本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型(cphv-1)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
背景技术
山羊疱疹病毒ⅰ型(caprineherpesvirus1，cphv-1)属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科水痘病毒属的双链dna病毒。该病毒感染新生羔羊后表现为严重感染，主要症状为发热、结膜炎、眼分泌物增多、呼吸困难、肠道溃疡性和坏死性病变，并伴随着较高的发病率和死亡率。成年山羊感染后表现为亚临床感染，可导致产生不同的症状，包括呼吸系统疾病、发热和白细胞减少，外阴阴道炎和包皮龟头炎。怀孕3至4个月的山羊感染后可诱发流产。1974年，cphv-1首先在美国加利福尼亚表现为肠炎的新生羔羊病料中分离到，此后相继在欧洲、大洋洲及南美洲出现该病毒的流行，严重危害养羊业的发展。此前我国一直没有该病毒感染存在的报道，本实验室首次在2014年在表现为严重呼吸道感染的山羊鼻拭子样本中分离到该病毒。目前我国尚无针对该病毒批准上市的疫苗和药物，因此，迫切需要研制针对我国流行毒株感染的药物。
cphv-1感染的诊断方法有pcr检测和病毒分离鉴定实验。这些方法固然有实用性，但是也存在很多弊端。pcr方法是较为常用的鉴定方法，用于检测病毒的核酸，虽然具有一定的敏感性和特异性，但是容易出现假阳性。病毒分离鉴定实验是通过细胞分离培养取得毒株，然后进行一系列的分子生物学鉴定，虽然经典，但该方法耗费的时间较长。因此，建立特异快捷的鉴别诊断方法对于降低cphv-1感染的发病率至关重要。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明建立了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库。
进一步地，本发明建立了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库，所述杂交瘤细胞库稳定分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体。
进一步地，本发明建立了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库，所述杂交瘤细胞库采用cphv-1病毒作为免疫原，免疫雌性balb/c小鼠，并使小鼠骨髓瘤细胞与免疫后的雌性balb/c小鼠融合而获得。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中细胞融合采用包括但不限于peg细胞融合的方法进行。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，细胞融合采用peg2000进行。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中在细胞融合前加强免疫。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中在细胞融合前3天加强免疫。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中采用超速离心山羊疱疹病毒ⅰ型作为免疫原，进行至少一次免疫，并在细胞融合前加强免疫。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中采用超速离心山羊疱疹病毒ⅰ型作为免疫原，进行至少一次免疫，并在细胞融合前3天加强免疫。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，在细胞融合前对小鼠骨髓瘤细胞进行预处理，保证小鼠骨髓瘤细胞生长良好。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，在细胞融合前对小鼠骨髓瘤细胞进行预处理，优选使小鼠骨髓瘤细胞生长至对数期。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，所述方法包括对小鼠骨髓瘤细胞与免疫后的balb/c小鼠脾细胞进行或不进行预融合处理。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，对小鼠骨髓瘤细胞与免疫后的balb/c小鼠脾细胞进行预处理包括将小鼠骨髓瘤细胞与免疫后的balb/c小鼠脾细胞以1:3-1:5的比例充分混匀。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，细胞融合过程中，采用由慢到快的速度加入预热至37℃的培养基。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，在细胞融合后7天进行半换液，所用换液培养基为含hat和20％fbs的rpmi-1640培养基。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中杂交瘤细胞根据样本od值进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中杂交瘤细胞根据阳性血清与阴性血清的od比值进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用酶联免疫吸附测定方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，至少一次采用酶联免疫吸附测定方法对杂交瘤细胞进行至少一次的筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用秋水仙素法检测分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株的染色体。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，检测杂交瘤细胞株的染色体时，采用甲醇：冰醋酸为3:1作为固定液。