母牛群体HH型遗传缺陷基因的检测方法及其用途与流程

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种母牛群体hh型遗传缺陷基因的检测方法及其用途。

背景技术

近年来，为了提高奶牛的生产性能，我国大量从国外引进遗传物质，促进了国内奶牛群体的遗传改良。然而，在引进遗传物质的过程中也导致了一些遗传缺陷在我国奶牛群体的传播。2016年10月28日，农业部畜牧业司发布了《中华人民共和国农业部公告第2460号》，公告中规定从境外引进种牛及冷冻精液和胚胎的，应在系谱上标识或在销售合同条款中写明种牛及冷冻精液和胚胎未携带脊椎弯曲综合征(cvm)、白细胞黏附缺陷综合征(blad)、短脊椎综合征(by)等主要遗传缺陷基因。因此建立种牛缺陷基因检测平台，对保障种牛及遗传物质的质量安全，提高奶农的经济效益均具有重要意义。

2011年，vanraden等人利用北美牛群50killuminasnps基因型数据，通过软件以及系谱分析，并通过和具体繁殖性状(scr、妊娠率、死胎率)的关联分析，在荷斯坦牛群中发现了三种导致胚胎死亡的隐性遗传缺陷单倍型(hh1、hh2和hh3)，hh1型遗传缺陷为apaf1基因突变造成，hh3型遗传缺陷为smc2基因突变造成，当其纯合时，会导致早期流产或死胎，而杂合体携带者不会表现出任何症状，因此，有必要对杂合体携带者进行精确的检测和筛选，避免后代出现流产或死胎的现象。

kasp是竞争性等位基因特异性pcr的缩写，可在广泛的基因组dna样品中，对snps和特定位点上的indels(insertionsanddeletions，插入和缺失)进行精准的双等位基因判断，是基于引物末端碱基的特异匹配来对snp进行分型。目前检测奶牛遗传缺陷基因的方法主要有pcr-pira、pcr-sscp、pcr-rflp以及焦磷酸测序，未有利用kasp技术用于检测奶牛hh型遗传缺陷基因的报导。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的不存，本发明提供了一种母牛群体hh型遗传缺陷基因的检测方法，包括如下步骤：

步骤s1：获取待检测母牛群体的血液样品，采用dna提取试剂盒，从血液样品中提取dna样本；

步骤s2：采用设计好的kasp引物，对dna样本进行pcr扩增；

其中，kasp引物包括三条，分别为上游正常基因引物、上游突变基因引物以及下游引物，并且，上游正常基因引物及上游突变基因引物中，其5’端分别设计有hex荧光标签序列及fam荧光标签序列；

步骤s3：根据扩增后的dna样品的荧光强度，判断对应的母牛群体中的hh型遗传缺陷对应的基因的基因型。

其中，所检测的hh型遗传缺陷基因包括hh1及hh3型遗传缺陷基因，其中，hh1型遗传缺陷基因由apaf1基因突变引起，hh3型遗传缺陷基因由smc2基因突变引起。

其中，在对hh1型遗传缺陷基因进行检测时，所设计的引物如下：

上游正常基因引物：5’-gaaggtcggagtcaacggattgaaacttcagaggtttatcggc-3’；

上游突变基因引物：5’-gaaggtgaccaagttcatgctgaaacttcagaggtttatcggt-3’；

下游引物：5’-ggtaaagcattccgttatcgac-3’。

其中，在对hh3型遗传缺陷基因进行检测时，所设计的引物如下：

上游正常基因引物：5’-gaaggtcggagtcaacggatttggacatatgctacgtactcattt-3’；

上游突变基因引物：5’-gaaggtgaccaagttcatgcttggacatatgctacgtactcattc-3’；

下游引物：5’-aaatcctagaactattctgaggctc-3’。

其中，所述步骤s2中，pcr扩增体系包括：10-15份体积含量的混合引物，45-50份体积含量的dna样本以及45-50份体积含量的kasp混合液，空白对照以重蒸馏水代替dna样本。

其中，所述步骤s2中，pcr扩增包括如下步骤：

步骤s21：在90-95摄氏度下热激活14-16min，90-95摄氏度下变性18-22s，61-55摄氏度下退火和延伸55-65s，进行10个循环；

步骤s22：在90-95摄氏度下变性18-22s，54-56摄氏度下退火和延伸55-65s，进行26个循环；

步骤s23：在90-95摄氏度下变性18-22s，54-59摄氏度下退火和延伸55-65s，进行3个循环。

其中，所述步骤s2中，pcr扩增包括如下步骤：

步骤s21：在94摄氏度下热激活15min，94摄氏度下变性20s，61-55摄氏度下退火和延伸60s，进行10个循环；

步骤s22：在94摄氏度下变性20s，55摄氏度下退火和延伸60s，进行26个循环；

步骤s23：在94摄氏度下变性20s，57摄氏度下退火和延伸60s，进行3个循环。

本发明另外提供了一种如上所述的母牛群体hh型遗传缺陷基因的检测方法的用途，该母牛群体hh型遗传缺陷基因的检测方法用于荷斯坦母牛的遗传缺陷基因检测及科学选种选配。

本发明提供的母牛群体hh型遗传缺陷基因的检测方法及用途，首次建立了采用kasp分型检测方法检测影响奶牛繁殖力的遗传缺陷基因，该方法快速、高效、经济，可对样本进行高通量的检测。

附图说明

图1：hh1遗传缺陷基因的kasp检测结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合附图详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。

