本发明属于动物传染病和转基因技术领域，具体涉及猪β-防御素2基因(简称pbd-2基因)在抗猪流感中的应用。将pbd-2基因在猪体内过量表达，显著提高了猪对猪流感病毒的抵抗力。利用人工合成或重组pbd-2基因亦可有效抑制猪流感病毒的复制。
背景技术
猪流感是由甲型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病，其主要临床症状表现为发热、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振甚至废绝等，冬春季节和应激环境下高发，传染性强，给养猪业带来了重大经济损失。此外，猪是禽流感和人流感病毒基因重配和跨种传播的重要中间宿主(又称为流感病毒的“混合器”)，猪流感病毒是引起人类流感大流行毒株的重要来源，因此猪流感又具有重要的公共卫生学意义。目前对猪流感病毒没有特效药物，我国唯一的商品化猪流感h1n1亚型灭活疫苗可以对猪提供保护，但各地区流行的猪流感病毒谱系或基因节段的来源均有差异，且流感病毒基因变异很快，当新型流感爆发时疫苗的研发时间较长，所以研发新型的抗猪流感技术具有重要意义。
防御素(defensin)是动物机体分泌的一种小分子阳离子多肽，该多肽具有广谱的抗菌、抗病毒、抗真菌活性以及免疫调节活性，是动物天然免疫的第一道重要防线。防御素作为动物本身的一种活性物质，以其独特的抗病原微生物感染机制成为传染病新型防控手段的研究热点。
防御素通常由18-45个氨基酸组成,其中包括6个保守的半胱氨酸结构，根据这6个半胱氨酸的空间位置和分子内二硫键的连接差异，防御素分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三种。在爬行动物、两栖动物、鸟类和哺乳动物中都存在各种类型的防御素，已知的防御素种类多达2400多种。目前在猪中只发现了β-防御素，其中β-防御素2(pbd-2)与人的β-防御素1(hbd-1)有较高的同源性，其成熟肽由37个氨基酸组成，在猪的舌头、肝脏、肾脏、小肠和大肠等组织中均有表达。
2008年edwinj.a.等发现4-8μm的pbd-2能在3小时内有效杀伤猪伤寒沙门氏菌、李斯特菌和猪丹毒杆菌，而在生理条件下的pbd-2不表现溶血活性(veldhuizenetal.,2008)。2014年peng等利用酵母在体外表达并纯化了成熟的rpbd-2蛋白，发现rpbd-2对沙门氏菌、葡萄球菌和猪链球菌均具有良好的抗菌活性，且在ph2.0-10.0，100℃下处理20min及被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及胰蛋白酶处理后均能保持良好的活性，且pbd-2具有促生长和降低仔猪腹泻的效果，被认为可以作为断奶后仔猪的饲料添加剂(pengetal.,2014,xuetal.,2017)。口服pbd-2还能改善猪的肠道微生物组成以及降低病原菌感染后炎性因子的表达(tangetal.,2016)。
转基因技术已成功应用于动物抗病育种的研究领域。1992年，德国brem实验室发现mx转基因猪具有抗流感能力(mulleretal.,1992)。过表达tlr4基因的转基因羊表现出显著的抗布鲁氏菌感染的能力(dengetal.,2013)。口蹄疫病毒3dpol基因干扰分子的转基因羊的体内口蹄疫病毒滴度降低(lietal.,2015)。sp110转基因牛具有一定的抗牛结核病能力(wuetal.,2015)。2017年prather等敲除了猪的猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)病毒受体基因cd163的一个外显子，获得的转基因猪对猪蓝耳病具有抵抗能力(pratheretal.,2017；whitworthetal.,2014；whitworthetal.,2016)。2015年申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室成功制备了pbd-2过表达转基因猪，pbd-2在转基因猪的心、肝、脾、肺、肾、空肠等多种组织器官过量表达，转基因猪表现出显著的抗猪传染性胸膜肺炎的能力，重组和人工合成的pbd-2也具有良好的抗细菌效果，证实了pbd-2及其基因在抗猪细菌病中的应用(yangetal.,2015)。