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用酶联免疫吸附测定方法和秋水仙素染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用至少一次酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用至少一次酶联免疫吸附测定方法和秋水仙素染色体检测方法对杂交瘤细胞进行至少一次筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，根据血清od值、酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，根据阳性血清与阴性血清的od比值、酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，根据阳性血清与阴性血清的od比值、酶联免疫吸附测定方法和秋水仙素染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，根据血清od值、至少一次酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用间接免疫荧光试验对杂交瘤细胞的特异性进行检测。
进一步地，本发明提供了一种建立分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的方法，其中，采用多次连续培养传代、液氮冻存与复苏试验、间接酶联免疫吸附测定方法连续检测杂交瘤细胞的稳定性。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中根据血清od值对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中根据阳性血清与阴性血清的od比值对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中采用酶联免疫吸附测定方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中至少一次采用酶联免疫吸附测定方法对杂交瘤细胞进行至少一次的筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中采用酶联免疫吸附测定方法和染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中采用酶联免疫吸附测定方法和秋水仙素染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选方法，其中根据阳性血清与阴性血清的od比值、酶联免疫吸附测定方法和秋水仙素染色体检测方法对杂交瘤细胞进行筛选。
进一步，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccno：c2018150，分类命名：杂交瘤细胞株4a4。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株的染色体检测方法，所述方法采用秋水仙素进行。
进一步地，本发明提供了一种抗山羊疱疹病毒ⅰ型的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞制备。
进一步地，本发明提供了一种抗山羊疱疹病毒ⅰ型的单克隆抗体，所述单克隆抗体由含有上述杂交瘤细胞的小鼠腹水制备。
进一步地，本发明提供了一种间接免疫荧光检测方法，所述方法采用如上所制备的单克隆抗体进行。
进一步地，本发明提供了一种山羊疱疹病毒ⅰ型的检测方法，所述方法采用如上所制备的单克隆抗体进行。
进一步地，本发明提供了一种检测山羊疱疹病毒ⅰ型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所制备的单克隆抗体。
进一步地，本发明提供了一种抗山羊疱疹病毒ⅰ型的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括建立一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库。
进一步地，本发明提供了一种抗山羊疱疹病毒ⅰ型的单克隆抗体的制备方法，所述方法采用如上所述的杂交瘤细胞进行。
进一步地，本发明提供了一种山羊疱疹病毒ⅰ型的诊断试剂，所述诊断试剂包括如上所制备的单克隆抗体。
进一步地，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞库的建立方法，所述方法采用山羊疱疹病毒ⅰ型强毒株为抗原，免疫balb/c小鼠。
进一步地，本发明提供了一种用于间接免疫荧光检测的抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体，所述单克隆抗体采用如上所述的方法制备。
进一步地，本发明提供了一种抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体，所述单克隆抗体保存两年后中和效价不降低。
进一步地，本发明提供了一种山羊疱疹病毒ⅰ型治疗剂，所述治疗剂包括如上所制备的单克隆抗体。
进一步地，本发明提供了一种山羊疱疹病毒ⅰ型治疗剂，所述治疗剂包括如上所制备的单克隆抗体和稳定剂。
进一步，本发明提供了一种分泌抗山羊疱疹病毒ⅰ型单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的中和效价高达28。
进一步地，本发明提供了一种igg2aκ亚类单克隆抗体的制备方法，其中所述igg2aκ亚类单克隆抗体采用如上所述的杂交瘤细胞库制备。
进一步地，本发明提供了一种igg2aκ亚类单克隆抗体的制备方法，其中所述igg2aκ亚类单克隆抗体采用如上所述的杂交瘤细胞制备。
