本发明涉及一种具有免疫抑制活性的吡喃类化合物及其制备方法和应用，属于医药生物技术领域。
背景技术
免疫抑制药物是指针对机体免疫应答有抑制作用的药物，是针对于自身免疫性疾病而研发出来的，能够抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，能降低机体的免疫反应。临床上用于治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的免疫抑制药物主要有环孢菌素a(csa)、他克莫司(fk506)等，虽然此类药物在临床的疗效十分确切，但却具有不同程度的肝肾毒性或神经毒性等，长期服用会引发高脂血症、代谢性骨病甚至诱发肿瘤的发生；同时，这些免疫抑制药物的价格也比较昂贵。因此，急需从天然植物中寻找一种低毒、有效、价格低廉的免疫抑制药物，用于替代环孢菌素a(csa)、他克莫司(fk506)等。
技术实现要素：
本发明提供一种具有免疫抑制活性的吡喃类化合物及其制备方法和应用。从天然产物中筛选得到能抑制钙调蛋白磷酸酶活性的化合物，为自身免疫性疾病的治疗提供一种全新的治疗药物。
本发明采取的技术方案如下：
一种具有免疫抑制活性的吡喃类化合物的制备方法，包括以下步骤：
s1、从红海榄中筛选分离得到内生真菌，进行发酵培养；
s2、内生真菌发酵培养结束后，刮取菌丝，用乙酸乙酯充分浸泡，过滤获取乙酸乙酯提取物，减压浓缩，回收乙酸乙酯，获得菌株发酵产物；
s3、取发酵产物，以石油醚和丙酮的混合溶液为洗脱剂，进行硅胶梯度洗脱，收集洗脱产物；
s4、取洗脱产物，选用c18反相柱，通过高效液相色谱法进行梯度洗脱，得到具有免疫抑制活性的吡喃类化合物。
优选的，所述内生真菌为拟盘多毛孢。
更优选的，所述内生真菌为pestalotiopsissp.hhl-101，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日：2018年4月2日，保藏编号：cctccno：m2018173，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
优选的，步骤s2中乙酸乙酯的浸泡时间为24h。
优选的，步骤s3为：取发酵产物，以石油醚：丙酮为洗脱剂，依序按体积比100:0，90:10，70:30，50:50，30:70，10:90，0:100，进行硅胶梯度洗脱，收集流份，以每250ml为一瓶，收集得到88瓶，将第81-88瓶流份合并，得到洗脱产物。
优选的，步骤s4中，高效液相色谱的条件为：以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，流动相流速1ml/min，进样量5μl，梯度程序为：
优选的，所述化合物命名为pestalotiopyronem，该化合物结构式(i)为：
优选的，所述化合物用于制备针对器官移植或自身免疫性疾病的免疫抑制药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首先将红树林植物红海榄内生真菌的发酵产物进行乙酸乙酯浸泡，然后以石油醚：丙酮为洗脱剂进行硅胶梯度洗脱，再经高效液相色谱洗脱纯化，得到化合物pestalotiopyronem，该化合物具有显著的钙调蛋白磷酸酶抑制活性，其对脾细胞的毒性很弱，可用于制备针对器官移植和自身免疫性疾病的第二代免疫抑制药物。
本发明化合物的cn酶抑制活性(19.67±0.084μm)远低于环孢菌素a(ic50＝33.98±0.302μm)，在药物浓度为50μm时，cn酶抑制率可达到70.93％；本发明化合物对正常小鼠的淋巴细胞有很弱的细胞毒性(ic50＝385.78±17.90μm)，而csa则严重影响淋巴细胞的存活率，具有很强的细胞毒性(ic50＝10.15±0.42μm)，所以pestalotiopyronem一定浓度范围内对淋巴细胞的毒性很低。
此外，本发明化合物来源于天然产物，且提取过程中未加入高毒性试剂，是一种低毒、有效、价格低廉的免疫抑制药物。
附图说明
图1：菌株hhl101的形态特征；
图2：菌株hhl101的产孢结构；
