本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种曲霉菌株及利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法。
背景技术：
人乳铁蛋白具有广泛复杂的生物学功能，其脱铁形式是一种多功能的免疫调节物质，是人体非特异性黏膜免疫系统中重要的非抗体保护蛋白，在抗感染抗炎症的第一线发挥作用；铁饱和的形式则主要作为人体生物利用度最高的铁源，用以调节机体铁代谢。当前，国内外对人乳铁蛋白理论及应用的研究都非常重视，开发应用前景十分广阔,可产生巨大的社会和经济效益。特别是其广谱而独特的抗微生物活性，已使之成为抗菌、抗病毒类新药设计的重要候选物。由于自然状态下人乳铁蛋白含量稀少，且从人乳中纯化成本极高，利用基因工程技术制备是实现产业化生产唯一的途径。
近年来，国内外已有利用转基因技术在动物乳腺中生产重组人乳铁蛋白方法的报道，但目前人们还未完全掌握人乳铁蛋白基因表达控制的规律、对导入的目的基因对宿主染色体和目的基因本身的影响以及整合的详细机理。同时，转基因动物的成功率低，目的蛋白的表达水平远低于乳汁中总蛋白含量，且目的基因的分离、改造、载体构件、体细胞克隆等技术不够成熟。另外，动物的自身机体保护系统会产生对外源性物质产生排斥反应，如产生蛋白质水解，糖基化形式与人类不同，对产品的安全性构成了极大的威胁。因此，如何利用基因技术安全高效的生产人乳铁蛋白是一项亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术方法的缺陷，本发明提供了一种曲霉菌株，及利用曲霉菌株发酵实现的安全高效、适于高密度培养的人乳铁蛋白的生产方法。
本发明一方面提供了一种曲霉菌株：泡盛曲霉菌株(Aspergillus sp)KS-11-08，所述菌株保藏编号为CGMCC No.15674；保藏日期为2018年5月7日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明另一方面提供了一种利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，包括：
将所述菌株进行培养，得到种子液；
将上述种子液进行发酵；
得到含有重组人乳铁蛋白的发酵液。
在一种优选实施例中，所述曲霉菌株为泡盛曲霉菌株(Aspergillus sp)KS-11-08，所述菌株保藏编号为CGMCC No.15674；保藏日期为2018年5月7日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一种优选实施例中，所述曲霉菌株可以先接种于斜面培养基，培养得到成熟的菌种，然后将得到的菌种接种于液体种子培养基进行培养。
在一种优选实施例中，所述曲霉菌株接种于斜面培养基之后得到的一级菌种，所得一级菌种可以继续接种于固体培养基培养，得到二级或三级菌种，所述一、二、三级菌种均可接种至液体种子液培养基进行培养。
优选地，所述斜面培养基包括碳水化合物、含氮物质、无机盐、微量元素、维生素和水。
在一种优选实施例中，以斜面培养基重量为基准，斜面培养基包括：麦芽糊精1.0％，葡萄糖0.5％，酵母浸粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，氯化钙：0.2％，琼脂2.0％。
在一种优选实施例中，所述斜面培养基的培养温度为20-35℃，优选为25-33℃，优选为28～30℃。
在一种优选实施例中，所述斜面培养基的培养湿度为10-80％，优选为20-60％。
在一种优选实施例中，所述斜面培养基的培养时间为至少2天，优选为至少5天，更优选为2-10天，更优选为3-8天，如6天、7天。
优选地，所述液体种子培养基包括水、碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子。
优选地，所述成长因子包括维生素、氨基酸、碱基、色素、激素中的种或几种。
在一种优选实施例中，以液体种子培养基的重量为基准，液体种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。
在一种优选实施例中，所述菌种可以以孢子的形式接种于液体种子培养基中。
在一种优选实施例中，所述液体种子培养基的培养温度为20-35℃，优选为25-33℃，优选为28-30℃。
在一种优选实施例中，所述液体种子培养过程中需要搅拌；优选地，搅拌速度为200-500rpm。
在一种优选实施例中，所述液体种子培养过程中，培养过程需要时间20-40h；优选为24-36h；优选为26-30h。
在一种优选实施例中，所述液体种子培养过程中，控制溶氧值≥25％，优选为≥30％。
在一种优选实施例中，所述种子液可以接种至玻璃发酵罐或者不锈钢种子罐中的发酵培养基中进行发酵。
在一种优选实施例中，所述种子液接种至发酵培养基的接种量占发酵培养基重量的5-20％；优选为6-15％；优选为8-12％。
在一种优选实施例中，所述发酵培养基包括水、碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子。
优选地，所述成长因子包括维生素、氨基酸、碱基、色素、激素中的种或几种。
在一种优选实施例中，以发酵培养基的重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，玉米蛋白粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％，氯化钙0.2％。
在一种优选实施例中，在所述发酵过程中补入诱导物。
在一种优选实施例中，所述诱导物在发酵36小时后加入；优选为40小时后加入，更优选为48小时后加入。
