一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用。

背景技术：

细胞转染技术指将带有目的基因的外源dna或rna掺入宿主细胞而使细胞获得新遗传标志的方法。它是分析细胞内基因、基因产物、蛋白表达功能的重要分析工具。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞中特定基因的表达来研究基因、基因产物及重组蛋白的功能。细胞转染技术在基因工程领域具有巨大的应用价值，例如通过基因疗法将目的基因转染进细胞来治疗疾病或改善患者的症状，通过中国仓鼠卵巢细胞获得的人组织纤溶酶原激活物等。

迄今研究开发的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，目前最常用的非病毒性转染介质是脂质体和阳离子聚合物，它们的特点和病毒类似，容易透过细胞膜。病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等，虽然转染效率高，但存在着在人体内有自我复制的风险；而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点，由于病毒介质的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。

阳离子聚合物可作为一种非病毒载体,具有类细胞结构和生物膜的特性,在体内可降解同时可以保护其运载基因片段的生物活性,而且操作简单、重复性好，是一种有临床应用潜力的基因转染载体。阳离子聚合物(cationicpolymers)转染原理是带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用并通过内吞作用进入细胞。常用的阳离子聚合物有聚l-赖氨酸(pll)、聚乙烯亚胺(pei)、树状病毒包膜糖蛋白聚合物、壳聚糖等。

但因为细胞毒性非常大，在体内转染过程中引起血细胞凝固等问题，现有的阳离子聚合物不能同时具备安全低毒和高效转染两个基本要求，因此，在很大程度上限制了其应用。

病毒包膜糖蛋白b(envelopeglycoproteinb,gb)，可通过结合哺乳动物细胞表面广泛存在的受体上，例如通过哺乳动物各种细胞上的乙酰肝素粘多糖(heparinsulfateproglycan，hspg)介导病毒入侵过程，而且gb糖蛋白可以在不依赖其他病毒囊膜蛋白的情况下独自发挥功能。同时gb与宿主细胞的结合也可以不依赖hspg，同时gb还可结合到细胞整合素(integrin)或表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)从而促进病毒入侵过程。尽管病毒包膜糖蛋白肽本身可以快速和高效的进入细胞，但是其结合和装载sirna或质粒dna的能力有限，单独使用转染多肽无法高效运输sirna或质粒dna。

技术实现要素：

有鉴于病毒转染的安全风险、阳离子聚合物的低效和对细胞毒副作用，本发明公开了一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用，所述非病毒转染试剂可以提高转染效率，同时减少单用一种阳离子聚合物对细胞的毒副作用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种非病毒转染试剂，包括：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽、终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。

进一步的，所述非病毒转染试剂，包括：终浓度为20ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为8μg/ml的重组多肽、终浓度为40ng/ml阳离子脂质体。

进一步的，所述非病毒转染试剂的阳离子聚合物是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物。

优选地，所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺或壳聚糖等。

进一步的，所述重组多肽为病毒包膜糖蛋白；所述病毒包膜糖蛋白为树状病毒包膜糖蛋白，优选为重组疱疹病毒包膜糖蛋白。

优选地的，所述重组gb多肽的氨基酸序列为seqidno:1或seqidno：2所示。

进一步的，所述阳离子脂质体为双十二烷基二甲基溴化铵ddab、胺类阳离子类脂包括季铵、伯胺、仲胺等胺盐类脂质体，例如氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵dotma、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵dorie、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵dori等季铵盐脂质体。

进一步的，所述转染试剂还包括溶剂；所述溶剂为hbs(ph7.4)。

一种上述的非病毒转染的制备方法，包括以下步骤：

阳离子聚合物、重组多肽、阳离子脂质体和溶剂混合，得到非病毒转染制剂。

进一步的，所述非病毒转染试剂的制备方法，包括以下步骤：

1)、配制阳离子聚合物溶液；

2)、重组多肽的制备；阳离子脂质体/重组多肽复合物的制备；

3)、转染试剂的制备。

进一步的，所述步骤1)中阳离子聚合物溶液配制操作包括：

(1)hbs(ph7.4)的配制：将nacl溶解于超纯水，加入hepes，调ph值，定容，过滤后储存于4℃备用；

(2)将阳离子聚合物粉末溶解于步骤(1)配制的hbs(ph7.4)中，震荡均匀，配置成所需浓度的pei溶液，过滤，储存于4℃备用。

进一步的，所述步骤2)中阳离子脂质体/病毒包膜糖蛋白复合物的制备，包括：取等量阳离子脂质体和病毒包膜糖蛋白溶解于1×hbs(ph7.4)中，震荡均匀，过滤，即得到阳离子脂质体/病毒包膜糖蛋白复合物溶液，储存于4℃备用。

一种利用上述非病毒转染试剂进行转染的方法，包括：

(4)取一管，编号为1号管：无血清培养基中加入非病毒转染试剂和无血清培养基，室温5min；

(5)另取一管，编号为2号管：加入核酸和opti-mem培养基；

(6)将1号管溶液按每分钟1ml的速度缓慢加入2号管中，再涡旋混匀；静置，加入无血清培养基中；12-16h后换成完全营养培养基(例如含有10％血清dmem培养基)；离心，过滤。

