尿液中miR-214作为肾脏纤维化的生物标志物的用途的制作方法

本发明涉及mir-214的新应用，具体地涉及尿液中mir-214作为肾脏纤维化的生物标志物的新用途。

背景技术

肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病(ckd)进展到终末期肾衰竭(esrd)的共同病理基础，其病理生理过程主要包括：包括肾小管上皮细胞在内的肾脏固有细胞损伤与阶段、纤维形成的信号传递阶段、纤维形成阶段和肾脏损害阶段。其中，肾小管上皮细胞损伤及损伤后诱发的一系列生物化学反应是启动和推进肾小管间质纤维化的主要因素。

蛋白尿是众多慢性肾脏疾病的共同特点，包括儿童肾脏疾病。其中部分患儿在治疗后会痊愈，但仍有部分患儿存在持续的蛋白尿，而目前认为，长期大量蛋白尿总是与肾间质损害伴随出现。使用大剂量牛血清白蛋白构造大鼠白蛋白超载实验发现，在蛋白尿出现后很短时间内即出现了肾间质炎症，进而出现肾间质纤维化和肾功能损害。因此这部分持续大量蛋白尿患儿会逐渐出现肾间质纤维化，进而走向终末期肾病。目前肾脏纤维化诊断主要依赖肾穿刺活检这一有创性检查手段，由于这一技术本身的技术要求、侵入性及家长和患儿存在的恐惧心理等诸多因素，使得对慢性肾病患儿的肾脏穿刺仅在频繁复发或治疗效果不佳等情况下才能进行，可能会错失治疗肾脏纤维化、延缓肾脏损伤的最佳时机。

近年来，尿液中微小rna(microrna，mirna)引起了人们的关注。mirna是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小rna，通过与靶基因mrna互补结合而调控靶基因的表达，参与生物体内的多种病理生理过程。mirnas可以稳定存在人的体液中，因此可以作为基本诊断的标志物。已有研究发现尿液中mirna的表达水平与肾脏疾病密切相关，如狼疮性肾炎、iga肾病、急性肾损伤等。但尚未有有关尿液中mir-214作为肾脏纤维化的生物标志物的报道。

技术实现要素：

本发明意外的发现了尿液中mir-214可以作为肾脏纤维化的生物标志物，尤其发现在慢性肾脏病患儿尿液中mir-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。

本发明进一步提出了一种通过检测尿液中mir-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒，所述试剂盒包括mir-214逆转录相关引物、mir-214pcr相关引物、逆转录mix试剂、逆转录缓冲液、实时定量pcrmix反应试剂、内参u6逆转录相关引物、u6pcr相关引物、逆转录mix的试剂和pcrmix反应试剂。其中，mir-214及u6逆转录和pcr相关引物购自广州锐博生物科技有限公司。逆转录mix试剂购自日本takara公司，实时定量pcrmix反应试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

具体地，所述试剂盒包括盒体和盒盖，其中，

所述盒盖的内表面分别设置有可擦涂磁性板和条码区，所述条码区包含试剂盒中试剂保存和配置信息，可擦涂磁性板可用于实验人员随手记录实验信息；

所述盒体包括上、中、下三层，其中，上层和中层相同，均被分为8个分区，每个分区内设置试管孔，分别用于放置装有mir-214逆转录相关引物的试剂管、装有mir-214pcr相关引物的试剂管、装有逆转录mix的试剂管、装有逆转录缓冲液的试剂管、装有实时定量pcrmix反应试剂的试剂管、装有内参u6逆转录相关引物的试剂管和装有u6pcr相关引物的试剂管以及白板笔；

盒体的下层被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，在可抽拉的抽屉内分别填充冷冻材料。

优选地，所述的可抽拉的抽屉外侧设置有拉环。

盒体的中层和下层之间通过隔板隔开。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下的优点和积极效果：

(1)本本发明通过简单的检测尿液中mir-214的表达量来预测肾脏纤维化的程度，避免了肾穿刺活检这一有创性检查手段，为临床判断肾脏纤维化的程度提供重要的依据，可以早期干预肾脏纤维化的进展；