在一种优选实施例中，所述诱导物，可以为甘油、乳糖、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)、蔗糖、乳酸菌肽、缬氨酸等中的一种或几种。
在一种优选实施例中，所述诱导物为甘油。
在一种优选实施例中，所述诱导物、优选为甘油可以是纯净物(但应当理解的是可以含有不可避免的杂质)的形式补入，或者也可以时以溶液的形式补入；优选地，所述溶液、优选为甘油溶液的质量浓度为5-20％；更优选为10-15％。
在一种优选实施例中，所述诱导物可以采用连续流加补入的方式补入所述发酵液，也可以分批补入。
在一种优选实施例中，所述甘油溶液每24h的补入量占发酵液重量的0.05-0.2％；优选为0.08-0.12％；更优选为0.09-0.1％。
在一种优选实施例中，所述诱导物需要进行灭菌处理。
在一种优选实施例中，所述甘油溶液采用分批补入发酵液，每次补入的间隔时间为12-36h；优选为20-28h；更优选为18-24h。
在一种优选实施例中，所述发酵培养发酵过程中，还可以补入葡萄糖溶液。
在一种优选实施例中，所述发酵培养发酵过程中，培养基中葡萄糖质量浓度维持在不低于0.2％，更优选为0.5％，更优选为不低于1.0％，更优选为不低于2.0％。
优选地，所述葡萄糖溶液可以采用连续流加补入的方式补入所述发酵液，也可以分批补入。
在一种优选实施例中，可以通过调节补入葡萄糖溶液的速度控制所述发酵液中葡萄糖的浓度。
在一种优选实施例中，所述发酵培养的发酵温度为20-35℃；优选为24-36℃；优选为28-30℃。
在一种优选实施例中，所述发酵培养过程中，需要搅拌；优选地，所述搅拌的速度为200-600rpm。
在一种优选实施例中，所述发酵培养过程中，所述发酵过程中可以通过调整搅拌速度控制发酵罐上溶氧值。
在一种优选实施例中，所述发酵培养过程中，所述发酵罐上溶氧值为≥30％
在一种优选实施例中，所述发酵培养过程中，罐压为0.02-0.06MPa。
本发明提供的一种曲霉菌株及利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，具有以下有益效果：
(1)重组人乳铁蛋白基因序列转入曲霉菌种，并在曲霉菌种中得到正常表达。申请人出乎意料的发现，相比于其他宿主，重组所得到的泡盛曲霉KS11-08，人乳铁蛋白表达效率明显提高。
(2)申请人还发现，在发酵过程中，适量添加诱导物，转入的重组人乳铁蛋白基因在诱导物的作用下可以得到高效表达，显著提高了人乳铁蛋白的发酵产量。
(3)本发明重组菌株培养方法简单，发酵原料来源丰富，且价格低廉，经济效益高，微生物生长繁殖快，生长周期短，产量高，可进行大规模生产。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
人乳铁蛋白cDNA序列详见Powell M.J.(Nucleic Acids Res.1990,18:4013)、Rey M.W.(Nucleic Acids Res.1990,18:5288)、Kim S.J.(Mol.Cells,1998,8:663)等人的报到。参照《人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达》(程小广，广东医学院，2012年硕士论文)的方法，将该人乳铁蛋白基因进行克隆并在曲霉菌中进行表达。
显微镜观察，所得曲霉菌株在查氏琼脂上生长迅速，具有辐射状沟纹；质地丝绒状或兼有絮状，分生孢子结构大量产生，有的菌株在中部或边缘较密集，橄榄褐色至黑褐色或暗巧克力褐色，有的菌株则在中部带灰褐色；在麦芽汁琼脂上生长较快，大多平坦，少数具辐射状沟纹；质地丝绒状或具少量不育性过度生长，分生孢子结构大量产生，呈暗褐色至黑色。168rDNA序列检测结果显示其属于泡盛曲霉，命名为泡盛曲霉菌株(Aspergillus sp)KS-11-08。所述菌株保藏编号为CGMCC No.15674；保藏日期为2018年5月7日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供的一种利用所述曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，包括：
将所述菌株进行培养，得到种子液；
将上述种子液进行发酵；
得到含有重组人乳铁蛋白的发酵液。
实施例1
诱导物选用质量浓度为12％的甘油溶液，补入方式采用分批补入。
一种利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，包括：
(1)将泡盛曲霉KS11-08，接种于斜面培养基，以斜面培养基重量为基准，所述斜面培养基包括：麦芽糊精1.0％，葡萄糖0.5％，酵母浸粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，氯化钙0.2％，琼脂2.0％。斜面培养条件为：温度28℃，湿度40％；培养时间3天，得到一级菌种孢子。
按照8％接种量，将得到的孢子接种液体种子培养基中，以液体种子培养基的重量为基准，所述液体种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。液体种子培养条件为温度28℃，搅拌速度200rpm，通气量0.8vvm，溶氧值≥30％，培养时间28h。得到成熟的种子液。
(3)将上述种子液按照质量分数为8％的接种量接种至玻璃发酵罐中；以发酵培养基的重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，玉米蛋白粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％，氯化钙0.2％；发酵条件为：温度28℃，通气量0.8vvm，搅拌速度200rpm，发酵过程中通过提高搅拌速度控制发酵罐上溶氧值≥30％。发酵培养到48h时，开始补入经过灭菌处理的12％浓度的甘油溶液，每间隔24h补入一次，每次补入甘油的重量为发酵培养基重量的0.1％，即在发酵到48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h时各补入一次。发酵培养到50h时，开始连续流加补入葡萄糖溶液，通过调节补入葡萄糖的速度控制发酵液中葡萄糖的浓度保持在2％。
