一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法与流程

本发明涉及生物工程领域中进行基因转化的方法，具体涉及一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法。
背景技术：
兰科植物(俗称兰花)是单子叶植物第一大科，有801属近3000种。多数兰花种类具有很高的观赏和药用价值，因此，兰花在花卉产业中占有举足轻重的地位。随着新一代测序技术的发展，越来越多非模式物种的基因组已完成测序，功能基因的挖掘和分子机理研究成为植物学尤其是观赏作物性状改良，以实现定向育种的重要研究内容。然而多数兰花品种生长缓慢，尚未建立成熟稳定的转基因技术体系，成为兰科植物功能基因挖掘的分子育种的限制因素。目前报道的兰花转基因方法从遗传转化到获得转基因成苗需要仍2-3年时间，且转化效率低，因此，缺乏高效快速的兰花遗传转化体系仍然是兰花分子生物学研究基因功能，以及分子育种的关键制约因素。瞬时表达是指将目的基因通过植物表达载体导入植物活体组织内，并在一段时间内大量表达，能够快速地反映基因的功能，在启动子活性、基因功能鉴定以及蛋白互作等方面得到广泛应用。基因瞬时表达的方法主要有农杆菌侵染和基因枪轰击植物组织，以及基于原生质体的转化方法。基因枪法对设备和成本要求较高，而原生质体对材料有较高要求，农杆菌转化法简单快捷，是最易于实施的方法，目前已在拟南芥、水稻、烟草以及多年生果树叶片、果实等组织中应用，但是在兰科植物中尤其兰科植物花器官中还未见报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效，快速，简便的用农杆菌介导的在兰花花器官中快速表达目的基因的方法，可用于体内验证兰花基因功能、蛋白互作、启动子活性分析等。本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：(1)表达载体的构建：将目标基因克隆至pmd19-tvector载体，经测序确认后，使用双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切，纯化的pun1301质粒载体，得到含有目标基因的pun1301质粒；(2)含有目标基因的农杆菌转化培养：采用冻融法将步骤(1)得到的含有目标基因的pun1301质粒导入农杆菌感受态细胞，加入lb培养液培养4～6h，离心弃上清，用lb培养液重悬沉淀，得混合物；将混合物涂板到含有抗生素的lb板上，培养48～72h，待长出菌落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有目标基因的农杆菌；(3)侵染液的制备：将含有目标基因的农杆菌，加入含有抗生素的lb培养液，培养直至菌液od＝0.5～1.0，将菌液离心，弃上清，用重悬液重悬至菌液od＝0.3～0.5，得侵染液；(4)农杆菌注射法导入目标基因：采用注射法将步骤(3)得到的侵染液注入兰花花芽，然后进行正常的光温水肥管理。优选，所述的在兰花中实现基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：(1)表达载体的构建：利用基因特异性引物扩增目标基因，并克隆至pmd19-tvector载体，经测序确认后，使用双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切，纯化的pun1301质粒载体，得到含有目标基因的pun1301质粒；(2)含有目标基因的农杆菌转化培养：往农杆菌感受态细胞中加入步骤(1)得到的含有目标基因的pun1301质粒，混匀，经多次液氮速冻-解冻处理后，加入lb培养液于28℃，200rpm培养4～6h，离心弃上清，用lb培养液重悬沉淀，得混合物；将混合物涂板到含有50μg/ml卡那霉素+32μg/ml庆大霉素的lb板上，于28℃培养48～72h，待长出菌落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有目标基因的农杆菌；(3)侵染液的制备：将含有目标基因的农杆菌，加入含有50μg/ml卡那霉素+32μg/ml庆大霉素的lb培养液，于28℃，200rpm培养直至菌液od＝0.5～1.0，将菌液离心，弃上清，用重悬液重悬至菌液od＝0.3～0.5，得侵染液；(4)农杆菌注射法导入目标基因：选取长度为2～5cm的兰花花芽为接种材料，用注射器从上而下注入步骤(3)得到的侵染液，使花芽外苞片出现湿润现象，进行正常的光温水肥管理。上述的目标基因为绿色荧光蛋白gfp基因或兰花ap3基因。步骤(2)液氮速冻-解冻处理具体为：液氮速冻1min，37℃解冻5min。步骤(3)的重悬液组成为：10mmmes+10mmmgcl2+200mmas，ph为5.6。所述的兰花花芽是2-5cm长的国兰或蝴蝶兰的花芽。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本方法具有转化周期短、操作简便、转化效率高、成本较低的优点，尤其适合兰花体内基因功能验证、启动子活性、蛋白相互作用等分析。(2)本发明采用基因瞬时表达的手段，选用稳定表达载体，基因可持续表达数周，最直接的能够在兰科植物中获得高表达植株表型，为花色、花型和花期改良奠定基础。(3)本发明利用农杆菌侵染法在兰花活体材料中实现目标基因瞬时高表达，避免了兰科植物遗传转化体系不成熟的问题，最大程度节省了转化周期和成本，可用于兰科植物分子生物学研究中批量进行基因功能鉴定，多基因相互作用分析等。附图说明图1为注射农杆菌3天、5天以及1、2、3、5周gfp信号检测情况。图2为peap3基因表达量分析。ck表示含有空载体的农杆菌液注射植株，line1-7表示含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液注射植株。图3为蝴蝶兰体内peap3基因瞬时高表达后表型分析。ck表示含有空载体的农杆菌液注射植株，line4、5表示含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液注射植株，lip表示蝴蝶兰唇瓣。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1在兰花中瞬时表达绿色荧光蛋白gfp基因1.