迄今为止，尚未见到国内外有关pbd-2及其基因在抗动物病毒病，特别是猪流感中的应用的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供β-防御素2基因(pbd-2基因)在抗猪流感中的应用。一方面，利用pbd-2基因制备转基因猪以提高猪对猪流感的抵抗力。另一方面，运用基因工程表达纯化或人工合成pbd-2基因，抑制猪流感病毒的复制，用于非诊断目的的猪流感的预防和治疗。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
1.利用pbd-2基因(基因登录号：nw_018085039，其cds序列见序列表seqidno:1所述)制备抗流感转基因猪。pbd-2基因在猪抵抗猪流感病毒感染中的应用，包括用于非诊断目的的降低猪流感病毒造成猪的肺部病变程度，或降低猪流感病毒在感染猪的肺组织中的滴度的应用。
2.利用人工合成的pbd-2基因片段抑制猪流感病毒的复制。人工合成和重组的pbd-2基因片段在抑制猪流感病毒复制中的应用，包括通过体外表达或合成制备成多肽类药物或饲料添加剂，用于非诊断目的的猪流感的预防和治疗。
本发明的具体步骤如下：
一、利用pbd-2基因制备抗流感转基因猪：
(1)按常规方法提取猪肝脏的总rna，反转录后获得cdna；
(2)设计如下引物扩增目的片段：
正向引物pbd201：ccggaattcatgtgggccctctgcttg，
反向引物pbd202：ccgctcgagtcagggtcagcggatgca；
上述引物对的设计含有ecori和xhoi限制性内切酶的位点，利用pcr扩增后获得pbd-2基因的cds序列(其序列见序列表seqidno:1)，将获得的pbd-2的cds序列与真核表达载体pca(invitrogen，amp+，4713bp)(图1)用ecori和xhoi限制性内切酶双酶切，然后连接获得含有pbd-2基因的重组质粒pca-pbd2(图2)，大小4898bp。再用sspi和xhoi将pca-pbd2中的表达盒切下克隆于真核表达载体pcdna3.1(+)(invitrogen，neo+/amp+，5.4kb)中(图3)，得到重组质粒pcdna3.1(+)/pca-pbd2(图4)，大小为6379bp。
(3)将该转基因载体线性化后利用pbd-2线性表达盒对大白猪胎儿成纤维细胞进行电转，再用g418(sigma-aldrich)筛选出阳性克隆，然后选取生长形态较好的转染细胞进行人工核移植。核移植成功并发育成囊胚之后将胚胎移植到受体母猪体内，受体母猪受孕并产下仔猪，通过分子生物学鉴定后即可获得对猪流感具有抵抗力的转基因猪。
二、利用人工合成的pbd-2基因片段抑制猪流感病毒的复制：
(1)根据氨基酸序列(见序列表seqidno:2第33至69位所示的氨基酸序列)人工合成pbd-2，其氨基酸序列如下所述(其氨基酸的蛋白质序列见seqidno:2)：
dhyicakkggtcnfspcplfnriegtcysgkakccir
将临床分离的甲型流感病毒h1n1病毒(a/swine/nanchang/f9/2010)与mdck细胞(cctcc:gdc401)孵育1h后加入浓度分别为12.5、25、50、100、150μg/ml的人工合成pbd-2，反应24h后取上清，通过荧光定量pcr的方法测定上清中的h1n1病毒滴度。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)申请人在猪中超表达pbd-2基因制备成转基因猪，首次揭示了超表达pbd-2基因能够降低猪流感病毒造成猪的肺部病变程度，降低猪流感病毒在感染猪的肺组织中的滴度。
(2)首次发现了pbd-2能抑制猪流感病毒的复制，表明pbd-2基因能够作为培育抗猪流感病毒的转基因猪的候选基因，或可通过体外表达或合成制备成多肽类药物或饲料添加剂，用于猪流感的预防和治疗。
附图说明
