阿霉素与D-葡萄糖醛酸的分子复合物,其制备,活性和应用的制作方法

文档序号:19747662发布日期:2020-01-21 18:47阅读:837来源:国知局
阿霉素与D-葡萄糖醛酸的分子复合物,其制备,活性和应用的制作方法
本发明涉及一种摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物,涉及这种分子复合物的制备方法,涉及这种分子复合物在抗肿瘤细胞增殖中可将阿霉素送入耐药细胞的优势,涉及这种分子复合物在抗肿瘤生长中可降低阿霉素致死性毒性的优势,因而本发明涉及这种分子复合物在制备不产生耐药和无致死性毒性的抗肿瘤药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
:阿霉素(adriamycin,dox)是临床的一线抗肿瘤药。用于治疗霍奇金病及淋巴肉瘤,原发性中枢神经系统淋巴瘤(网状细胞肉瘤),未分化小细胞性和非小细胞性肺癌,乳腺癌,急性淋巴细胞及粒细胞白血病,骨肉瘤及软组织肉瘤,卵巢癌,睾丸肿瘤,膀胱癌,肾母细胞癌,前列腺癌,甲状腺癌,神经母细胞癌,食管癌,胃癌,原发性肝癌,宫颈癌及头颈癌,多发性骨髓瘤,胰腺癌和子宫内膜癌及脑瘤。在阿霉素的众多毒副作用中,心肌损伤和心力衰竭最值得警惕。阿霉素的成人剂量是每3周50mg至60mg(相当于1.54μmol/kg至1.85μmol/kg)。或每周20mg至30mg(相当于0.62μmol/kg至0.93μmol/kg)连续用3周。即使这样用药,阿霉素仍然可诱发严重的心脏毒性乃至死亡。于是,寻找降低阿霉素心脏毒性的途径一直是药剂研究的前沿。d-葡萄糖醛酸又称葡糖醛酸(d-glucuronicacid)通常以稳定的葡萄糖醛酸内酯存在。葡萄糖醛酸内酯(又称肝泰乐)具有保护肝脏和解毒作用的非处方药。葡萄糖醛酸内酯通过降低肝淀粉酶活性阻断糖原分解,提高肝糖原贮量和降低肝脂肪贮量保护肝脏。葡萄糖醛酸内酯是构成人体结缔组织及胶原的成分,可辅助治疗关节炎和风湿病,以及有解毒功能。受体内酶催化葡萄糖醛酸内酯开环转变为葡萄糖醛酸。葡萄糖醛酸与肝内或肠内的毒性代谢产物或毒物或药物结合,生成无毒d-葡萄糖醛酸结合物随尿排出体外发挥解毒作用。这些知识使发明人认识到,d-葡萄糖醛酸可与阿霉素成为分子复合物,因而可以用作输送阿霉素的载体。发明人还认识到在d-葡萄糖醛酸的帮助下阿霉素可进入耐药细胞。发明人进一步认识到在d-葡萄糖醛酸的帮助下阿霉素不再有致死性毒性。根据这些认识,发明人提出了阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的发明。技术实现要素:本发明的第一个内容是提供一种摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物。本发明的第二个内容是提供制备摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的方法。本发明的第三个内容是提供摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的esi(+)-ft-ms及qcid谱。本发明的第四个内容是提供摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的noesy谱。本发明的第五个内容是评价摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制k562细胞和s180细胞增殖活性。本发明的第六个内容是评价摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制k562细胞和s180细胞增殖活性。本发明的第七个内容是评价摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物帮助阿霉素进入mcf-7/dox细胞。本发明的第八个内容是评价摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的抗肿瘤活性和致死性毒性。附图说明图1.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的esi(-)-ft-ms谱。图2.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的noesy谱。图3.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制50%k562细胞和s180细胞增殖的浓度曲线。图4.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物孵育6小时mcf-7/dox细胞的激光共聚焦影像。图5.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物孵育12小时mcf-7/dox细胞的激光共聚焦影像。图6.阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物孵育24小时mcf-7/dox细胞的激光共聚焦影像。具体实施方式为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。实施例1制备摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物室温将1087mg阿霉素与388mgd-葡萄糖醛酸在100ml超纯水中制备成澄清溶液。将该澄清溶液冷冻干燥,得到1475mg冻干粉。这样制备的冻干粉就是本发明的摩尔比为1比1的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物(后面简称复合物)。实施例2测定复合物的esi(+)-ft-ms谱大约1mg实施例1制备的复合物的冻干粉溶于0.5ml光谱纯甲醇接受esi(+)-ft-ms及qcid测定,图1表明复合物的esi(+)-ft-ms谱给出质量数为739.25579的分子离子峰。该质量数等于1分子阿霉素与1分子d-葡萄糖醛酸的分子量加2个h的质量数。也就是说,复合物由1分子阿霉素与1分子d-葡萄糖醛酸构成。图1的qcid谱表明,质量数为739.25579的复合物的分子离子在esi(+)-ft-ms条件下可裂解为质量数为544.17580的离子,即1个阿霉素分子加1个h的质量数,和质量数为195.06006的离子,即1个d-葡萄糖醛酸分子加1个h的质量数。也就是说,在实施例1的冻干粉中阿霉素与d-葡萄糖醛酸都只是复合物的组分。实施例3测定复合物的noesy谱大约5mg实施例1的复合物的冻干粉溶于氘代dmso并在800兆核磁共振仪上测定它的noesy谱。图2表明,复合物给出a和b两个重要的相关峰。相关峰a来自阿霉素糖环羟基质子与d-葡萄糖醛酸的羧基质子的相互作用,相关峰b来自阿霉素糖环氨基质子与d-葡萄糖醛酸的羧基质子的相互作用,这两种相关峰要求当1分子阿霉素与1分子d-葡萄糖醛酸相互接近形成分子复合物时所述质子间的距离必须小于实施例4评价阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的抗肿瘤细胞增殖活性本测定采用mtt(四噻唑蓝,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法选用rpmi-1640培养基(内含10%经灭活的胎牛血清,1×105u/l青霉素和100mg/l链霉素)。