含有目标基因的农杆菌转化培养1)pun1301-egfp载体构建(本实验室保存)测序无误之后，使用bamhi和saci双酶切(thermofisherscientific)，对本实验室保存pbi121-egfp载体进行酶切，回收纯化egfp目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切，纯化的pun1301载体上命名为pun1301-egfp。2)将-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约10μg含有egfp基因的植物表达载体pun1301-egfp，轻柔混匀，冰上放置30min。3)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次，加入1mllb培养液于28℃恒温振荡培养4～6h，200rpm。4)待菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min，弃上清，用100μl的lb培养液重悬农杆菌沉淀，得混合物。5)将得到的混合物涂板到含50μg/ml卡那霉素和32μg/ml庆大霉素的lb板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有pun1301-egfp质粒的农杆菌。2.侵染液的制备挑选含有pun1301-egfp质粒的单克隆农杆菌株，加入4ml含50μg/ml卡那霉素和32μg/ml庆大霉素的lb培养液于28℃恒温振荡培养12h，200rpm。取1μl菌液进行pcr扩增，引物gfp-f：atggtgagcaagggcgagga和gfp-r：tgtacagctcgtccatgccg(seqidno:1和seqidno:2)。pcr检测片段正确后扩大培养体系至50ml，于28℃恒温振荡培养12～16h直至od＝0.5～1.0，将菌液在4℃，5000rpm离心5min，离心后的农杆菌用重悬液(10mmmes+10mmmgcl2+200mmas，ph＝5.6)10～20ml重悬，使od＝0.3～0.5，室温静置2h以上，得到含农杆菌的侵染液。3.农杆菌注射法导入目标基因选取2～5cm长建兰花芽为接种材料，用1ml注射器从上而下注入100ul含农杆菌的侵染液，使花芽外苞片出现湿润现象，套袋并进行正常光温水肥管理，5天后重复操作一到两次。4.gfp信号检测分别在注射农杆菌后3、5、7天以及2周、3周、5周后，用荧光体视显微镜(leicam205fa)镜检测花芽gfp信号，发现gfp持续表达(图1)。实施例2兰花ap3基因的瞬时表达分析1.rna的提取和cdna的合成：取1g蝴蝶兰‘绿熊’花芽放入经液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状。总rna提取方法参照天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒，参照revertaidfirststrandcdna操作说明书合成cdna第一链。2.表达载体构建：基于ncbi数据库以及兰花转录组数据库(http://orchidstra2.abrc.sinica.edu.tw/orchidstra2/index.php)获得蝴蝶兰花发育相关ap3基因(seqidno:3)，并利用已报道的拟南芥、水稻等ap3家族基因序列进行比对分析确认。利用pcr技术，结合引物对ap3-f:agatttgaagatggggaggg和ap3-r：tatatcaagcgaggcgaaga(seqidno:4和seqidno:5)扩增获得该基因，并采用测序手段进一步验证。以反转录得到的cdna模板进行pcr扩增，反应体系如下：表1pcr反应体系反应具体扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s；57.5/61.5℃退火40s；72℃延伸1min；72℃彻底延伸10min，变性到延伸40个循环。反应结束后，pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，取扩增产物与10×loadingbuffer混匀，点入胶孔，在0.5×tbe电泳缓冲液中电泳15min(120v电压)，在凝胶成像仪上观察条带的清晰度和完整性，并进行切胶回收。将回收产物与载体pmd19-tvector进行连接，在200μl离心管中加入如下试剂，室温下连接5～10min，连接反应体系如下：表2连接反应体系将重组质粒采用热激法导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，于37℃150rpm培养1h后，均匀涂布于含100μg.ml-1氨苄青霉素的固体lb培养基(配方为胰蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，琼脂糖15g)上，挑取单菌落，接种到200μllb+amp培养液中培养4h。取1μl菌液为模版进行pcr初步检测。用t载体通用引物测序确定正向或反向重组。经测序获得序列正确的质粒dna使用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切，回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶的酶切，纯化的pun1301载体上，得到pun1301-peap3。酶切反应体系为下表所示：反应成分反应体积10×buffertango5μlbamhⅰ/kpnⅰ2μlpun1301质粒/peap3片段30μlddh2o13μl3.农杆菌gv3101的转化1)将-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰上化冻，待细胞完全溶解后，加入约1μg质粒(pun1301-peap3)，轻柔混匀，冰上放置30min。2)液氮速冻1min后37℃，5min化冻，重复一次，加入1mllb于28℃恒温振荡培养4～6h，200rpm。3)菌液摇浓后，4000rpm室温下离心5min，弃上清，用100μl的lb培养液重悬农杆菌沉淀，得混合物。4)将得到的混合物涂板到含50μg/ml卡那霉素和32μg/ml庆大霉素的lb板上，置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，待长出群落后再挑菌重新划线以确保是单克隆，得到含有pun1301-peap3质粒的农杆菌。4.