图3：pestalotiopyronem和环孢菌素a的钙调蛋白磷酸酶靶酶活性测试结果；
图4：pestalotiopyronem和环孢菌素a的脾细胞毒性测试结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：pestalotiopsissp.hhl-101的分离、鉴定和发酵
1.1内生真菌的分离：
本实验的样品采自东寨港红树林国家自然保护区，红海榄(rhizophorastylosa)植物采集后置于塑料袋中并存放于4℃备用。样品洗净，在超净工作台中，依次用75％乙醇浸泡60s，2％次氯酸钠浸泡30s、无菌水清洗3次。以上操作重复三次，最后一次的无菌水作为空白对照。将植物切成5mm×5mm的小组织块后接入pda平板培养基上，置于28℃恒温培养箱中倒置培养3-7天。
该菌株在pda培养基上生长迅速，25℃恒温培养3-5天可长满全皿；菌落表面颜色为白色，气生菌丝丰富或稀疏，菌落边缘均匀、平滑呈絮状(见图1)；分生孢子有子座产生，通常呈梭形，壁光滑或粗糙，带4个隔膜，分生孢子5胞，两端细胞无色(三角形至短锥形)，中间细胞为棕色或深褐色(长11.6-15.4μm)，梭形，直立或略弯曲，大小为(15.8-21.6)×(3.5-4.2)μm；附属丝着生于分生孢子的顶端，为2-4根，长度为7.8-18.6μm，底部带有一根不分枝的附属丝，长度为2.3-6.5μm(图2)。
1.2内生真菌的分子鉴定：
将分离纯化的菌株，接种至新的pda培养基上，生长7天，从培养皿中刮取菌丝，采用ctab法提取dna，以总dna为模板，采用引物its1f5‘-cttggtcatttagaggaagtaa-3’，its45’-tcctccgcttattgatatgc-3’，对its内转录间隔区进行pcr扩增。pcr反应体系为：dna模板1.0μl，正向引物1.0μl，反向引物1.0μl，dntpmixture1.0μl，taqdna聚合酶1.0μl，taqbuffer5.0μl，ddh2o40μl。pcr扩增条件为：94℃5min；随后为30个循环94℃40s，55℃40s，72℃55s，最后72℃10min的延伸。pcr产物经处理后送至上海英潍捷基公司进行测序。测序获得的18srna基因序列在genebank中进行blast比对分析。将该菌株命名为pestalotiopsissp.hhl-101。
1.3内生真菌发酵培养：
活化后的菌株hhl-101接种至大米固体培养基(每1000ml的锥形瓶中，加入大米100g、粗海盐3g、蛋白胨0.6g、水100ml)上，进行28天的发酵培养。
实施例二：pestalotiopyronem的分离制备及结构鉴定
2.1内生真菌发酵产物提取
实施例一中的内生真菌发酵培养结束后，刮取培养基上层的菌丝置于100l的玻璃缸中，用乙酸乙酯充分浸泡24h，过滤获取乙酸乙酯提取物，减压浓缩，回收乙酸乙酯，重复三次，获得菌株pestalotiopsissp.hhl-101发酵产物60g。
2.2薄层检测(tlc)预实验
①点板
取少量pestalotiopsissp.hhl-101发酵提取物用少量的溶剂溶解，用毛细管点于薄层硅胶gf254板上。点板的直径约2㎜，距离薄层板约1.5厘米。点上样品后待其挥干后放入层析缸中；
②展开
展开剂加入层析缸后，将点样薄层硅胶板快速放入层析缸中，待溶剂前沿距离薄层硅胶板上端还有0.5cm时可以取出，晾干后显色；
③显色
将展开后的硅胶板，分别用紫外、5％的硫酸显色后，使用加热罩加热碳化。拍照记录显色结果。
④溶剂系统的选择
本研究对pestalotiopsissp.hhl-101发酵提取物薄层层析的展开系统进行了摸索，最后决定用石油醚：丙酮(体积比100:0，90:10，70:30，50:50，30:70，10:90，0:100)梯度洗脱。
2.3装柱及上样
