一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及微生物菌剂，具体涉及一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

我国是世界农业大国，随着我国农业的飞速发展，化肥的使用量也越来越大，每年的用量达到180万吨。这虽然解决了粮食增产以及供应的问题，却造成了非常严重的环境问题。化肥的超量使用加重了土壤的板结与污染，导致土壤质量的下降与退化，这使得土壤有机质含量严重低于全球的平均水平。一旦土壤有机质含量低，将大幅降低对重金属固定的能力，增加了土壤重金属的危害性，危害了我国农业的可持续发展。

微生物菌剂是一种能优化土壤理化性质，提高作物对养分的吸收及利用效率，进而促进作物生长的新型农业生物制剂，它具有经济环保、改良土壤和肥料增效等效用。此外，还能增强作物的抗干旱，抗低温，抗高盐等抗逆能力。近年来，以微生物菌剂作为生物肥料的研究越来越多，特别是微生物液体菌剂具有生产成本低、使用方便、促生及抗逆效果明显等优点。

但因现有技术水平限制，目前市场上所售的微生物液体菌剂都存在有效菌数含量低，有效菌易失活等缺陷，特别是市售菌剂一旦拆封后，其有效菌含量将断崖式下跌，大大降低了菌剂的效用，增加了农民的使用成本。

技术实现要素：

发明目的：为了解决现有微生物液体菌剂有效菌含量低且易失活的问题，本发明提供了一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂，本发明进一步提供了微生物液体菌剂的制备方法，本发明更进一步地提供了微生物液体菌剂的应用。

技术方案：本发明所述一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂，包括如下质量百分比的组分：促生菌菌液1％-10％，聚谷氨酸0.1％-10％，生物有机质50％-70％，余量为水或水溶液；所述促生菌菌液包括骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)菌液。

优选地，促生菌菌液5％-10％，聚谷氨酸0.5％-8％，生物有机质50％-65％，余量为水或水溶液。

更优选地，促生菌菌液8％-10％，聚谷氨酸1％-5％，生物有机质55％-65％，余量为水或水溶液。

优选地，所述骆驼刺泛菌菌液为骆驼刺泛菌发酵液，发酵液中活菌数为1×10⁹-9×10¹⁰CFU/mL；所述骆驼刺泛菌其分类命名为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，菌株号为XK-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏编号为CGMCC NO.15525，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏中心，邮编100101。该菌株是发明人于2017年10月从浙西大峡谷选育的菌株。

骆驼刺泛菌XK-11具有下述性质：

1、菌落形态学特征

在LB培养基30℃培养16-24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.4-2.0μm，宽0.7-1.0μm。属于革兰氏阴性菌、具有鞭毛能够运动、兼性厌氧。在上述培养基中30℃培养12h菌体可以大量生长，菌落呈米黄色，圆形，表面光滑，粘状，中间凸起。其生长的温度范围是7-48℃，最适温度为35-39℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。具有氨苄霉素抗性(100μg/mL)，能在LB、R2A、NA、TSA、MC等培养基中正常生长。

2、16SrDNA序列分析

16SrDNA序列长度1488bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1。将16SrDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株XK-11与骆驼刺泛菌达到100％同源。所以认定本发明的菌株为骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)，菌株号为Pantoea alhagi XK-11。

其中，所述促生菌菌液还包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵液中的任意一种或几种的组合，枯草芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液中活菌数为1×10⁹-9×10¹⁰CFU/mL，促生菌在微生物液体制剂中的活菌数≥5×10⁹CFU/mL。促生菌菌液的添加量按照骆驼刺泛菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌中任意一种或组合的总和计算，微生物液体菌剂中有效活菌数≥5×10⁹CFU/mL。枯草芽孢杆菌、胶冻样芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌由高密度发酵所得，并通过冷藏法使菌体进入芽孢形态，芽孢状态是芽孢杆菌的休眠状态，在不萌发的状态下可存活几年及至几十年。

优选地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016264，胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016265，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016266，记载于专利2016106658324中。

优选地，所述促生菌菌液为骆驼刺泛菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和解淀粉芽孢杆菌发酵液的组合，其体积比为0.1-10:0.1-10:0.1-10:0.1-10。