进一步地，杂交瘤细胞株的建立是用从国内临床病料中分离的cphv-1强毒株为抗原，免疫balb/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术建立的cphv-1特异单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。用该杂交瘤细胞4a4株制备的小鼠腹水，经病毒中和试验证明其具有较高的中和效价，制备成治疗剂，应用于cphv-1发病动物的临床治疗，效果显著。用该杂交瘤细胞4a4株制备的小鼠腹水，制备成检测试剂，作为检测抗体，应用于cphv-1感染的间接免疫荧光检测，灵敏度高，特异性强。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明使用的cphv-1免疫原是从表现为严重呼吸道感染的羊群中分离到的新型cphv-1国内流行强毒株jsha1405。
2、首次建立了89株分泌cphv-1单克隆抗体的杂交瘤细胞库，并从中筛选出一株杂交瘤细胞4a4株，用其制备的小鼠腹水抗体对cphv-1的病毒中和效价高达28。
3、本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，用于cphv-1发病羊的临床治疗，治愈率达90％，疗效显著，安全无不良反应。于-20℃保存两年后抗体中和效价不降低，稳定性好。
4、利用本发明杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为检测抗体建立的间接免疫荧光(ifa)检测方法，具有较好的灵敏性和特异性，可以用于cphv-1的鉴别诊断。
附图说明
为更好地对本发明进行说明，提供了以下附图，所提供的附图仅用于说明本发明，而非对本发明进行限制：
图1示出了根据本发明，采用间接免疫荧光(ifa)方法检测单克隆抗体对cphv-1的特异性试验结果图：a：感染cphv-1后mdbk细胞检测结果，b：感染边界病病毒后mdbk细胞检测结果，c：正常mdbk细胞检测结果。
图2示出了根据本发明，采用间接免疫荧光(ifa)方法检测牛肾细胞系(mdbk)细胞样品的检测结果图：a：感染cphv-1后mdbk细胞检测结果，b：正常mdbk细胞检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及说明书附图，对本发明作进一步的说明，而非对本发明进行限制。
实施例1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1、cphv-1抗原的制备
发明人从表现为严重呼吸道感染的羊群中分离到一株新型cphv-1国内流行强毒株jsha1405(郝飞等，山羊疱疹病毒ⅰ型疫苗株及其应用[p].江苏：cn107893056a，2018-04-10)，该毒株与国外流行毒株存在较大变异，仅就gb基因而言，国外流行毒株共编码919个氨基酸，而国内流行毒株jsha1405gb基因编码920个氨基酸，且发生了11个氨基酸位点的突变。将毒株按0.01-0.1moi接种70％汇合度的mdbk细胞(购自中国兽医药品监察所)，置于37℃、5％co2细胞培养箱中避光培养，在接毒后48h收集细胞培养物，反复冻融3次后离心取上清液，40000g超速离心2h，弃上清，沉淀用适量pbs过夜溶解。
2、动物免疫
将上述cphv-1超离病毒作为免疫原，背部皮下多点注射免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，共免疫3次，每次免疫间隔2周。首次免疫使用100μl超离病毒与等体积弗氏完全佐剂(购自sigma公司)混合免疫，后两次均使用100μl超离病毒与等量弗氏不完全佐剂(购自sigma公司)混合免疫。三次免疫小鼠后14d断尾采血，分离血清，采用间接elisa方法测定所得抗血清的抗体效价，选取血清抗体效价﹥106的小鼠，在细胞融合实验前3d用不加佐剂的超离病毒经腹腔注射加强免疫(100μl/只)。
3、细胞融合
采用peg细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)与上述免疫的balb/c小鼠脾细胞按1:3-1:5的比例，充分混匀，2000rpm，25℃离心5min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置于37℃水浴预热，在1min内加完37℃的peg2000(购自sigma公司)0.8ml，边加边轻轻振荡，然后在5min内按照1ml/min、2ml/min、3ml/min、3ml/min、3ml/min分别加入12ml预热至37℃的无血清rpmi-1640培养基，37℃静置10min，2000rpm25℃离心5min，弃上清，加入含20％胎牛血清(fbs)(购自北京全式金生物技术有限公司)和hat(购自sigma公司)的rpmi-1640培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔板上，于5％co2细胞培养箱培养。培养7d后，用含hat和20％fbs的rpmi-1640培养基换液一半，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
4、杂交瘤细胞的筛选
用0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以稀释500倍的cphv-1超离病毒包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；以含1％bsa(购自sigma公司)的pbst封闭每孔，200μl/孔，37℃放置2h，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg(购自北京全式金生物技术有限公司)，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；加入tmb底物，100μl/孔，室温避光显示10min；每孔加入50μl2mol/l硫酸终止反应。经酶标仪测定od450nm值，以空白对照调零，p为各检测孔的值，n为阴性血清的od450nm值，当阴性血清的od450nm值≤0.1，且阳性参考血清的od450nm值与阴性参考血清的od450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，p/n≥2.1的检测孔判为阳性，隔2-3d后再次检测，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。