本发明旨在准确、快速检测荷斯坦母牛中apaf1基因及smc2基因的突变个体，从而为科学选种选配提供参考资料。

1.试验样品

158头荷斯坦母牛的血液样品。

2.基因组dna提取

采用市售的dna提取试剂盒，根据试剂盒说明书所示，提取每头奶牛血液样品中的dna样本。

3.kasp检测方法的建立

3.1引物设计

检索ensembl数据库的牛基因组序列(umd3.1)，获得apaf1基因的部分序列(bta5:63150200-63150600)，以及smc2基因的部分序列(bta8:95410307-95410707)，以此为模板进行pcr引物设计。

apaf1基因的部分序列如下：

gatggtatagactgtgagaatttccaggagtttttatctttaaatggacatcttcttggagacagccatttcctaatattgtgcaactgggcctctgtgaactggaaacttcagaggtttatcgg[c/t]aagctaagctgcaggccaagcaggaggtcgataacggaatgctttacctggagtgggt。

其中，下划线标注部分为设计上游引物及下游引物时的对应部分，上游引物对应部分的最后一个基因点为发生基因突变的点，对应的：

上游引物f1：5’-aaacttcagaggtttatcggc-3’；

上游引物f2：5’-aaacttcagaggtttatcggt-3’；

下游引物：5’-ggtaaagcattccgttatcgac-3’。

表1所示为针对apaf1基因所设计的引物，针对snp位点，上游引物apaf1-f1和apaf1-f2分别为根据上游正常基因及突变基因设计的引物，两个引物的3′端为等位基因突变碱基(斜体部分的c或t)，本发明同时将apaf1-f1和apaf1-f2在5’端加上相应的通用接头序列(荧光标签序列)，以方便后期不同基因型的识别，如下：

表1apaf1基因的kasp引物序列信息

smc2基因的部分序列如下：

tctacatcctggatgaggtcgatgcagccctggatctttctcatactcagaatattggacatatgctacgtactcatt[t/c]cacacattctcaggtaagaaccaaaaagagcctcagaatagttctaggatttgtttttctaaaactattctttagtaatggtcagtatatataaggaatttaggattgaagaataccaaggtgttgtatatctctttaaatatataattctattcatatgg。

其中，下划线标注部分为设计上游引物及下游引物时的对应部分，上游引物对应部分的最后一个基因点为发生基因突变的点，对应的：

上游引物f1:5’-ttggacatatgctacgtactcattt-3’；

上游引物f2:5’-ttggacatatgctacgtactcattc-3’；

下游引物：5’-aaatcctagaactattctgaggctc-3’。

表2所示为针对smc2基因所设计的引物，针对snp位点，上游引物smc2-f1和smc2-f2分别为根据上游正常基因及突变基因设计的引物，两个引物的3′端为等位基因突变碱基(斜体部分的c或t)，本发明同时将smc2-f1和smc2-f2在5’端加上相应的通用接头序列(荧光标签序列)，以方便后期不同基因型的识别，如下：

表2smc2基因的kasp引物序列信息

3.2pcr程序

pcr体系为5μl，包括2.5μldna、2.5μlkaspmastermix(kasp混合液)(lgcgenomics,hoddeston,uk)、0.07μl混合引物。为避免对试验结果的误判，设置空白对照，其dna模板用ddh2o循环；94℃时变性20s、57℃时退火和延伸60s、进行3个循环。代替。pcr扩增的条件在温度为94℃时热激活15min,94℃时变性20s、61-55℃时退火和延伸60s、进行10个循环；94℃时变性20s、55℃时退火和延伸60s、进行26个

3.3数据扫描

pcr扩增结束后，对于扩增结果，进行数据扫描，具体可参照《abi7900htfastrealtimepcrsystem实验操作规程》，图1为本发明中针对荷斯坦母牛的hh1遗传缺陷基因的kasp检测结果图，如图1所示，左上角显示部分奶牛个体中dna样本扩增后的荧光强度，这部分对应纯合未突变(cc)的基因个体，由于扩增带具备hex荧光标签序列，扩增后的dna样本荧光扫描后呈现蓝色，右下角显示部分奶牛个体中dna样本扩增后的荧光强度，这部分对应杂合突变(ct)的基因个体，由于扩增带既具备hex荧光标签序列也具备fam荧光标签序列，扩增后的dna样本荧光扫描后呈现两种荧光标签对应颜色的混合色，即红色和蓝色混合后的绿色。

4.基因型检测结果

4.1群体基因组频率计算

杂合基因型频率(％)＝杂合个体数/测定个体数×100％

有害基因频率＝杂合基因型频率/2

4.2基因型检测结果

本发明共随机检测了158头荷斯坦母牛，针对apaf1基因，共检测到20头携带者个体，hh1携带率为12.66％，其有害基因频率为6.33％。针对smc2基因，共检测到6头携带者个体，hh3携带率为3.8％，其有害基因频率为1.9％。

本发明中，所谓的“fam”，是指羟基荧光素；所谓的“hex”，是指六氯荧光素氨基磷酸酯。

本发明的有益效果如下：

1、采用kasp检测母牛中hh1及hh3型遗传缺陷基因的携带者，检出率达到100％。

2、采用kasp的方法进行检测，相比较现有的检测方法，更快速、高效且准确。

3、本发明的检测方法为科学选种选配提供了依据，对降低奶牛育种的经济损失具有重要意义。

虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。