其中，所述聚谷氨酸重均分子量为5-3000kDa，优选分子量为5-50kDa，所述聚谷氨酸为聚谷氨酸纯品、聚谷氨酸盐纯品、聚谷氨酸发酵液、聚谷氨酸发酵液干燥物和聚谷氨酸可湿性粉剂中的任意一种或几种的组合。聚谷氨酸的添加量以聚谷氨酸纯品、或聚谷氨酸盐纯品、或聚谷氨酸发酵液、或聚谷氨酸发酵液干燥物、或聚谷氨酸可湿性粉剂中所含的聚谷氨酸计算。上述聚谷氨酸的相关产品通过现有的发酵技术制备。当聚谷氨酸为聚谷氨酸发酵液时，微生物液体菌剂中聚谷氨酸的质量以发酵液中聚谷氨酸含量计算，水溶液即为聚谷氨酸发酵液(不包括其中的聚谷氨酸)。

聚谷氨酸是一种特殊的阴离子高分子聚合物，侧链含有大量羧基基团，这些基团赋予其特殊的生物活性，作为一种粘附性的物质，聚谷氨酸可为促生菌中芽孢杆菌提供夹膜保护，促使芽孢杆菌形成一种外在的包裹生物膜系统，由此隔断促生菌细胞内外的物质交换，达到一种平衡稳态。

其中，所述生物有机质为生化黄腐酸、糖蜜和酵母提取物中任意一种或几种的组合。生物有机质的添加量按照酵母提取物、糖蜜、生化黄腐酸中任意一种或组合的总和计算。上述生物有机质均可从市场购买或者按照现有技术制备。

其中，酵母提取物主要成分为多肽，氨基酸，微量元素等。

生物有机质在本发明使用比例下，可通过形成高渗透压环境来抑制芽孢杆菌的芽孢萌发，维持微生物液体菌剂中的芽孢杆菌处于芽孢状态。而当菌剂被稀释后施用于农作物时，生物有机质浓度降低，随即改变其“身份”，成为芽孢萌发及微生物增殖的营养成分。此外，生物有机质还可以改善土壤结构，降低土壤板结率，解决土壤酸化等问题。

本发明进一步提供所述微生物液体菌剂的制备方法，步骤如下：将促生菌菌液、聚谷氨酸和生物有机质按照质量百分比混匀，即得微生物液体菌剂。

其中，骆驼刺泛菌发酵液的制备步骤如下：骆驼刺泛菌接种于LB培养基中活化12-24h，活化温度为25-35℃，将活化的骆驼刺泛菌接种于液体发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液；所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0。

其中，枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备步骤如下：

将斜面保存的促生菌接种于活化培养基上，培养18-24h；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30-35℃培养12-24h，将发酵液或发酵液浓缩液置于4℃冷库中低温处理35-55h；所述活化培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0-8.0，所述溶剂为水。所述发酵培养基的配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-40g/L，无机盐0.01-50g/L，溶剂为水，pH5.0-9.0。