(2)所设计的试剂盒结构合理，使用方便，便于携带保存；

(2)本发明的试剂盒在检测mir-214的表达量时，通过荧光信号积累实时监测整个pcr进程，可以更加准确、便捷的得到监测结果，而且自动化程度高，有效降低污染，便于临床监测推广。

附图说明

图1为mir-214在尿检正常儿童(normal)以及肾病综合征患儿(ns)的尿液中的表达；

图2为mir-214在轻、中、重度蛋白尿患者尿液中的表达以及与蛋白尿的相关性；

图3为mir-214在轻、中、重度蛋白尿患者肾穿刺活检组织中的表达以及与蛋白尿的相关性；

图4为fibronectin(作为纤维化的标志物)在轻、中、重度蛋白尿患者肾穿刺活检组织中的表达以及与mir-214的相关性；

图5为检测尿液中mir-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒的结构示意图。

具体实施方式

本发明意外地发现了尿液中mir-214可以作为肾脏纤维化的生物标志物，尤其发现在慢性肾脏病患儿尿液中mir-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。

为了更方便的检测尿液中mir-214的表达量，本发明还提出了一种通过检测尿液中mir-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒，所述试剂盒包括mir-214逆转录相关引物、mir-214pcr相关引物、逆转录mix试剂、逆转录缓冲液、实时定量pcrmix反应试剂、内参u6逆转录相关引物、u6pcr相关引物、逆转录mix的试剂和pcrmix反应试剂。其中，mir-214及u6逆转录和pcr相关引物购自广州锐博生物科技有限公司。逆转录mix试剂购自日本takara公司，实时定量pcrmix反应试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

具体地，试剂盒包括盒体1和盒盖2，其中，盒盖的内表面分别设置有可擦涂磁性板3和条码区4，条码区包含试剂盒中试剂保存和配置信息，可擦涂磁性板可用于实验人员随手记录实验信息。

盒体包括上、中、下三层，其中，上层5和中层6相同，均被分为8个分区，每个分区内设置试管孔，分别用于放置装有mir-214逆转录相关引物的试剂管、装有mir-214pcr相关引物的试剂管、装有逆转录mix的试剂管、装有逆转录缓冲液的试剂管、装有实时定量pcrmix反应试剂的试剂管、装有内参u6逆转录相关引物的试剂管和装有u6pcr相关引物的试剂管以及白板笔；

盒体的中层和下层之间通过隔板隔开盒，体的下层7被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，在可抽拉的抽屉内分别填充冷冻材料，可抽拉的抽屉外侧设置有拉环8。下层为整个试剂盒的冷冻区，可用于对需要冷藏的试剂进行保存，如装有逆转录mix的试剂管和装有pcrmix反应试剂的试剂管。

在使用时，在每个试剂管的上端标记试剂管的名称或标记符号作为标识，检测时将盒体的上层取下，各个试剂管会露出标识部分，从而可清楚的分辨每个试剂管，取下的上层可进一步用于放置已经加过样的试剂管。

本研究在临床收集52例慢性肾脏病患儿(不同程度蛋白尿，初诊，未做过任何治疗)和46例尿检正常儿童的随机尿液，通过检测尿液中mir-214的表达，结果如图1所示，发现在慢性肾脏病患儿尿液中mir-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。