进一步的，所述无血清培养基，包括opti-mem培养基、dmem、α-mem、emem,1640等基础培养基，

进一步的，所述核酸为质粒dna、基因片段、双链或单链dna片段、cdna中的一种或任意配比的多种的组合。

本发明有益效果：

本发明的转染多肽可作为细胞转染增强剂，辅助阳离子聚合物介导的细胞转染。与阳离子聚合物联合使用时，阳离子聚合物和多肽主要通过电荷作用结合在一起，这种结合是共价结合，不会破坏蛋白质的生物学活性。但是这种结合可以将蛋白质的酶切位点和结合位点掩盖，故无法被培养基中的酶所识别，从而能有效保护多肽而不受酶的降解，能够提高转染效率。

本发明提供的包膜糖蛋白b多肽在与细胞膜作用时通过侵入或结合结构使dna聚合物粘附在细胞上，提高基因转染效率，不会引起细胞毒性。

本发明提供的病毒包膜糖蛋白b多肽没有病毒载体的感染潜力，因而没有病毒复制和感染的安全问题，具有应用于基因治疗的潜力。

本发明能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本发明采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。

附图说明

图1为阳离子pei聚合物单独转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中1(a)为：明场图；1(b)为：荧光图；1(c)为：叠加图。

图2为脂质体单独转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中2(a)为：明场图；2(b)为：荧光图；2(c)为：叠加图。

图3为pei和脂质体组合物转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中3(a)为：明场图；3(b)为：荧光图；3(c)为：叠加图。

图4为pei和多肽组合物转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中4(a)为：明场图；4(a)为：荧光图；4(a)为：叠加图。

图5为脂质体和多肽组合物转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中5(a)为：明场图；5(a)为：荧光图；5(a)为：叠加图。

图6为本发明的转染试剂(阳离子、多肽和脂质体组合物)转染hela细胞后gfp基因的表达情况；其中6(a)为：明场图；6(a)为：荧光图；6(a)为：叠加图。

图7为市售的lipofectamine2000转染hela细胞后gfp基因的表达情况。

图8为转染48h和72h后个试剂转染的细胞活率和od值对比图；其中8(a)为细胞活率对比图；8(b)为od值对比图。

图9位图1至图7的转染实验的转染效率图谱；其中9-1为pei转染(图1)，转染效率为2.1％；9-2为脂质体转染(图2)，转染效率为24.5％；9-3为3.阳离子和脂质体复合物(组合物4、图3)转染效率为38.8％；9-4为3.阳离子与多肽联用(组合物3、图4)转染效率为30％；9-5为脂质体和多肽联用(组合物2、图5)，转染效率为66.2％；9-6为本发明的转染试剂(阳离子、多肽和脂质体联用(组合物1、图6))转染效率为82.6％；9-7为lipofectamine2000(图7)，转染效率为60.5％。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例1本发明转染试剂的制备

1.1阳离子双亲性多肽的诱导表达和分离纯化

一类病毒包膜糖蛋白当中融合和结合宿主细胞膜的肽段重组多肽，其包含如下所示的氨基酸序列：iyngwyax和txqmxtiyq，并且所述多肽为细胞分泌的重组多肽。

上述氨基酸序列中，x是可替代的酸性氨基酸，除了asp以外，glu也可以达到同样效果。当x为asp时，gb重组多肽的序列如seqidno：1所示；当x为glu时，多肽序列为seqidno：2所示。

当x为asp时，该重组多肽通过以下方法得到：合成ebv病毒balf4基因当中与粘附宿主有关的一段编码基因(ncbigeneid:3783680)，序列如seqidno：3，将序列正确的重组多肽gb基因与真核分泌型表达载体psectag2b通过t4dna连接酶连接，转化入感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，经酶切筛选出正确连接的重组质粒psectag2b-gb，所述重组质粒psectag2b-gb经过线性化后，转化到hek293t细胞中表达,表达产物在培养物上清中，经检测，本发明的重组多肽gb的表达量为5mg/ml～12mg/ml。

当x为glu时，序列如seqidno：4，其他方法同x为asp时的方法。

1.2阳离子聚合物的配制

1×hbs(ph7.4)的配制：将8.76gnacl溶解于900ml超纯水，加入20ml1m(4.766g)的hepes，调ph值到7.4，定容至1l，过滤(0.2μm滤膜)后储存于4℃备用。

称取50mgpei粉末溶解于50ml1×hbs(ph7.4)中，震荡均匀，配置成1.0mg/ml的pei溶液，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

1.3阳离子脂质体/重组gb多肽复合物的制备

取4mg商用阳离子脂质体双十二烷基二甲基溴化铵(ddab)，溶解于10ml的1×hbs(ph7.4)，震荡均匀，0.2μm滤膜过滤，得到400μg/ml的脂质体溶液，用8mg/ml所述1.1中所制得的重组gb多肽溶液将脂质体溶液稀释10倍,配置含有40μg/ml阳离子脂质体和8mg/mlgb多肽的阳离子脂质体/重组gb多肽复合物溶液，储存于4℃备用。

