本发明属于分子育种
技术领域：
，具体涉及到一种白菜haucms不育胞质特异分子标记及其应用。
背景技术：
十字花科蔬菜是我国大宗蔬菜中栽培面积最大的一类，杂种优势利用是十字花科蔬菜增产的主要方法之一。细胞质雄性不育作为杂种优势利用的主要途径之一，在十字花科蔬菜生产上得到了很大应用。在白菜育种过程中细胞质雄性不育的利用可以降低育种成本，提高育种效率。目前国际上已报道的十字花科作物细胞质雄性不育类型主要包括polcms、ogucms、napcms、oxacms、haucms等，其中应用最广泛的是polcms和ogucms细胞质雄性不育系统。随着测序技术的发展，十字花科作物中polcms、napcms、ogucms、haucms等的线粒体基因组都已经测序完成(handa,2003；changetal,2011；chenetal,2011；tanakaetal,2012；hengetal,2014)。为了能够在分子水平鉴定haucms胞质，通过线粒体基因组对比，开发了haucms胞质特异的线粒体dna分子标记，用以快速准确地鉴定该胞质类型。通过线粒体基因组序列信息开发的分子标记，使之与常规育种技术更加有效地结合，为开展白菜生物技术的育种研究。这些胞质特异的标记不仅可以用来指导白菜不育胞质分类分析、指导细胞质雄性不育系和保持系的选育。为利用分子标记辅助技术高效、稳定地鉴定haucms不育系提供了可能。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种白菜haucms不育胞质特异分子标记，以及用于特异性扩增所述分子标记的引物(见表1)。所述分子标记为haucms-specific和haucms-deletion，分子标记haucms-specific的序列如seqidno:1所示，分子标记haucms-deletion的序列如seqidno:2所示。表1用于白菜haucms不育胞质分子检测的分子标记引物引物名称引物序列(5’-3’)haucms-specific-lagcacactcctagcgaagcahaucms-specific-raacaaacccttaccctagcthaucms-deletion-ltcaaccccaacgagaaacathaucms-deletion-rttcttggctttgtggaccct本发明的另一目的在于提供含有上述引物的试剂盒；所述的试剂盒可用于白菜胞质类型鉴定上，主要用于鉴定白菜中haucms不育胞质，将该胞质与ogucms、polcms、oxacms、orf220cms、榨菜orf220cms等胞质类型进行区分；试剂盒还可用于白菜haucms不育系和保持系选育上；试剂盒又可用在白菜haucms胞质雄性不育系纯度鉴定上。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：根据已经完成测序的haucms胞质、polcms胞质、nap胞质、ogucms胞质类型的线粒体基因组信息，通过序列对比找到两条dna序列，其中一条是haucms胞质线粒体基因组特异的序列，序列信息如seqidno:1所示；另一条是haucms胞质线粒体基因组缺失、但是polcms胞质、nap胞质、ogucms胞质的线粒体基因组共有的序列，序列信息如seqidno:2所示。根据这两条特异序列开发设计引物，得到2对scar分子标记，分别命名为haucms-specific和haucms-deletion，用于鉴定白菜haucms不育胞质。pcr预期结果是分子标记haucms-specific的引物仅在haucms不育胞质的材料中能够扩增出条带，在其他不育类型的材料中不能扩增出条带；分子标记haucms-deletion的引物仅不能在haucms不育胞质的材料中扩增出条带，在其他不育类型的材料中能扩增出条带。由于在白菜和芥菜等十字花科蔬菜中目前应用的细胞质雄性不育类型除目前已经报道的线粒体基因组外，还包括oxacms、榨菜orf220cms等线粒体基因组测序结果没有公布的胞质类型。因此，在检测这两对新开发标记实用性的过程中，总共用到了6种不同胞质类型材料的dna(haucms、napcms、ogucms、polcms、oxacms和榨菜orf220cms的dna)。当用分子标记haucms-specific的引物对6种不同类型胞质的材料进行鉴定时，仅有haucms特异胞质的不结球白菜m119a能够扩增出目的条带，但是其他上述类型的胞质材料中没有目的条带；当用分子标记haucms-deletion的引物对6种不同类型胞质的材料进行鉴定时，仅有haucms特异胞质的不结球白菜m119a不能扩增出目的条带，但是其他上述类型的胞质材料中均能扩增出条带。利用以上所述的分子标记(haucms-specific和haucms-deletion)可以快速有效地鉴定白菜haucms不育胞质，并将其和其他白菜、芥菜等蔬菜中常用的不育胞质区分开。本发明的有益效果在于：1.本发明基于已经测序的haucms胞质和polcms胞质、nap胞质、ogucms胞质类型的线粒体基因组序列信息，获得白菜haucms不育胞质特异的分子标记。2.本发明开发的两对haucms不育胞质特异的分子标记是在之前线粒体基因组比对的基础上，根据haucms线粒体基因组开发的新标记。结果表明，这两对标记具有高效性、稳定性、互补性等优点。3.本发明提供的2对特异的分子标记组合可有效的用于白菜胞质类型鉴定、白菜细胞质雄性不育系和保持系的选育、白菜haucms不育系纯度鉴定。