将生长状态良好,处于对数生长期的k562悬浮细胞(人慢性粒细胞白血病细胞)或半贴壁半悬浮s180细胞(小鼠肛门肉瘤细胞)以5×104个/ml的密度接种于96孔板,每孔100μl。按预设的浓度梯度(即终浓度为0.078125μm,0.15625μm,0.3125μm,0.625μm,1.25μm和2.5μm)加入经灭菌处理的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的超纯水溶液,对照组加入等体积超纯水。96孔板在37℃于5%co2培养箱孵育48h。之后每孔加25μl浓度为5mg/ml的mtt溶液,继续孵育4h。之后,离心(3000rpm,15min)。小心吸出上清液,每孔加100μldmso并振荡10min,使紫色沉淀全部溶解。于酶标仪上测定波长570nm处的od值(吸光值)。每个测定重复3次。按照存活率=[(对照组平均od值-阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物平均od值)/对照组平均od值]×100%。结果见图2。不难看出,无论是对于k562细胞还是对于s180细胞增殖阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的抑制作用都显著强于阿霉素。按照图2内插,阿霉素抑制50%k562细胞和s180细胞增殖浓度(ic50)分别为0.625μm和0.234μm。按照图2外推,阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制50%k562细胞和s180细胞增殖的浓度(ic50)都远低于0.078μm。也就是说,阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制50%k562细胞和s180细胞增殖的ic50远低于阿霉素的ic50的1/3-1/8。本案的技术效果突出。实施例5评价阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物进入mcf-7/dox细胞核的能力阿霉素,d-葡萄糖醛酸及氨基葡萄糖和阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物都用rpmi-1640培养基(含0.1%dmso)配制成所需浓度的溶液。将生长状态良好,处于对数生长期的mcf-7/dox细胞(阿霉素耐药人乳腺癌细胞)按照10×104个/ml的密度接种于激光共聚焦培养皿,每皿1ml。在37℃和5%co2培养箱中孵育12小时,分别加入pbs,经灭菌处理的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物(其中阿霉素的终浓度为12.5μm),d-葡萄糖醛酸(终浓度为6.25μm)和阿霉素(终浓度为12.5μm)。按预设时间继续培养6小时,12小时和24小时,然后去上清液。残留细胞用pbs洗3次。残留细胞加1ml多聚甲醛(4%)于4℃固定30min,然后去上清液。残留细胞用pbs清洗3次。残留细胞用1mltriton的pbs溶液(0.1%)室温透化10min,然后去上清液。残留细胞用pbs清洗3次,然后用终浓度为1μg/ml的dapi(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)的pbs溶液避光染色15min。弃去染色液,残留细胞用pbs吹洗3次后用激光共聚焦显微镜(tcssp5leica)检测。检测荧光染料dapi的激发波长为405nm,最大发射波长为488nm(蓝色荧光是标记的细胞核)。检测阿霉素的激发波长为478nm,最大发射波长为596nm(红色荧光是阿霉素)。图3,图4和图5表明d-葡萄糖醛酸明显增强阿霉素进入人乳腺癌阿霉素耐药细胞核的能力。阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的技术效果突出。实施例6评价阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物抑制s180小鼠肿瘤生长的活性测定前将阿霉素和阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物都用生理盐水溶解,用于s180小鼠给药。在无菌环境中取接种于雄性icr小鼠10天生长旺盛的s180腹水瘤液,用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合,将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2%台盼蓝染色,混匀后按白细胞计数方法计数,染蓝色者为死细胞,不染色者为活细胞。按细胞浓度=4大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数=细胞数/ml计算细胞密度,按细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%计算细胞存活率。将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×107个/ml的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2ml/只),制造s180荷瘤小鼠。接种24h后s180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天)或每日腹腔注射阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的生理盐水溶液(按阿霉素计算剂量为2μmol/kg/天)或每日腹腔注射生理盐水(剂量为10ml/kg/天)。连续治疗10天,之后称小鼠体重,乙醚麻醉脱颈椎处死小鼠。然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位,剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。瘤重(均值±sdg)表示疗效,数据用t检验和方差分析。结果见表1。在2μmol/kg/天剂量下,阿霉素连续治疗10天40%小鼠死亡。而在2μmol/kg/天剂量下阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物连续治疗10天的小鼠全部存活。可见,阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物的安全性显著优于阿霉素。综合这些数据不难看出,本发明的阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物显示了突出的技术效果。表1阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物对s180小鼠肿瘤生长的影响组别剂量(μmol/kg/天)存活率瘤重(均值±sdg)生理盐水10ml/kg/天10/101.63±0.45阿霉素26/100.60±0.18阿霉素与d-葡萄糖醛酸的分子复合物210/100.84±0.14aa)和生理盐水比p<0.01,和2μmol/kg/天阿霉素比p>0.05;n=10。当前第1页1 2 3 
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