具体地，尿液中mir-214的表达通过如下方法检测：

(1)尿液中microrna的提取：

1.收取的尿液3000rpm，离心10min，取上清500ul，加入trizol500μl，剧烈涡旋震荡30s，室温静置5min；

2.加入200μl异丙醇，颠倒混匀，剧烈涡旋震荡2min至液体透明，室温静置5min；

3.4℃，13000rpm，离心15min；

4.将500μl上清转移至新的ep管，加入等体积500μl氯仿，颠倒混匀，剧烈涡旋震荡1min，室温静置5min；

5.4℃，13000rpm，离心15min；

6.将上清再次转移至新的ep管，加入3/4体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

7.4℃，13000rpm，离心10min，沉淀rna；

8.移除上清(吸弃)，75％乙醇(depc水配置，-20℃预冷)洗，7500rpm，离心5min；

9.弃上清，纸上倒扣干燥10min，10μldepc水溶解rna；

10.测浓度，准备逆转录。

(2)逆转录步骤：

使用梯度pcr仪，取500ng质量总rna进行逆转录，反应体系为20μl。mir-214和u6分别逆转录，按下列组份配制rt反应液(反应液配制在冰上进行)。

表1.逆转录反应体系

(3)轻柔混匀离心后，放入梯度pcr仪内进行反转录反应，条件为：37℃15min，85℃5sec，4℃保持。cdna短期4℃冰箱保存，长期-20℃储存。

实时定量pcr步骤：

采用罗氏sybrgreenpcr方法，反应体系为20μl，见表2。

表2.real-timepcr反应体系(25μl)

混匀，稍离心，在abiprism7500荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，反应条件为：95℃，10min；然后95℃，15s和60℃，1min循环35次。采用参照基因u6δδct法计算目mir-214表达水平的相对量。

随后选取了做过肾穿刺活检的慢性肾脏病患儿18例，男11例(61％)，女7例(39％)，平均年龄9岁6个月。按蛋白尿的程度将ckd患儿分为轻度蛋白尿组(mild，尿蛋白<1.0g/24h)6例、中度蛋白尿组(moderate,尿蛋白1-3g/24h)6例和重度蛋白尿组(severe,尿蛋白>3.0g/24h)6例。尿蛋白正常组(0-1g/24h)6例，其肾脏组织来源于肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边肾组织，来自附属南京儿童医院泌尿外科，并通过伦理委员会批准及获得患儿父母的知情同意。应用荧光原位杂交的方法检测活检肾组织中mir-214的表达，结果如图2～图4所示，发现其主要表达在肾小管细胞中，与蛋白尿呈正相关。对这些患者的纤维化程度进行免疫组化染色(fibronectin)评估，发现纤维化程度与肾组织mir-214的表达呈正相关。因此我们推测，在慢性肾脏病患儿中，大量蛋白尿引起肾小管中mir-214表达和蓄积增加，尿液中排出减少，进而加重肾脏纤维化。

上述结果说明，在慢性肾脏病患儿的尿液中检测mir-214具有重要的临床意义，为临床判断肾脏纤维化的程度提供重要的依据，可以早期干预肾脏纤维化的进展。

荧光原位杂交的具体步骤：

1.组织准备：

对选取的活检组织的石蜡包块进行切片(5μm厚)，65℃烘烤1小时，然后37℃温箱过夜。常温放置，备用。

2.试剂配制：

1)抗原修复液(0.01m柠檬酸三钠sodiumcitrate溶液ph6.0)——配置500ml：将1.47g柠檬酸三钠溶于500mlddh2o中，调节溶液ph至6.0；

2)通透液permeabilizationbuffer(1×pbs/0.5％tritonx‐100)——配置50ml：将5ml10×pbs稀释至40ml.然后加入250μltritonx‐100，混匀；

3)1×pbs——配置1l：将100ml10×pbs加入到900mlddh2o中，混匀；

4)4×ssc——配置1l：将200ml20×ssc(购买)加入到800mlddh2o中，混匀；

5)预杂交液prehybridizationbuffer(3％bsain4×ssc)——配置100ml：称取3gbsa加入到100ml4×ssc中，混匀；

6)杂交液hybridizationbuffer(10％dextransulfatein4×ssc)——配置10ml：将2ml20×ssc,4ml25％dextransulfate加入到4mlddh2o中，混匀；

7)洗液iwashingbufferi(4×ssc,0.1％tween‐20)——配置1l：将200ml20×ssc和1mltween‐20加入到799mlddh2o中，混匀；