附图说明图1为实施例1中2对分子标记的引物对白菜、榨菜、芥菜中6种不同胞质类型pcr扩增情况。a：分子标记haucms-specific引物的pcr扩增结果；b：分子标记haucms-deletion引物的pcr扩增结果。1.不结球白菜haucms不育系(m119a)；2.不结球白菜haucms的保持系(103b)；3.不结球白菜ogucms不育系(30a)；4.不结球白菜polcms不育系(h201a)；5.榨菜orf220cms不育系；6.芥菜oxacms不育系(201a)。图2为实施例2中2对分子标记的引物区分不结球白菜m119a不育系和保持系的结果。1～3.不结球白菜haucms不育系(m119a)；4～6.不结球白菜haucms的保持系(103b)。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。以下实施例中未注明具体条件的方法，通常按照试剂生产商提供的操作手册中方法，或者按照《分子克隆：实验室指南》(newyork:coldspringharborlaboratory,1989)中所述的方法进行操作。实施例1白菜haucms不育胞质特异分子标记的开发及验证：1.1白菜haucms不育胞质特异分子标记和缺失标记的开发首先在ncbi数据库中将已经测序完成的haucms胞质线粒体基因组序列(kf736092)，nap胞质线粒体基因组序列(ap006444)，polcms胞质线粒体基因组序列(fr715249)，ogucms胞质线粒体基因组序列(ab694744)提取出来。利用progressivemauve和blast软件对这些线粒体基因组序列进行比对分析，从中提取到一条haucms胞质线粒体基因组特异的序列(seqidno:1)和另一条haucms胞质线粒体基因组缺失、但其他几种胞质的线粒体基因组共有的序列(seqidno:2)。根据提取的序列设计了白菜haucms不育胞质特异分子标记和缺失分子标记，利用oligo6软件设计分子标记的引物，引物序列见表1。1.2特异引物的验证本发明用于验证特异引物的材料为：m119a为不结球白菜haucms不育系(hengetal.,2015)；103b为不结球白菜haucms不育系的保持系(hengetal.,2015)；30a为不结球白菜ogucms不育系(hengetal.,2015)；h201a为不结球白菜polcms不育系(hengetal.,2015)；榨菜orf220cms不育系(yangetal.,2010)；201a为芥菜oxacms不育系(hengetal.,2018)。利用ctab法提取所选取材料的总dna。然后，利用设计好的引物对已知胞质材料进行pcr扩增验证。pcr扩增程序：94℃总变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，28cycles；72℃延伸10min。扩增完成后，扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。pcr扩增产物经ta克隆，测序，结果与seqidno:1和no:2相同。pcr扩增结果显示：用分子标记haucms-specific的引物(haucms-specific-l和haucms-specific-r)对以上6种不同类型胞质的材料的dna进行扩增时，仅含haucms特异胞质的不结球白菜m119a能够扩增出目的条带，上述其他类型的胞质材料没有扩增到目的条带；当用分子标记haucms-deletion的引物(haucms-deletion-l和haucms-deletion-r)对以上6种不同类型胞质的材料进行扩增时，仅在不结球白菜m119a不能扩增出目的条带，但是其他上述类型的胞质材料中均能扩增出条带。结果显示：haucms-specific为haucms胞质特异的标记；haucms-deletion为haucms胞质缺失的标记。实施例2不结球白菜m119a不育系和保持系材料的区分以及不育系种子纯度鉴定：利用分子标记haucms-specific的引物(haucms-specific-l和haucms-specific-r)对不结球白菜m119a(haucms不育系)和不结球白菜103b(haucms保持系)的胞质类型进行区分。不结球白菜m119a和103b每个材料取三次重复，分别提取叶片总dna进行pcr扩增。pcr扩增程序：94℃变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，28cycles；72℃延伸10min。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图2所示，仅haucms不育系m119a中能够扩增出目的条带，但是在其保持系103b没有条带的扩增。说明haucms-specific标记能够将白菜haucms不育系和保持系区分开。在此基础上，利用该分子标记对种植在育种实验田的haucms不育系进行了种子纯度鉴定。pcr扩增过程如上所述，对实验田的650株不育系进行了pcr检测，结果显示其中的22株没有扩增出条带；另有628株检测时，均扩增出了条带，推定为小白菜haucms不育系。因此，在苗期将22株没有扩增出条带的杂株进行拔出，以提高不育系的纯度。以上所述之实施例，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本
技术领域：