序列表seqidno:1是本发明克隆的猪β-防御素2基因的部分核苷酸序列和cds区(1-210bp)，序列长度为210bp,其中1-210位碱基所示的序列也是该基因片段对应的氨基酸序列。
序列表seqidno:2是猪β-防御素2基因部分核苷酸序列编码的蛋白质序列。
图1：pca质粒图谱。
图2：pca-pbd2质粒图谱。
图3：pcdna3.1(+)质粒图谱。
图4：pcdna3.1(+)/pca-pbd2质粒图谱。
图5：本发明的技术流程图。
图6：本发明制备的pcdna3.1(+)/pca-pbd2转基因载体的线性化图谱。
图7：pbd-2转基因猪pcr鉴定示意图。附图标记说明：琼脂糖凝胶浓度为1％，图中泳道说明：m为dl2000maker；1为转pbd-2基因阴性猪；2为转pbd-2基因阳性猪；3为阴性对照；4为转基因阳性对照，阳性对照是以pca-pbd210ng质粒为模板进行目的基因扩增。
图8：转pbd-2基因阳性猪与非转基因猪在感染猪流感病毒后体温变化对比示意图。附图标记说明：直肠温度单位：℃。tg为转基因猪，wt为非转基因猪，*表示数据的统计学差异的显著性达到p<0.05。
图9：转pbd-2基因阳性猪与非转基因猪在感染猪流感病毒后肺部眼观病变程度图。附图标记说明：图9中的a-c图为未感染猪流感病毒非转基因猪(阴性对照)肺部眼观情况；图9中的d-i图为非转基因猪感染猪流感病毒后肺部眼观病变情况；图9中的j-o图为转基因猪感染猪流感病毒后肺部眼观病变情况；p图为转基因猪和非转基因猪感染流感病毒后肺部眼观病变评分(tg为转基因猪，wt为非转基因猪)。
图10：转pbd-2基因阳性猪与非转基因猪在感染猪流感病毒后肺部组织病理切片图。附图标记说明：图10中的a-f图为非转基因猪肺部组织切片图，图10中的g-l图为转基因猪肺部组织切片图,m图为转基因猪与非转基因猪肺部组织切片病理学评分(tg为转基因猪，wt为非转基因猪)。
图11：转pbd-2基因阳性猪与非转基因猪在感染猪流感病毒后肺组织病毒滴度对比。附图标记说明：图11中的a图为肺部病毒滴度荧光定量pcr检测结果，图11中的b图为肺部病毒滴度eid50检测结果。
图12加入不同浓度的pbd-2后h1n1在mdck细胞上的复制情况检测。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例是将pbd-2基因在猪中过表达，对pbd-2基因抗猪流感病毒的功能进行说明。
实施例1：
1、过表达pbd-2基因的转基因猪的制备：
1.1pcdna3.1(+)/pca-pbd2转基因载体的构建与线性化：
提取猪肝脏组织的总rna(yangetal.2015)，通过反转录后获得cdna。利用ncbi数据库中公布猪的pbd-2基因的cds序列(genbanknm_214442.1)，设计含有ecori和xhoi限制性内切酶位点的引物(下面引物对的设计含有ecori和xhoi限制性内切酶的位点)：
正向引物pbd201：ccggaattcatgtgggccctctgcttg，
反向引物pbd202：ccgctcgagtcagggtcagcggatgca；
通过普通pcr方法扩增获得pbd-2基因的cds序列，其大小为210bp，该cds序列具体为：atgagggccctctgcttgctgctgctgactgtctgcctcctctcttcccagctggctgcaggtattaacctgcttacgggtcttggccagaggtccgaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctga
将获得的pbd-2cds序列与真核表达载体pca(见图1，购自自invitrogen公司，amp+，大小为4713bp)，用ecori和xhoi限制性内切酶进行双酶切，然后连接到获得含有pbd-2基因的重组质粒pca-pbd2(图2)，质粒大小为4898bp。再用sspi和xhoi将pca-pbd2中的表达盒切下克隆于真核表达载体pcdna3.1(+)(图3，购自invitrogen公司)，neo+/amp+，大小为5.4kb中，得到重组质粒pcdna3.1(+)/pca-pbd2(图4)，质粒大小为6379bp。