5、杂交瘤细胞的克隆化
首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含20％fbs的rpmi-1640培养基稀释成100个细胞/10ml培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μl，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养，4-5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8-9d时取出细胞上清，进行elisa检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性，且各孔检测od450nm值较为接近。将克隆化的cphv-1特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存。经过数次的细胞融合、筛选、克隆和鉴定，最终建立了89株稳定分泌cphv-1单克隆抗体的杂交瘤细胞库。
实施例2腹水的制备
将灭菌的液体石蜡腹腔注射10-12周龄的balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，0.5ml/只，7d后将杂交瘤细胞株注射至小鼠腹腔，每只0.2ml(含2×106-3×106个杂交瘤细胞)，7-10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min。收集上清，分装后置于-20℃保存备用。
实施例3病毒中和试验
用建立的89株稳定分泌cphv-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备的腹水，分别进行cphv-1中和试验，进一步筛选分泌中和效价高的单克隆抗体杂交瘤细胞株。首先，测定cphv-1jsha1405株的tcid50。采用固定病毒稀释抗体的方法，将mdbk细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将10倍系列稀释的各株单克隆抗体的小鼠腹水分别与等体积含200tcid50的cphv-1悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立cphv-1及正常mdbk细胞对照，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养，2d后观察结果。在89株cphv-1特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株中，杂交瘤细胞4a4株制备的小鼠腹水对cphv-1的中和效价最高，中和效价为28。
实施例4杂交瘤细胞株4a4的生物学特性
1、杂交瘤细胞株染色体分析
用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取sp2/0骨髓瘤细胞和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4-5h。用5ml37℃预热的0.075mol/lkcl低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3:1)1ml，边滴加边混匀，1000rpm离心10min。弃上清留细胞沉淀，用5ml固定液将细胞吹起，37℃作用30min，1000rpm离心10min，重复上述操作一次。细胞沉淀用1ml固定液悬起混匀，吸取悬液1滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的姬姆萨染液染色10min，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为96条，骨髓瘤细胞的染色体数量为62条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。
2、分泌抗体稳定性测定
将获得的杂交瘤细胞4a4株进行连续培养传代50次、液氮冻存与复苏试验，用cphv-1抗体间接elisa方法连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为104，证明此杂交瘤细胞株4a4能持续稳定地分泌抗cphv-1单克隆抗体。
3单克隆抗体的亚型测定
用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自thermofisherscientific公司)测定杂交瘤细胞4a4株分泌单克隆抗体的亚类，结果显示，该单克隆抗体亚类为igg2aκ。
4单克隆抗体的效价测定
用间接elisa测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞4a4培养上清elisa效价为104，腹水elisa效价为1012，腹水中病毒中和效价为28。
5单克隆抗体的特异性
5.1间接免疫荧光试验单克隆抗体的特异性