吸附剂的填装，硅胶为多孔性物质，装柱宜用湿装法，发酵提取物为60g，将3.5kg硅胶混悬于二氯甲烷中，不断搅拌赶出气泡，连同溶剂一起倾入层析柱中。一次全部倾入，以免由于不同颗粒大小的硅胶沉降度不一样，使硅胶柱有明显的分段，容易影响分离效果，同时使硅胶柱层析表面保持在同一水平面有助于分离。将发酵提取物用少量的二氯甲烷溶解后，以1:1-1:2的量加入层析硅胶匀速研磨，将溶剂挥发至干呈松散状的样品，备用。将拌好的样品小心的铺在硅胶柱层析上，使样品表面保持平面，并在上面加上一层2-3cm的石英砂压出样品，有助于样品在硅胶柱层析中分离。在石英砂上面可以加入脱脂棉，起到缓冲的作用。
2.4洗脱样品合并
以石油醚：丙酮(体积比100:0，90:10，70:30，50:50，30:70，10:90，0:100)为洗脱剂，进行硅胶洗脱。每250ml为一个流份收集，收集了88瓶，1-40瓶合并为wx-1组分，40-50瓶合并为wx-2组分，51-60瓶合并为wx-3组分，61-62瓶合并为wx-4组分，63-64瓶合并为dq-5组分，65-67瓶合并为wx-6组分，68-70瓶合并为wx-7组分，71-75瓶合并为wx-8组分，76-77瓶合并为wx-9组分，78-80瓶合并为wx-10组分，81-88瓶合并为wx-11组分。
2.5化合物的hplc制备
将过硅胶色谱柱的流份81-88瓶合并为wx-11组分，c18反相柱梯度洗脱，初步得到纯化后组分。先称量样品重量，然后滴取一定量的色谱甲醇，定容至5mg/ml，再依次用注射器少量多次吸取至微孔过滤器，使样品中肉眼看不见的颗粒过滤掉，防止堵塞色谱柱，转移至待测瓶中。
高效液相色谱条件：以ch3oh和h2o为流动相梯度洗脱，流动相流速1ml/min，进样量5μl。梯度洗脱程序和vwd检测器的激发波长254nm(λ)，按以下色谱条件进行制备，得到pestalotiopyronem。
表1hplc溶剂系统梯度表
2.6化合物的结构表征
通过本发明方法，每60g发酵产物中可提取得到4.2mg的高纯度化合物。采用光谱(ir，uv，cd)、波谱(1hnmr，13cnmr，dept，h-hcosy，hmqc，hmbc，noesy)和ms(esi-ms，hrms)等结构鉴定技术，确定所得到的活性成分为3,5-bis(hydroxymethyl)-4-methoxy-6-methyl-2h-pyran-2-one，命名为pestalotiopyronem，该化合物结构式为：
实施例三pestalotiopyronem的钙调蛋白磷酸酶靶酶活性测试
3.1实验试剂：
酶稀释液直接购置于北京师范大学，其具体配方如表2所示：
表2
配制测活液(以10ml为单位)：分别用超纯水将cam和cnb配制成5mg/ml和10mg/ml的溶液，用超纯水将dtt、mncl2、cacl2配制成0.5m、1m、1m的溶液。取860μl的测活母液于15ml离心管中，分别加入上述配制好的cam、cnb、dtt、mncl2、cacl2各67.4μl、37.98μl、20μl、5μl、10μl，配制成测活液。具体配方如表4所示：
表3测活母液
表4测活液(向母液中加入以下成分)
配制终止液(以1l为单位)：取53gna2co3的和5.85gedta用适量超纯水将其溶解，转移至1l的容量瓶中，用超纯水将其定容至1l。终止液具体配方如表5所示：
表5终止液
3.2测试方法
3.2.1调节cna酶活力
取10μl的cna酶加入到5ml试管中置于冰上，加入10μl的buffer(dmso)，于冰上孵育5min，加入180μl的测活液于30℃水浴反应20min，加入1800μl终止液终止反应，将所得液体转移至比色皿中，用紫外可见分光光度计测定od410值。测得od值后，将酶稀释，重复上述操作将od值调节至0.6-0.8范围内备用。
3.2.2阳性对照测定
将阳性对照环孢菌素a(csa)稀释成适当的浓度梯度(见表6)取若干5ml试管置于冰上，分别依次加入不同浓度的环孢菌素a(csa)10μl，然后向每个试管中加入cna酶10μl。另取若干试管做对照组：
空白对照：10μl酶稀释液+10μlbuffer
酶：10μl酶+10μlbuffer
对照组：10μl酶稀释液+10μlcsa
酶+药：10μl酶+10μlcsa
按上述方法加好试剂后，置于冰上孵育5min，随后加入180μl的测活液于30℃水浴20min，加入1800μl的终止液终止反应，用紫外分光光度计测定od410值。
