一种参与西红花酸合成的乙醛脱氢酶编码基因的筛选鉴定及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及栀子中西红花酸生物合成基因的筛选、功能验证方法及应用。

背景技术：

西红花苷为脱辅基类胡萝卜素化合物，最初是从被誉为“红色黄金”的西红花中提取出来的，主要在西红花的柱头中积累，具有较高的药用价值。西红花酸是西红花苷合成的前体物质，通过与不同的数目的糖基结合形成西红花苷。西红花酸具有很大的潜在药用价值，现代药理学研究证明其在抗肿瘤、抗氧化、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗抑郁等方面皆发挥作用。同时，西红花酸也被作为一种食用色素来应用。但是，西红花酸的来源主要依靠于从西红花中提取分离和纯化，由于西红花资源的不足以及提取效率低等原因，大大限制了其大规模的应用。

值得关注的是，茜草科植物栀子果实中富含西红花苷，与西红花相比，栀子资源丰富、易于取材，被认为是西红花苷理想的替代资源。西红花苷的生物合成途径研究在国际上备受关注，本研究旨在西红花苷合成前体物质西红花酸的生物合成途径找到突破口，揭示栀子中参与西红花酸生物合成途径中关键酶基因aldh的功能，为西红花酸以及西红花苷的合成奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种催化西红花酸二醛合成西红花酸的乙醛脱氢酶基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种栀子中西红花酸合成关键酶基因的筛选方法。

本发明的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因gjaldh2c3的功能验证方法。

本发明提供的gjaldh2c3基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示，或其突变序列。

本发明提供的gjaldh2c3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示，或其突变序列。

本发明目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于转录组的栀子西红花酸合成关键酶基因筛选，步骤如下：

1)基于栀子基因组，鉴定栀子aldh基因家族成员，构建进化树分析栀子与其他物种aldh之间的进化关系，初筛栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸二醛至西红花酸的关键酶蛋白序列。

2)基于栀子不同组织部位转录组数据，分析差异基因表达，进一步筛选栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸二醛至西红花酸的关键酶基因。

技术方案二：关键酶基因gjaldh2c3的功能验证。采用原核表达体系，以西红花酸二醛为底物，体外鉴定乙醛脱氢酶gjaldh2c3的功能。

本发明公开了栀子中西红花酸二醛合成至西红花酸的乙醛脱氢酶gjaldh2c3基因的筛选及功能鉴定体系，验证gjaldh2c3具有氧化西红花酸二醛至西红花酸的功能，对阐明西红花酸及西红花苷的生物合成途径提供分子基础，同时具有重大的应用价值。

附图说明

图1：基于栀子基因组的乙醛脱氢酶gjaldh家族成员鉴定及进化关系。

图2：gjaldh编码基因在栀子不同组织部位中的差异表达。flower：花；leaf：叶；root：根；stem：茎；fruitlet：幼果；greenfruit：绿果；redfruit：红果。

图3：gjaldh2c3的体外功能验证。a：gjaldh2c3能够催化西红花酸二醛合成西红花酸，反应检测到中间产物西红花酸半醛；b：推测的西红花酸合成途径。

图4：液相-质谱联用鉴定产物西红花酸和西红花酸半醛。

具体实施方案

以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

实施例1基于栀子基因组与转录组数据gjaldh基因的筛选及系统进化分析

1.1实验方法

基于栀子基因组数据，从tair数据库中提取拟南芥的aldh蛋白序列通过blastp搜索栀子蛋白序列库，鉴定出的同源基因gjaldhs进一步手工校正。栀子和拟南芥的gjaldh蛋白序列通过clustalw2进行比对，利用mega6软件构建nj系统进化树，boostrap选择重复1000次。利用hisat2将栀子根、茎、叶、花、幼果、绿果、红果的rna-seq转录组数据比对至栀子基因组，采用cuffiinks计算差异表达分析。前期研究表明西红花苷特异分布在栀子的绿果和红果中，基于共表达分析筛选与西红花苷分布一致的候选的gjaldh基因。

1.2结果与分析

基于栀子基因组数据，筛选出了19个gjaldh，主要分布于10个亚家族，其中包括7个aldh2，2个aldh3，1个aldh5，3个aldh6，1个aldh10，1个aldh11，1个aldh12，1个aldh18，1个aldh22。通过转录组数据分析，发现gjaldh2c3基因在栀子果实和花中特异性表达，且具有最高的表达量。因此，推测其为栀子西红花苷生物合成途径中催化西红花酸二醛至西红花酸的关键酶基因。

实施例2gjaldh2c3的功能验证

2.1实验方法

将gjaldh2c3编码基因克隆至pcoldi载体中形成pcoldi-gjaldh2c3重组表达载体，将载体转化至bl21大肠杆菌表达菌株中。取过夜诱导的菌液2ml加入50mllb液体培养集中(含有50μg/ml氨苄抗性的培养基)，37℃，200rpm，活化2-3h，待其od600至0.4-0.5时，15℃低温刺激，并加入终浓度为0.3mm的iptg进行诱导，15℃，130rpm。诱导24h后，离心取菌体沉淀进行蛋白纯化，并利用bca蛋白试剂盒测定其浓度。

将纯化出来的蛋白在体外按照以下反应体系进行功能验证(50μl)：100mmtris-hcl(ph8.5)，50μg纯化的蛋白，1mmnadp⁺，40μm的西红花酸二醛。用甲醇终止反应后混匀过0.22μm滤膜，利用uplc检测其化学成分。仪器型号：thermoultimate3000。进样量10μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100×2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv440nm，流动相：(a)：乙腈(含0.1％甲酸)，(b)：水(含0.1％甲酸)，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a线性增长至50％a；5-8min，50％a线性增长至90％a；8-10min，90％a线性增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态。

2.2结果与分析

体外催化结果显示gjaldh2c3能够将西红花酸二醛转化，反应产生2个新的色谱峰，一个与西红花酸具有相同的色谱行为(如：保留时间、光谱图等)，另一个介于西红花酸与西红花酸二醛之间，催化产物的定性分析需要进行液质检测。

实施例3催化产物的定性分析

3.1实验方法

利用agilenttechnologies1290infinityii和6545q-tof液质联用仪器检测产生的反应提取出来的产物，进行定性分析。进样量10μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100×2.1mm)，柱温：30℃。色谱条件：uv440nm，流动相：(a)：乙腈(0.1％甲酸)，(b)：水(0.1％甲酸)，流速：0.3ml/min，洗脱程序：0-5min，10％a线性增长至50％a；5-8min，50％a线性增长至90％a；8-10min，90％a线性增长至100％a，100％a持续一分钟后回到起始状态。6545q-tof质谱参数为：干燥气体温度为325℃，流速6l/min；鞘气为350℃，流速12.0l/min；喷雾器为45psig；vcap为4000v。

3.2结果与分析

液质检测结果在aldh2c3的催化作用下将西红花酸二醛(crocetindialdehyde)转化为西红花酸(crocetin，[m+h]⁺：m/z327.1601))和西红花酸半醛(crocetinsemidialdehyde，[m-h]⁺：m/z311.1686)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。