实验在48孔细胞培养板中进行。分别将cphv-1jsha1405株和边界病病毒(borderdiseasevirus，bdv)(李文良等，detectionofborderdiseasevirus(bdv)ingoatherdssufferingdiarrheaineasternchina.virologyjournal,2013,10:80.)接种mdbk细胞，培养24h后，弃去细胞培养液，用无血清培养基洗3次，向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇200μl/孔，4℃固定30min，pbs洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞培养上清液，200μl/孔，37℃孵育1h，pbs洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的fitc标记的羊抗鼠igg抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，200μl/孔，37℃孵育30min，pbs洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体能与cphv-1感染的mdbk细胞反应，产生荧光(如图1-a所示)，而与bdv感染的mdbk细胞以及正常mdbk细胞无荧光(如图1-b、1-c所示)，证明单克隆抗体可与cphv-1特异性反应。
5.2间接elisa检测单克隆抗体的特异性
用包被液为0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液对mdbk细胞抗原进行稀释(500倍)，包被elisa板，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗涤3次，每次5min，拍干；以含1％bsa(购自sigma公司)的磷酸盐吐温缓冲液(pbst)封闭每孔，200μl/孔，37℃放置2h，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；将杂交瘤细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，拍干；加入1:4000稀释的hrp标记的羊抗小鼠igg(购自北京全式金生物技术有限公司)，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入四甲基联苯胺(tmb)底物，100μl/孔，室温避光显示10min；每孔加入50μl2mol/l硫酸终止反应。经酶标仪测定od450nm值，杂交瘤细胞上清和小鼠阴性血清的od450nm值均小于0.1，显示了良好的特异性。
实施例5单克隆抗体治疗剂的制备、检验及应用
1、单克隆抗体治疗剂的制备
将灭菌的液体石蜡腹腔注射10-12周龄的balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，0.5ml/只，7d后将杂交瘤细胞4a4株注射至小鼠腹腔，每只注射2×106-3×106个杂交瘤细胞，7-10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min。收集上清单克隆抗体腹水经56℃、30min处理，过滤除菌，用无菌pbs稀释，加入适宜的稳定剂，分装后置于-20℃保存备用。
2、单克隆抗体治疗剂的效力试验
选取cphv-1抗原和抗体检测均为阴性的2-3月龄健康山羊随机分成若干组，用cphv-1jsha1405株感染，感染后，肌肉注射不同剂量的单克隆抗体治疗剂，每日观察临床症状、测量体温、检测cphv-1排毒情况。实验同时设立不注射单克隆抗体治疗剂对照组。结果显示：单克隆抗体治疗组中羊未出现cphv-1临床症状，体温正常，cphv-1检测为阴性；对照组出现cphv-1临床症状，体温升高，cphv-1检测为阳性。
3、单克隆抗体治疗剂的安全性试验
为了检验该制剂的安全性，将5倍的治疗剂量肌肉注射试验羊，每日测量试验羊的体温，观察其精神状态及饮食等表现。结果发现试验羊无不良副反应。
4、单克隆抗体治疗剂的稳定性试验
将分装的单克隆抗体治疗剂，分别置于37℃、4℃、-20℃保存，经不同的保存时间后，取样进行病毒中和试验，测定其中和效价。结果表明：放置于-20℃保存两年后的单克隆抗体治疗剂，中和效价仍为28。
5、单克隆抗体治疗剂的临床应用
将制备的单克隆抗体治疗剂用于养殖场cphv-1感染羊的治疗，采用肌肉注射的方法，治愈率可达90％。
实施例6间接免疫荧光方法(ifa)的建立
1、ifa检测抗体的制备
将灭菌的液体石蜡腹腔注射10-12周龄的balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，0.5ml/只，7d后将杂交瘤细胞4a4株注射至小鼠腹腔，每只注射2×106-3×106个杂交瘤细胞，7-10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，5000rpm离心10min。收集上清单克隆抗体腹水经56℃、30min处理，过滤除菌，用无菌pbs稀释500倍，加入适宜的稳定剂，分装后置于-20℃保存备用。
2、cphv-1感染mdbk细胞样品的ifa检测
实验在96孔细胞培养板中进行。将cphv-1jsha1405株接种mdbk细胞，培养24h后，弃去细胞培养液，用pbs洗3次，向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇100μl/孔，4℃固定30min，pbs洗3次，拍干；加入ifa检测抗体，100μl/孔，37℃孵育1h，pbs洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的fitc标记的羊抗鼠igg抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，100μl/孔，37℃孵育30min，pbs洗涤3次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，ifa检测抗体能与cphv-1感染的mdbk细胞反应，产生绿色荧光(图2-a)，而与正常mdbk细胞无荧光(图2-b)，证明该ifa检测抗体能有效检测出cphv-1感染，具有较好的灵敏性和特异性。
应当强调，本发明的上述实施例仅仅是可能的示例实施方式，其仅仅是为了清楚地理解本公开的原理而提出的。在不脱离本公开的精神和原理的情况下，可以对本公开的上述实施例进行许多变化和修改。所有这些修改和变化旨在被包括在本发明的范围内并由所附权利要求保护。