)，流速2.5ml/min，波长254nm来纯化。

通过上述提取分离得到旋孢腔菌醌b衍生物，即一个旋孢腔菌醌新化合物cochlioquinoneb1(简称cob1)。

旋孢腔菌醌新化合物cochlioquinoneb1呈紫红色油状(氘代氯仿)，

¹h-nmr(400mhz,cdcl3，ppm)δ：¹³c-nmr(100mhz,cdcl3，ppm)δ。

取cob1溶解于氘代试剂中，置于核磁共振光谱仪中采集碳谱及氢谱数据，结果如表1及附图2～7所示。

新型天然化合物旋孢腔菌醌b衍生物cob1的核磁波谱数据统计，如表1所示。

表1.化合物的cob1的核磁归属(为cob1的碳、氢谱归属表)

从表1可以看出，179.4，154.8，115.9，184.5，170.3ppm为典型的对醌结构碳信号，同时70～80ppm为双键典型吸收区域。

通过碳氢谱(图2,3)对比可知，它是以旋孢腔菌醌b的化学结构为基础，保留了活性对醌环结构，去除6号位上的脂肪侧链，同时12号上的双键发生了加氢反应生成羟基；结合dept谱(图4)和相关谱数据(图5-7)，初步将该化合物鉴定为：新旋孢腔菌醌b(cochlioquinoneb，cob)衍生物：12-羟基-去脂肪酸-旋孢腔菌醌b1(12-hydroxy-dealiphaticchains-anhydrocochlioquinoneb1，cob1)，分子式为c26h34o7，具体结构化学式如图1所示。

实施例3

旋孢腔菌醌新化合物抗绿脓杆菌感染实验

1、cob1显著促进绿脓杆菌感染小鼠的存活率

尾静脉注射法将cob1注入到c57bl/6j小鼠中(每只小鼠100g/100lpbs，24h注射一次，共注射两次)，构建cob1处理组小鼠模型，同时，等体积100lpbs注射的小鼠作为对照组。模型构建成功后，鼻腔灌注绿脓杆菌pao1(1×107/只，每组10只)，连续观察7天，绘制生长曲线。结果显示cob1显著提高了绿脓杆菌感染小鼠的存活率(附图8)。

2、cob1可以显著抑制绿脓杆菌在小鼠肺部的扩散速率鼻腔灌注绿脓杆菌pao1带luciferase信号的基因工程菌株pao1xen-41(1×10⁷/只)到cob1处理组和对照组小鼠中，在活体成像仪下观察。结果显示，

绿脓杆菌在cob1处理组小鼠中的扩散速率，显著低于对照组(附图9)，说明cob1抑制绿脓杆菌在宿主体内的繁殖和扩散。

3、cob1具有较低的细胞毒性

用20ng/mlcob1和cob(对照为pbs溶剂)分别处理小鼠肺泡巨噬细胞株mh-s，ii型上皮细胞株mle-12，骨髓巨噬细胞bmdm，巨噬细胞株raw264.7，2小时后用mtt法测定细胞活性。结果显示，cob处理的细胞平均存活率仅约50％，而cob1处理的细胞存活率平均为90％，显示出较低的细胞毒性(附图10)。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>一种旋孢腔菌醌b衍生物及其生产菌株和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>614

<212>dna

<213>麦根腐平脐蠕孢菌(bipolarissorokiniana)

<400>1

ttcctccgcttattgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaaa60

agttaaaaatgtagagtcttgatggattaccgtccttttctcctgatacaaagcgcaaaa120

tatgtgctgcgctccgaaaccagtaggccggctgccaatcgttttaaggcgagtctccca180

gaaagagggagacaaaaaacgcccaacaccaagcaaagcttgaaggtacaaatgacgctc240

gaacaggcatgccctttggaataccaaagggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgatt300

cactgaattctgcaattcacactacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccag360

aaccaagagatccgttgttgaaagttgtaataattacattgtttttactgacgctgattg420

caactgcataaaaaaaaggtttatggtttggtcctggwggcgggcgaacccgcccaggaa480

acaacaagtgcgcaaaagacatgggtgaaaaaaatatttcagccggccgcgaagccaggc540

cttcatattttgttgtgtaatgatccctccgcaggttcacctacggagaccttgttgtta600

cgacttttacttca614