骆驼刺泛菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液或单独保存，或按比例混合保存。

优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中任意一种或几种的组合。

本发明更进一步提供所述微生物液体菌剂在提高农作物产量、提升农作物品质、增强农作物抗逆性中任意一种或几种中的应用。

其中，所述微生物液体菌剂可与传统化学肥料配合使用，也可作为菌肥直接施用；将微生物液体菌剂稀释10-1000倍，通过水培、喷施或灌根处理农作物。

所述农作物为粮食作物、蔬菜类作物或瓜果类作物。

有益效果：(1)聚谷氨酸在微生物液体菌剂中为促生菌提供荚膜保护，并使芽孢杆菌形成生物薄膜系统，达到一种稳定平衡态，使其处于芽孢状态；聚谷氨酸由微生物发酵产生，由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过谷氨酰胺键均聚而成，具有无毒、生物可降解和环境友好等优点，具有提高植物对养分的吸收等功效。(2)当微生物液体菌剂处于包装状态时，生物有机质通过提供高有机质环境和高渗透压环境抑制促生菌的生长，从而使得促生菌处于休眠状态；当微生物液体菌剂被稀释施用时，有机质又可为促生菌的生长提供营养，促进促生菌的快速增殖；当生物有机质与聚谷氨酸复合使用时，除具有营养增效功能外，主要通过协同效应维持液体菌剂中促生菌的活力，大大延长了微生物液体菌剂的货架期，使微生物液体菌剂中的促生菌的活菌数量在24个月内维持≥5×10⁹CFU/mL。(3)本发明中所述的四种微生物，施加到农作物中能改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中有益微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够提高作物产量，增强作物抗旱、抗盐、抗病、抗寒等抗逆能力。

附图说明

图1为不同菌剂的活菌数量存活曲线。

具体实施方式

本发明所述一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂，包括如下质量百分比的组分：促生菌菌液1％-10％，聚谷氨酸0.1％-10％，生物有机质50％-70％，余量为水或水溶液；所述促生菌菌液包括骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)菌液。

优选地，促生菌菌液5％-10％，聚谷氨酸0.5％-8％，生物有机质50％-65％，余量为水或水溶液。

更优选地，促生菌菌液8％-10％，聚谷氨酸1％-5％，生物有机质55％-65％，余量为水或水溶液。

优选地，所述骆驼刺泛菌菌液为骆驼刺泛菌发酵液，发酵液中活菌数为1×10⁹-9×10¹⁰CFU/mL；所述骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.15525。

其中，所述促生菌菌液还包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵液中的任意一种或几种的组合，枯草芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液或解淀粉芽孢杆菌发酵液中活菌数为1×10⁹-9×10¹⁰CFU/mL，促生菌在微生物液体制剂中的活菌数≥5×10⁹CFU/mL。促生菌菌液的添加量按照骆驼刺泛菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌中任意一种或组合的总和计算，微生物液体菌剂中有效活菌数≥5×10⁹CFU/mL。枯草芽孢杆菌、胶冻样芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌由高密度发酵所得，并通过冷藏法使菌体进入芽孢形态，芽孢状态是芽孢杆菌的休眠状态，在不萌发的状态下可存活几年及至几十年。

优选地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016264，胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016265，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2016266，记载于专利2016106658324中。

优选地，所述促生菌菌液为骆驼刺泛菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液和解淀粉芽孢杆菌发酵液的组合，其体积比为0.1-10:0.1-10:0.1-10:0.1-10。

其中，所述聚谷氨酸重均分子量为5-3000kDa，优选分子量为5-50kDa，所述聚谷氨酸为聚谷氨酸纯品、聚谷氨酸盐纯品、聚谷氨酸发酵液、聚谷氨酸发酵液干燥物和聚谷氨酸可湿性粉剂中的任意一种或几种的组合。聚谷氨酸的添加量以聚谷氨酸纯品、或聚谷氨酸盐纯品、或聚谷氨酸发酵液、或聚谷氨酸发酵液干燥物、或聚谷氨酸可湿性粉剂中所含的聚谷氨酸计算。上述聚谷氨酸的相关产品通过现有的发酵技术制备。当聚谷氨酸为聚谷氨酸发酵液时，微生物液体菌剂中聚谷氨酸的质量以发酵液中聚谷氨酸含量计算，水溶液即为聚谷氨酸发酵液(不包括其中的聚谷氨酸)。

聚谷氨酸是一种特殊的阴离子高分子聚合物，侧链含有大量羧基基团，这些基团赋予其特殊的生物活性，作为一种粘附性的物质，聚谷氨酸可为促生菌中芽孢杆菌提供夹膜保护，促使芽孢杆菌形成一种外在的包裹生物膜系统，由此隔断促生菌细胞内外的物质交换，达到一种平衡稳态。

其中，所述生物有机质为生化黄腐酸、糖蜜和酵母提取物中任意一种或几种的组合。生物有机质的添加量按照酵母提取物、糖蜜、生化黄腐酸中任意一种或组合的总和计算。上述生物有机质均可从市场购买或者按照现有技术制备。