(3)第200h时，培养结束，得到最终发酵液。
本实施例所得最终发酵液中重组人乳铁蛋白的含量为3.28g/L。
实施例2
诱导物选用质量浓度为15％的甘油溶液，补入方式采用分批补入。
一种利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，包括：
(1)按照8％的接种量，将泡盛曲霉KS11-08接种于斜面培养基，以斜面培养基的重量为基准，所述斜面培养基包括：麦芽糊精1.0％，葡萄糖0.5％，酵母浸粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，氯化钙0.2％，琼脂2.0％。斜面培养条件为：温度30℃，湿度60％；培养时间3天，得到一级菌种；将一级菌种接种于相同配方的斜面培养基，培养时间3天，得到二级菌种孢子。
按照8％接种量，将所述菌种孢子接种液体种子培养基中，以液体种子培养基的重量为基准，所述液体种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。液体种子培养条件为温度30℃，搅拌速度400rpm，通气量0.08vvm，控制溶氧值≥30％，培养时间30h。得到成熟的种子液。
(2)将上述种子液按照质量分数为10％的接种量接种至不锈钢种子罐中的发酵培养基；以发酵培养基的重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，玉米蛋白粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％，氯化钙0.2％。发酵条件为：温度30℃，通气量0.8vvm，搅拌速度400rpm，发酵过程中通过提高搅拌速度控制发酵罐上溶氧值≥30％。发酵培养到48h时，开始补入经过灭菌处理的15％浓度的甘油溶液，每间隔24h补入一次，每次补入甘油的重量量为发酵培养基重量的0.1％，即在发酵到48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h时各补入一次；发酵培养到50h时，开始连续流加补入葡萄糖溶液，通过调节补入葡萄糖的速度控制发酵液中葡萄糖的浓度保持在1％，第180h时，停止补入葡萄糖；
(3)第200h时，培养结束，得到最终发酵液。
本实施例所得最终发酵液中重组人乳铁蛋白的含量为3.15g/L。
实施例3
诱导物选用质量浓度为10％的甘油溶液，补入方式采用连续流加补入。
一种利用曲霉菌株发酵生产人乳铁蛋白的方法，包括：
(1)将泡盛曲霉KS11-08，接种于斜面培养基，以斜面培养基配的重量为基准，斜面培养基包括：麦芽糊精1.0％，葡萄糖1％，酵母浸粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，氯化钙0.2％，琼脂2.0％。斜面培养条件为：温度29℃，湿度50％；培养时间3天，得到一级菌种孢子。
按照8％接种量，将所述菌种孢子接种液体种子培养基中，以液体种子培养基的重量为基准，所述液体种子培养基包括：麦芽糊精3.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉1.0％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。液体种子培养条件为温度29℃，搅拌速度500rpm，通气量0.8vvm，控制溶氧值≥30％，培养时间28h。得到成熟的种子液。
(2)将上述种子液按照质量比例为12％的接种量接种至玻璃发酵罐中的发酵培养基；按照发酵培养基的重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖10％，麦芽糊精3％，玉米蛋白粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％，氯化钙0.2％。发酵条件为：温度28℃，通气量0.8vvm，搅拌速度500rpm，发酵过程中通过提高搅拌速度控制发酵罐上溶氧值≥30％。发酵培养到40h时，开始补入经过灭菌处理的质量分数为10％浓度的甘油溶液，每24小时的补入甘油的重量为发酵液重量的0.1％。发酵培养到第45h时，开始连续流加补入葡萄糖溶液，通过调节补入葡萄糖的速度控制发酵液中葡萄糖的浓度保持在2％。第210h时，停止补入葡萄糖。
(3)第220h时，培养结束，得到最终发酵液。
本实施例所得最终发酵液中重组人乳铁蛋白的含量为3.35g/L。
对比例1
采用泡盛曲霉AS2437(中国农科院农产品加工研究所食品微生物与酶工程重点实验室提供)，按照实施例1的方式进行发酵，所得最终发酵液无重组人乳铁蛋白。
对比例2
采用泡盛曲霉KS11-08，按照实施例1的方式进行发酵，但不加甘油，所得最终发酵液中重组人乳铁蛋白的含量为2.31g/L。
对比例3
采用《人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达》(程小广，广东医学院，2012年硕士论文)的方法获得的重组乳酸菌，参照实施例1的方式，发酵液中人乳铁蛋白含量低于0.5g/L。
可见，本发明泡盛曲霉KS11-08能够稳定、较高效率的表达人乳铁蛋白，同时补加甘油作为诱导物的情况下，人乳铁蛋白表达效率进一步显著提高。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。