1.4本发明转染试剂的制备

将1.2制得的阳离子聚合物溶液和1.3制备得到的复合物按比例1：50混合即可。

实施例2运用本发明转染试剂进行转染

取2个1.5mlep管，其中1号管：2μl本发明的转染试剂+0.25mlopti-mem培养基，室温5min；2号管：2ul1ug质粒(质粒是含有绿色荧光蛋白(gfp)的载体pcdna3.1(+)，便于通过荧光表达情况观察细胞的转染效率，pcdna3.1(+)从addgene公司购买)+0.25mlopti-mem培养基；1号管缓慢(每分钟1ml)加入2号管中，再颠倒混匀5秒。静置20min，加入长至80％汇合度的细胞中。12-16h换含有10％血清dmem培养基。1300rpm离心5min，0.45μm滤膜过滤。

实施例3转染效果检测

阳离子聚合物转染效率及毒性检测；用不同细胞检测pei转染效率及毒性。

氨基酸类阳离子脂质体结构中带正电荷的氨基基团可以与质粒上带负电荷的磷酸基团通过静电吸附作用完全压缩,形成稳定的阳离子脂质体复合物,被阳离子脂质体压缩成分散的颗粒。此时的一级结构未发生改变,还可以避免被体内酶和盐等降解。按一定的比例将氨基酸类阳离子脂质体与pei或病毒包膜重组多肽制备成复合物悬液后,观察发现脂质体不论以任何比例结合都会发生絮凝现象,多肽不仅对质粒dna有保护和促渗作用,同时,它也可以降低阳离子脂质体的毒性。富含亲水性氨基酸的多肽头部(mtrrrvlsvvvllaalacrlgaqt，其中下划线处为亲水性氨基酸),在较低浓度的水溶液中,可以在脂质体表面形成亲水屏障,从而增加脂质体在转染试剂体系下的稳定性，改良脂质体的性状。

从图1(图9-1)和图2(图9-2)可以看出，pei、脂质体转染的细胞内的gfp基因表达情况很少。

经过dna质粒转染的细胞，质粒dna的转染方法同实施例2，转染试剂为表1中组合物1-4，并观察各组合物转染结果，见图3-图6(图9-3至9-6)。

表1各转染试剂组成及终浓度

对hela细胞作用后gfp基因的表达情况，转染后3d的实现结果如图3-图6(图9-3至9-6)所示。从图3-图6(图9-3至9-6)可以看出，与pei、脂质体复合物分别转染的细胞相比，阳离子和脂质体复合物(组合物4、图3)、阳离子与多肽联用(组合物3、图4)、脂质体和多肽联用(组合物2、图5)、本发明的阳离子、多肽和脂质体联用(组合物1、图6)、lipofectamine2000(图7、图9-7)，这几种联用的复合瞬转试剂可以高效递送质粒dna进入目的细胞并抑制目的基因的表达，细胞内的gfp基因表达情况明显增强，其中本发明的阳离子、多肽和脂质体联用(图6、图9-6)效果最强，而且优于市售的lipofectamine2000(图7、图9-7)，即通过pei、gb多肽和脂质体的联合作用，gfp基因在hela细胞中的转染效率明显提高，表明pei/多肽脂质体复合物递送的质粒dna系统可以稳定转染hela细胞。

实施例4细胞毒性实验

在2个96孔板中分别接种4000个/100μl细胞悬液。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％co2)，用表1的组合物分别转染，并再转染48h和72h后，用cck8法测定细胞存活率，向每孔加入20μlcck溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果如图8(8(a)、8(b))所示。

cck8染色法测细胞数量和活率

实验证明，这种载体基本无细胞毒性，可生物降解，有较高的基因转染效率：在以子宫颈癌细胞hela为靶细胞，gfp为目标基因进行转染实验时，优于市售的阳离子脂质体lipofectamine2000的转染效率，在转染效率最高的浓度下，lipofectamine2000转染效率为60.5％，而本发明所述转染效率为82.6％；在转染效率最高的浓度下，pei，脂质体转染48h后细胞存活率为分别为71.59％、78.47％，细胞毒性较强，市售lipofectamine3000存活率较高，为90.13％，而本发明所述的阳离子聚合物基因转染试剂转染的细胞的存活率为93.66％，毒性最低。

目前非病毒载体溶酶体逃逸策略主要为质子海绵效应、膜融合效应、膜穿孔或膜干扰效应。本发明中转染复合物具有两种溶酶体逃逸效应：阳离子聚合物的质子海绵效应和病毒包膜糖蛋白的膜穿孔或膜干扰效应。这两种效应联合使用能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率。本发明采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解、不易在体内蓄积，具有较高的使用安全性。

以上实验以及实验结果表明，gb多肽、阳离子聚合物与核酸形成的新型转基因复合物不仅可以高效递送dna，而且细胞毒性小。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州辉园苑医药科技有限公司

<120>一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用

<130>hpcnp201810060

<141>2018-08-06

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<213>人工序列(artificialsequence)

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