3.2.3pestalotiopyronem测定
将pestalotiopyronem稀释成适当的浓度梯度(见表6)。取若干5ml试管置于冰上，分别依次加入不同浓度的pestalotiopyronem10μl，然后向每个试管中加入cna酶10μl。另取若干试管做对照组：
空白对照：10μl酶稀释液+10μlbuffer
酶：10μl酶+10μlbuffer
对照组：10μl酶稀释液+10μlpestalotiopyronem
酶+药：10μl酶+10μlpestalotiopyronem
按上述方法加好试剂后，置于冰上孵育5min，随后加入180μl的测活液于30℃水浴20min，加入1800μl的终止液终止反应，用紫外分光光度计测定od410值。
按以下计算公式计算药物对cna的相对抑制率：
相对抑制率(％)＝[1-(od药+酶-od药对照)/od酶]×100％
3.3测试结果
测试结果见表6和图3。
表6
从测定结果可知，本发明化合物的cn酶抑制活性(19.67±0.084μm)远低于环孢菌素a(ic50＝33.98±0.302μm)，在药物浓度为50μm时，cn酶抑制率可达到70.93％。
实施例四小鼠脾淋巴细胞毒活性测试
动物材料：spf条件下饲养的blab/c小鼠(雌雄不拘)，规格：18～20g/只。
实验试剂：rpmi1640培养基、胎牛血清、cck-8试剂盒、细胞专用dmso、待测样品。
实验步骤：
4.1、小鼠脾细胞悬浮液的制备：
4.1.1、取小鼠，摘眼球放血后颈椎脱位处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌培养皿上，左腹侧朝上。
4.1.2、在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开腹部皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
4.1.3、在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，放入盛有5ml培养基的离心管中。
4.1.4、钢网研磨法：将脾脏剪成几段，放置在200目的不锈钢网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏(多压少研，放置细胞破碎)，并用移液枪吸取培养基轻轻冲洗钢网(大约3～5ml培养基)，使细胞过钢网进入溶液中，获取细胞悬浮液。
4.1.5、1000rpm离心5min后弃上清液，然后用红细胞裂解液裂解红细胞(4～5ml)，4℃裂解5min，1000rpm离心5min，加入5ml培养基制成细胞悬浮液，计数。
4.2、毒性试验：
4.2.1、取96孔细胞培养板，每孔接种淋巴细胞悬浮液100μl、浓度为1.5×107个/ml，于37℃，5％co2培养箱中培养4h，待细胞稳定。
4.2.2、4h后取出细胞培养板，每孔加入用完全培养基稀释成不同浓度的化合物或阳性对照(csa)，使得终浓度分别为1、5、10、15、20、30和40μm。空白对照组加入含有0.2％dmso的完全培养基，每组设置3个复孔。
4.2.3、将培养板置于培养箱中培育68h。
4.2.4、培养68h后，取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，后在每孔中加入20μlcck-8试剂。
4.2.5、继续于37℃下孵育4h后，酶标仪读取od450，计算细胞存活率，脾细胞存活率＝od实验组/od空白对照组×100％。
4.3、测试结果
结果见表7和图4。
表7
从表7和图4可知，本发明化合物对正常小鼠的淋巴细胞有很弱的细胞毒性(ic50＝385.78±17.90μm)，而csa则严重影响淋巴细胞的存活率，具有很强的细胞毒性(ic50＝10.15±0.42μm)，可见pestalotiopyronem一定浓度范围内对淋巴细胞的毒性很低。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。