农杆菌直接注射法转化兰花花芽用od＝0.3～0.5，含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液直接注射蝴蝶兰品种‘绿熊’幼嫩花芽(3～5cm长)，以pun1301空载体作为对照。每周注射一次，连续三周，置于培养室中继续生长。1周后，收集接种后花芽进行基因表达量检测。5.接种农杆菌后兰花peap3基因表达量分析为了确定peap3基因在兰花中的生物学功能，分别以蝴蝶兰品种‘绿熊’未接种的野生型、空载体和接种后叶片的cdna为模板，采用引物peap3rt-f:aagtaaggcagaggatggg(seqidno:6)和peap3rt-r:tgcttgaatcctcgtggaac(seqidno:7)，检测注射农杆菌后兰花中peap3基因的表达量。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、57℃10s、72℃26s)。以上述同样的cdna作为模板，使用蝴蝶兰actinqrt-f:cgtctagatttagccggtcg(seqidno:8)和actinqrt-r:cctgcccatcaggtagttca(seqidno:9)作为引物，扩增actin作为内参。按照下列程序：95℃预变性30s，然后经40个循环(95℃10s、59.5℃10s、72℃30s)，72℃延伸10min。采用icycleriqreal-timepcrdetectionsystem(bio-rad,usa)进行扩增，操作按照hiscriptⅱqrtsupermixforqpcr(+gdnawiper)(vazymebiotechco.,ltd)试剂盒说明书进行。结果表明在含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液注射植株中peap3基因的表达量均提高，选取其中三个株系用于后续表型分析(图2)。6.高表达ap3兰花表型分析接种含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液注射植株的花芽生长2个月后，跟未接种的野生型或空载体相比，含有pun1301-peap3质粒的农杆菌液注射植株花朵花器官显著变异，花瓣唇瓣化或有更多唇瓣产生(图3)。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>广东省农业科学院环境园艺研究所<120>一种在兰花中实现基因瞬时表达的方法<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列gfp-f(artificialsequencegfp-f)<400>1atggtgagcaagggcgagga20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列gfp-r(artificialsequencegfp-r)<400>2tgtacagctcgtccatgccg20<210>3<211>675<212>dna<213>蝴蝶兰(phalaenopsisaphroditerchb.f.)<400>3atggggagggggaagatagagattaagaagatagagaatccgactaatcggcaggtgacc60tactcgaagaggagagctgggattatgaagaaggcgagggagatcactgttctctgcgat120gctgaggtttcgcttatcatgttctcgagtactgggaagttttctgagtactgtagccct180tcgacggaaacgaagaaggtttttgaacgctaccagcaggtatctggcattaacttgtgg240agctcgcagtacgagaagatgctgaatacgcttaaccattcgaaggagatcaatcgcaat300ctgaggagggaagtaaggcagaggatgggggaagatcttgagggactggatatcaaggaa360ctgcgcggtcttgagcaaaacattgatgaggcattgaagctagtacgaaatagaaaatat420catgtaatcagtactcaaacggacacctacaagaagaagttgaagaactcccaagaaaca480caccggaacttaatgcacgaattggaaatcgttgaggaccacccagtgtatgggttccac540gaggattcaagcaattatgagggtgttcttgctcttgcaaatgacgggtctcacatgtat600gccttccgggtgcaacccaaccaacaaaatcttcaaggaacgggatatagctctcacgat660cttcgcctcgcttga675<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列ap3-f(artificialsequenceap3-f)<400>4agatttgaagatggggaggg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列ap3-r(artificialsequenceap3-r)<400>5tatatcaagcgaggcgaaga20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列peap3rt-f(artificialsequencepeap3rt-f)<400>6aagtaaggcagaggatgggg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列peap3rt-r(artificialsequencepeap3rt-r)<400>7tgcttgaatcctcgtggaac20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列actinqrt-f(artificialsequenceactinqrt-f)<400>8cgtctagatttagccggtcg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列actinqrt-r(artificialsequenceactinqrt-r)<400>9cctgcccatcaggtagttca20当前第1页12