其中，酵母提取物主要成分为多肽，氨基酸，微量元素等。

生物有机质在本发明使用比例下，可通过形成高渗透压环境来抑制芽孢杆菌的芽孢萌发，维持微生物液体菌剂中的芽孢杆菌处于芽孢状态。而当菌剂被稀释后施用于农作物时，生物有机质浓度降低，随即改变其“身份”，成为芽孢萌发及微生物增殖的营养成分。此外，生物有机质还可以改善土壤结构，降低土壤板结率，解决土壤酸化等问题。

实施例1促生菌的发酵

按如下步骤制备本发明所述微生物菌剂：

将4℃斜面保存的骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)CGMCC NO.15525接种于茄形培养瓶培养基(即活化培养基)上，30℃培养16h。挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30℃，培养40h，将发酵液或者发酵液浓缩液置于4℃冷库中低温处理48h，经平板涂布测定，骆驼刺泛菌发酵液中的活菌数量可达到1×10¹⁰CFU/mL以上。所述茄形培养瓶中的培养基为LB培养基；发酵培养基组分为：蔗糖50g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 8g/L，蛋白胨8g/L，pH为6.0-8.0。

将4℃斜面保存的枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016264、胶冻样芽胞杆菌CCTCCNO:M 2016265、解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016266活化，分别接种于茄形培养瓶培养基(即活化培养基)上，30℃培养18h。将长好的菌种分别转移至发酵培养基中，30℃培养24h后，将发酵液置于4℃冷库中低温处理48h，经平板涂布测定，每种微生物发酵液中的活菌数量可达到1×10¹⁰CFU/mL以上。所述茄形培养瓶中的培养基为LB培养基，发酵培养基组分为：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 0.05g/L，NaCl 1g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，pH为6.0-8.0。

将四种微生物菌剂按照体积比1:1:1:1的比例混匀复配。

以上所述的生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为0.6vvm，搅拌速度为220rpm。

实施例2复合微生物菌剂的制备

按照如下方法制备本发明的含聚谷氨酸、生物有机质、促生菌剂组合的复合微生物液体菌剂：

1)聚谷氨酸采用发酵法制备(参考文献Xu Z,Feng X,Dan Z,et al.Enhanced poly(γ-glutamic acid)fermentation by Bacillus subtilis,NX-2immobilized in an aerobic plant fibrous-bed bioreactor[J].Bioresour Technol,2014,155:8-14)，发酵液经浓缩后聚谷氨酸含量为15％；

2)糖蜜由制糖厂采购；

3)将实施例1的复合促生菌菌液与聚谷氨酸发酵浓缩液、糖蜜按照质量比为1:2.5:6.5的比例混合均匀，制备得到本发明所述的复合微生物菌剂，经检测，聚谷氨酸含量质量百分比为4.0％，有机质含量质量百分比为63％，有效活菌数为7.6×10⁹cfu/mL。

实施例3复合微生物液体菌剂可开放保存长达24个月

本实施例中所用的菌剂如下所示：

1)将实施例1中制备得到的混合菌剂稀释至有效活菌数为7.6×10⁹cfu/mL，作为菌剂1；

2)将实施例1中的混合菌剂与聚谷氨酸发酵浓缩液按比例混合，使聚谷氨酸含量为4.0％，有效活菌数为7.6×10⁹cfu/mL，作为菌剂2；

3)将实施例1中的混合菌剂与糖蜜按比例混合均匀，使有机质含量为63％，有效活菌数为7.6×10⁹cfu/mL，作为菌剂3；

4)将实施例1制备得到的混合菌剂与聚谷氨酸、糖蜜按比例混合均匀，使聚谷氨酸含量为4.0％，有机质含量为15％，有效活菌数为7.6×10⁹CFU/mL，作为菌剂4；

5)将实施例2制备的含聚谷氨酸、生物有机质与促生菌的复合微生物液体菌剂，即本发明所述复合微生物液体菌剂，作为菌剂5。

将上述5种菌剂置于25℃，相对湿度40％的环境下储藏，每隔2个月各取1mL菌剂，稀释10⁸倍，涂布固体LB培养基中，置于32℃环境下，培养18-24h，利用平板计数法获取有效活菌数量，连续取样24个月。设三组平行实验，不同菌剂中有效活菌数随时间变化如图1所示。