将该转基因载体通过线性化后利用pbd-2线性表达盒对大白猪胎儿成纤维细胞进行电转化，用g418(购自sigma-aldrich公司)筛选出阳性克隆，然后选取生长形态较好的转染细胞进行人工核移植。核移植成功并发育成囊胚之后将胚胎移植到受体母猪体内，受体母猪受孕并产下仔猪，通过分子生物学鉴定后即可获得对猪流感有抵抗力的转基因猪。
1.2转基因猪的分子生物学鉴定：取制备出的转基因猪耳部组织，提取组织基因组dna(yangetal.,2015)，利用pcr方法鉴定转基因猪是否为阳性转基因猪(即目的基因成功插入转基因猪基因组中)。pcr反应条件：94℃，5min，1个循环；94℃，1min，58℃，15s，72℃，30s，30个循环；72℃，10min，共30个循环。在1％琼脂糖凝胶，120v电压，30min，进行gelred染色。阴性为水和非转基因细胞系总dna，取50ng为模板，阳性为pca-pbd210ng质粒为模板。扩繁获得的后代猪的鉴定方法与本步骤相同。
1.3转pbd-2基因猪的扩繁：从经pcr技术鉴定为转基因阳性的猪中选取2头状态良好、易于驯化的公猪留种，人工采精后对适龄野生型母猪(即非转基因猪)进行人工授精，对野生型母猪产下的后代采集耳部组织样本进行检测，即可获得子代阳性转基因猪f1，通过多次配种及鉴定可获得状态良好的种猪并进一步对转基因阳性猪进行扩繁。
从获得的转pbd-2基因的f1代猪中剪取0.5cm3的耳部组织放入ep管中，提取基因组dna。以基因组dna为模板，野生型(即非转基因)猪基因组dna为阴性对照，水作为空白对照，以pcdna3.1(+)/pca-pbd2质粒为阳性对照，依据pcdna3.1(+)/pca-pbd2载体序列设计的特异性引物如下：
正向引物np03:gctggttgttgtgctgtctc，
反向引物np04:aggtcccttcaatcctgttg；
对所提取的基因组进行pcr鉴定，扩增长度为215bp，序列具体如下：
gctggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcatgtgggccctctgcttgctgctgctgactgtctgcctcctctcttcccagctggctgcaggtattaacctgcttacgggtcttggccagaggtccgaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacct，
经琼脂糖凝胶电泳对比，证实转基因猪的pbd-2基因已经成功整合到基因组中(见图7，转基因猪的pcr检测示意图)。结果显示转基因阳性猪的基因组dna和pcdna3.1(+)/pca-pbd2质粒能被上述特异性引物扩增出特异性片段，而水、非转基因猪均不能扩增出片段。
实施例2：pbd-2基因在猪抵抗猪流感病毒感染中的应用
(1)过表达pbd-2的转基因猪在感染猪流感后的肺部眼观病变程度轻于同窝野生型(非转基因)猪。
对4头40日龄野生型(即非转基因)猪(对照)气管注射2ml5×107eid50/ml的h1n1病毒(a/swine/nanchang/f9/2010，实施本发明不限于该病毒株)后与6头40日龄转基因猪和6头40日龄同窝野生型(非转基因)猪同居饲养，每天早晚观察临床症状并用兽用体温计测量直肠体温，绘制体温变化曲线。图8的统计结果表明在感染流感病毒后转基因猪和非转基因猪的体温都有所上升，在感染后第1天和第1.5天时非转基因猪(对照)的体温要显著高于转基因猪(p<0.05)，过表达pbd-2基因可减缓猪感染猪流感后的发热症状。
感染5天后剖杀所有试验和对照猪，并观察肺部眼观病变程度。感染猪流感后猪肺脏局部或大面积呈紫色，发生实变。图9显示的是转基因猪的眼观病变程度显著轻于非转基因猪。
(2)过表达pbd-2的转基因猪在感染猪流感后的肺部病理变化程度轻于同窝野生型猪。