8)洗液iiwashingbufferii(2×ssc)——配置1l：将100ml20×ssc加入到900mlddh2o中，混匀；

9)洗液iiiwashingbufferiii(1×ssc)——配置1l：将50ml20×ssc加入到950mlddh2o中，混匀。

3.脱蜡与复水

1)烘片——将石蜡片置于65℃30min或47℃过夜，使组织不易脱落；

2)脱蜡——将石蜡片完全浸泡于二甲苯中，重复3次，每次10min(二甲苯有剧毒请在通风橱中操作，全程佩戴手套和口罩等防护措施)；

3)去二甲苯——将石蜡片完全浸泡于100％酒精中，重复3次，每次3min；

4)复水——将石蜡片浸泡梯度酒精，依次为90％，80％，70％酒精各3min，最后浸ddh2o中。

5)抗原修复

a.将石蜡片在煮沸的0.01m柠檬酸三钠(ph6.0)溶液中加热10min；

b.切片在溶液中自然冷却30min至室温；

c.石蜡切片浸泡于ddh2o中清洗3次，每次5min；

d.石蜡切片浸泡于1×pbs中；泡于ddh2o中；

4.rnas探针检测

1)使用液体蜡笔在组织边缘周围1mm处画圈，以便于之后的杂交及染色操作；

2)滴加预杂交液prehybridizationbuffer至组织上，把石蜡切片置于湿盒中封闭20min(覆盖为宜)，封闭温度一般低于探针的预测tm值(通常为45‐55℃)，本实验中采用rt22–25℃；

3)预杂交同时，采用正式杂交时的温度预热杂交液hybridizationbuffer；

4)避光条件下，将探针加入到hybridizationbuffer中(详见试剂配置)配置杂交液；

5)弃去prehybridizationbuffer，加入适量杂交液，22–25℃杂交1h(注意：延长杂交时间不能提高信号强度，反而会使背景信号增强)，杂交过程全程避光，杂交液要完全覆盖组织，防止组织风干；

6)避光，在高于杂交温度5℃的条件下，用洗液iwashingbufferi(详见试剂配置)晃动清洗每孔细胞3次，每次5min，以降低背景信号；

7)在步骤e的条件下，用洗液iiwashingbufferii清洗细胞1次；

8)在步骤e的条件下，用洗液iiiwashingbufferiii清洗细胞1次

9)避光，用1×pbs清洗细胞，室温5min。

5.dna染色

1)避光，dapi染色10min；

2)避光，室温下，用1×pbs晃动清洗细胞3次，每次5min，然后封片剂封片后于激光共聚焦显微镜下拍片。

免疫组化的具体步骤：

石蜡切片切好后进行防脱片处理：65℃烘烤1小时，然后37℃温箱过夜。第二天，常规脱蜡(石蜡片完全浸泡于二甲苯中，重复3次，每次10min)、水化(石蜡片浸泡梯度酒精，依次为100％*3，90％，80％，70％酒精各3min)；将切片浸入抗原修复液中，微波炉高火煮沸后，室温静置10min，然后置火中再次煮沸，自然冷却后，用1×pbs洗三次，每次5min；滴加3％过氧化氢，室温20min(灭活内源性过氧化氢酶)，随后用1×pbs洗三次，每次5min；滴加免疫染色封闭液，室温20min，甩去多余液体，无需洗涤；滴加fibronectin抗体(1：200稀释)，置湿盒中4℃固定过夜；第二天37℃温箱复温45min，1×pbs洗5次，每次5min；滴加试剂i(生物素标记二抗)，37℃孵育20min，1×pbs洗5次，每次5min；滴加试剂ii(辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液)，37℃孵育20min，1×pbs洗五次，每次5min；dab显色2-5min，显微镜下掌握染色程度，自来水充分冲洗；苏木素复染2分钟，盐酸分化1-2s，返蓝3min，自来水充分冲洗；常规脱水、透明、封片。