由图1可知，菌剂1、菌剂2、菌剂3、菌剂4其有效活菌数量仅维持8个月、12个月、14个月与14个月，均未能达到24个月的标准。菌剂5，即复合微生物液体菌剂的有效活菌数量在24个月前均达到≥5×10⁹cfu/mL的水平。由此可见，本专利保护的复合微生物液体菌剂的有效期可长达24个月。

实施例4复合微生物液体菌剂可以减少化肥的施用

本实施例中的含聚谷氨酸、生物有机质与促生菌的复合微生物液体菌剂制备同实施例2。以盆栽小白菜为实验对象，试验设3个处理，每个处理3次重复，其中处理1为试验对照普通肥料，处理2为普通肥料+复合微生物液体菌剂，处理3为减施40％质量的普通肥料+复合微生物液体菌剂。所施加的肥料为每千克土150mg，复合微生物液体菌剂的用量为每千克土0.2mL，结果见表1。

表1复合微生物液体菌剂对盆栽小白菜生长特性及产量的影响

本发明中含聚谷氨酸、生物有机质、促生菌的复合微生物液体菌剂与肥料混施，能够促进小白菜根部的发育，使根增粗、增大，对小白菜植株株高、地下部鲜重、地上部鲜重都有明显的促进作用，可增产54.8％。当减施40％质量的肥料时，依然可以对白菜产量提高20.8％，这说明本发明中聚谷氨酸、生物有机质、促生菌剂的复合微生物液体菌剂可以促进植物生长，并且有效的减少化肥的使用量。

实施例5复合微生物液体菌剂显著提高农作物的品质

本实施例中的含聚谷氨酸、生物有机质与促生菌的复合微生物液体菌剂制备同实施例2。以甜瓜为实验对象，试验共设3个处理，每个处理3次重复。处理1为施加普通复合肥(450kg/ha²)，处理2为施加普通复合肥(450kg/ha²)+复合微生物液体菌剂(6L/ha²)，处理3为减少施用40％质量的普通复合肥+复合微生物液体菌剂(315kg/ha²)，甜瓜管理为日常管理，结果见表2。

表2复合微生物液体菌剂对甜瓜Vc和硝酸盐含量的影响

与处理1相比，复合微生物液体菌剂可以提高Vc含量48.8％，降低硝酸盐含量24.3％。当减少施用40％质量的复合肥时，复合微生物液体菌剂可以提高Vc含量29.3％，降低硝酸盐含量46.6％，提高甜瓜的品质。试验结果表明，本发明中的复合微生物液体菌剂不但可以减少化肥的使用量，而且还能显著提高甜瓜的品质。

实施例6复合微生物液体菌剂显著提高植物的抗逆能力

本实施例中的含聚谷氨酸、生物有机质与促生菌的复合微生物液体菌剂的制备同实施例2。以小青菜为实验对象，进行盆栽，实验共设3个处理，每个处理3次重复。控水方法采用Hsiao(1973)中生植物水分梯度划分法，处理1为对照75％-80％(占土壤最大持水量的百分数)，处理2为中度胁迫40％-45％，处理3为重度胁迫30％-35％。对盆栽小青菜进行正常管理，试验观测前控制水分，达到3个水分梯度时，在处理2、处理3添加复合微生物液体菌剂，施加量为每千克土0.2mL。期间每天测定土壤容积含水量，补充当天失去的水分，使各处理水平达到设定的含水量，实验结果见表3。

表3复合微生物液体菌剂对小青菜叶绿素和鲜重的影响

结果显示：在中度干旱的环境条件下，通过施加复合微生物液体菌剂，与对照组相比，小青菜可增产23.2％，在重度干旱的环境条件下，通过施加复合微生物液体菌剂，小青菜产量与对照组相比仍能提高11.0％。实验结果表明，复合微生物液体菌剂能提高植物的抗旱能力，从而促进植物的生长。

序列表

<110> 南京轩凯生物科技有限公司

<120> 一种含骆驼刺泛菌的微生物液体菌剂及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> Pantoea alhagi

<400> 1

tctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacaggg 60

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