的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。sequencelisting<110>信阳师范学院<120>一种白菜haucms不育胞质特异分子标记及其应用<130>无<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1391<212>dna<213>白菜<400>1agcacactcctagcgaagcaaccaaaagagtagtttagcggctgccttctaattcctagg60ttcttacctgtttcgtaaaccaggactcttatccagcacactagggtgcctgttttcctc120ttctgctatttcctgttttcctgttctgctaatagtacgcaagtcaaggtcttctgtttt180gtgtgcaattaaatcccatttgacaaaactcttagatactcagcacagaccttcaagggt240tttctcaactcgatttcttaacagaagaatggccatacaaagaggattggtatgtttcga300aatgtgacagaaaagccaatctaataggcattcctactataagagtagtgtgctggagtt360gagctctttgtttaagataggaatcccaggagttcagcagcacatcaatcgattaaaggc420agataaaaggcatctgagatgagatggataagccaggctagtatgttttggtaatagcac480actgctgtgaagctggtttgtagttcttagactagctagggagtaatgcgttagccgtat540tcctagtggagcacactgatgtacgagacaggggtaggaagattcctccctaacttctga600tctgtaactagaactctttttttgttggcggtgtgctgcaggtgagttccttgttctttc660tagtatggagtaaaccttgtcctattccttttcataggtaggtaaaaagtgaagggttcc720tcttttaggcttttaaggcagctaattgctgaggtgggagttgaacaaatagggagactt780atctgaattcctaggtatgggcagctagagctagtaagggttgtaatagctagggagtta840gcagccctaagagctgcattcctaagtatgggttggtccagcacaccgcagtgtgttgga900agctctgtttgtttcctttcctaatagctctgtttgtttcctttcagcacacttagctaa960agagttatctctagtattcagttgtgtgctgaagatgaatccctaaggctagtacttcta1020tccagcacaccgaaagggtagttctgttcctttctttcagccagtcttataatctgacta1080tctatgttacccctagtaataagttgtaagattactccccaccgggatgcagccacaccg1140ggtgtgctctccttcatctttcataggtagctttataaagagtactagctagggagttag1200ccttggcagtattcctaagtatagatgtgggaatgttctaagcgatagtaagatgacata1260ggtgcccggccagcacaccgctgctttagtgaggctggaaactctttcctttcctcttcc1320ttagattctttagaagctggtattttcagaagtagtagaattgaattctttagctagggt1380aagggtttgtt1391<210>2<211>378<212>dna<213>白菜<400>2tcaaccccaacgagaaacatcctttctagtgtgttcaatcccacctttcatcaactgttg60tttctctgtcccttttcgttctcctctctctcttcttcgttccgagttggtttgcaaacc120atggaggatcaaccttctattgcattacagttggttaaacagctatcccttaccgtacat180catactattcgtctcttccttcgctgtaatcttccttttattcctgatcttttgcagctc240cattcgtttgttgttattgtttgtcgtcggttattcggatcttctgagccaggatcaaat300ctgtgtgagcggggcaaagacacctgtttgttccccgagctactaaagctggtttagaag360ggtccacaaagccaagaa378<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3agcacactcctagcgaagca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4aacaaacccttaccctagct20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcaaccccaacgagaaacat20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ttcttggctttgtggaccct20当前第1页12