感染5天后剖杀所有猪，并取部分肺部组织于10％福尔马林溶液中固定，固定24h后用于制作石蜡切片。石蜡切片制作：(1)组织冲洗：从固定液中取出组织进行修块，之后肺脏组织放于脱水框内，流水冲洗24h。(2)组织脱水：将脱水狂依次放在不同浓度的酒精溶液中梯度脱水：70％(2h)，75％(1h)，85％(1h)，95％(1h)，100％i(1h)，100％ii(1h)。(3)组织透明：梯度酒精脱水后的组织放在无水乙醇和二甲苯1：1体积的混合液中30min，二甲苯i溶液10min,二甲苯ii溶液10min。(4)组织浸蜡与包埋：蜡油的处理，白蜡和蜂蜡8：1体积在60℃融化混合，滤纸过滤两次。二甲苯与蜡油1：1体积混合液中浸泡30min，蜡油i浸泡2h，蜡油ii浸泡2h。然后不锈钢包埋框中倒入蜡油，把组织块修理平整的横截面朝下放置，贴上标签。(5)切片：使用莱卡旋转式切片机(型号rm2245/rm2235，购自德国徕卡公司)，设置切片厚度4μm，获得连续切片。在40℃水浴锅中展片，防脱片载玻片捞片。晾干水分，放置在60℃烘箱中烘烤30min，最后切片放在4℃冰箱中保存。
感染猪流感后从肺部组织切片可以观察到肺泡壁增厚，肺泡腔内红细胞渗出、炎性细胞浸润的现象，根据炎性细胞渗出所占体积的百分比对所有猪肺部组织切片进行评分，结果表明转基因猪的肺部病理切片评分低于非转基因猪(图10)。
(3)过表达pbd-2的转基因猪在感染猪流感后的肺部病毒滴度低于同窝野生型猪。
感染5天后取部分肺部组织于3倍体积的含1％双抗(青霉素/链霉素)的生理盐水中，匀浆后冻存于-80℃冰箱中，冻融2-3次后以10倍的倍比稀释至10-6，每个稀释度以每枚胚0.2ml的剂量通过尿囊腔接种4枚9日龄的spf鸡胚，37℃温箱孵育。每12h用照蛋器检查鸡胚的死亡情况，收取死亡鸡胚和接种后72h后未死亡的鸡胚尿囊液，对所有尿囊液样品进行血凝试验，根据血凝价的有无判断鸡胚是否被病毒感染，参照reed-muench方法计算每头猪肺脏匀浆中猪流感病毒的eid50。
感染5天后取部分肺部组织于3倍体积的含100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的生理盐水中，匀浆后冻存于-80℃冰箱中，冻融2-3次后取0.5ml组织匀浆于2mlep管中，加入1mltrizol裂解，混匀后静置5min；加入0.2ml氯仿，涡旋15s后静置2min使溶液分层；12000r/min/4℃离心15min，取上清；加入0.5ml异丙醇后轻轻混匀，4℃静置10min，然后12000r/min/4℃离心10min，弃上清；加入1ml75％乙醇(depc水配制)轻轻洗涤，然后12000r/min/4℃离心5min，弃上清，自然晾干后加入适当depc水溶解，分装少许检测浓度，除去其中的gdna，反转录成cdna后用荧光定量的方法(常规方法)检测肺部组织中的病毒滴度。
图11表明转基因猪肺脏中猪流感病毒的eid50检测结果与荧光定量检测结果均低于非转基因猪，因此转基因猪肺脏猪流感病毒载量低于非转基因猪。
实施例3：人工合成的pbd-2基因在抑制猪流感病毒复制中的应用：
将mdck细胞(购自中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心,即cctcc。菌株编号cctcc:gdc401)接种到24孔细胞培养板，当细胞长满细胞孔85％-90％时，用无菌pbs缓冲液(常用缓冲液或购自商品)洗涤细胞2-3次。然后将tcid50为104/100μl的h1n1猪流感病毒液稀释100倍后接种细胞，每孔200μl，37℃温箱孵育1h。弃去孔中液体，用pbs缓冲液洗涤2次，每孔加入用dmem细胞培养基(常用培养基)稀释好的pbd-2基因500μl，浓度分别为12.5、25、50、100、150μg/ml，每个稀释度加4孔，于37℃温箱培养24h后取上清，以np基因(基因登录号：jf275928.1)为扩增对象，通过荧光定量pcr的方法(常规方法)测定猪流感病毒的增殖情况。扩增np基因所使用的引物序列如下所示：
正向引物：np-f：ccgctcgagttgttcgcaccggaatggat，
反向引物：np-r：cccaagcttcaacccttgtccttcgtcca。
结果表明，当人工合成pbd-2基因浓度达到25μg/ml时即可抑制h1n1猪流感病毒在mdck细胞上的复制，且抑制作用随浓度升高而增强(图12)。
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