一种双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置及培养方法与流程

本发明涉及一种好氧甲烷氧化菌高效培养装置及培养方法，具体涉及一种双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置及培养方法，属于环境生物技术领域，具体适用于以甲烷和氧气为基质生长的好氧甲烷氧化菌的高效培养。

背景技术

温室气体的持续排放导致全球气候变暖，引起冰川融化、海平面上升和极端天气频发等一系列环境问题，对人类和生态系统造成严重、普遍和不可逆转的影响。甲烷是地球大气中仅次于二氧化碳的第二大温室气体，虽然当前甲烷在大气中的浓度远不及二氧化碳，但其温室效应却是co2的28倍，对大气辐射强度贡献超过18％，对气候变化的影响比二氧化碳更为显著。

甲烷氧化菌是一种以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的特殊微生物，广泛存在于土壤、稻田、森林、沼泽、河流、湖泊和海洋等自然环境中，可以有效降解大气中的甲烷，减少温室气体甲烷排放，在全球气候变化和整个生态系统碳循环过程中起着重要的作用。此外，甲烷氧化菌在生产单细胞蛋白和新功能酶等生物工程领域、在水陆生态环境中碳、氧、氮循环应用等方面具有重大的开发潜力。

传统的甲烷氧化菌富集培养方法大多采用纯培养或混合培养发酵的方式，但是与基于糖类等易溶性有机质培养菌体的传统工艺相比，甲烷氧化菌的生长、生物合成及污染物降解依赖于甲烷和氧气等气相底物，而甲烷和氧气在水溶液中的溶解度很低(常温常压下分别为22mg/l和9mg/l)，气液传质速率低，不能为甲烷氧化菌提供充足的碳源和能源物质导致细胞生长缓慢、细胞密度低、生物合成速率慢，极大限制甲烷氧化菌的大规模应用。此外，甲烷与空气或氧气的混合物浓度超过一定比例会有爆炸的风险，威胁安全生产。一些研究通过提高反应体系中的气液比例，增加气速，提高搅拌速率或添加硅油、石蜡油等有机相作为甲烷的载体提高转化效率，还有通过设计改变反应装置构型以期增强甲烷和氧气的传质。但是上述强化措施基建投资大、工艺复杂、动力消耗高，导致运行成本增加和资源浪费，额外添加有机相还会使杂菌生长，也并未从根本上解决威胁生产安全的问题。

因此，提高氧气与甲烷在水中的传质速率，避免甲烷和氧气或空气的直接接触，开发实现安全高效的供气技术是实现甲烷氧化菌广泛应用的关键。

技术实现要素：

本发明基于甲烷和氧气在水中溶解度相对较低，不能向反应装置中微生物提供充足的碳源和能源，且甲烷在空气或氧气中混合后超过一定比例会有爆炸的危险的问题，提出一种新型好氧甲烷氧化菌培养装置及培养方法。

为达此目的，本发明提出一种双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置台包括反应装置腔体、温控系统、搅拌系统、氧气曝气膜组件、甲烷曝气膜组件、高压氧气气体储存罐、氧气供气管路、高压甲烷气体存储罐、甲烷供气管路、进水装置、出水装置、出气液封装置、ph传感器、溶解氧感应探头和溶解氧控制装置；

所述反应装置腔体的外壁内夹有温控系统，用于控制反应装置腔体内的温度，所述反应装置腔体的底部下方安装有搅拌装置，所述反应装置腔体的侧壁安装有ph传感器，所述ph传感器的一端伸入反应装置腔体内部，用于监测反应装置腔体内部的ph值；所述反应装置腔体的内部上方安装有氧气曝气膜组件，所述氧气曝气膜组件通过氧气供气管路与安装在反应装置腔体外部的高压氧气气体储存罐连接，所述反应装置腔体的内部上方还安装有甲烷曝气膜组件，所述甲烷曝气膜组件通过甲烷供气管路与安装在反应装置腔体外部的高压甲烷气体存储罐连接；所述反应装置腔体的内部的顶部还安装有溶解氧感应探头，用于检测反应装置腔体内部的溶解氧量，所述溶解氧感应探头与安装在反应装置腔体外部的溶解氧控制装置连接；

所述反应装置腔体的顶部安装有出气液封装置，所述反应装置腔体一侧的中部安装有出水装置，所述反应装置腔体另一侧的下部安装有进水装置。

优选地，所述甲烷曝气膜组件和氧气曝气膜组件的材质均为中空纤维膜。

优选地，所述进水装置包括进水泵、进水管和进水容器，所述进水管的出水端伸入反应装置腔体的下部，所述进水容器安装在反应装置腔体的外部，所述进水管的进水端插入进水容器内的液面下，所述进水管上安装有进水泵。

优选地，所述出水装置包括出水管、出水泵和出水容器，所述出水管的进水端伸入反应装置腔体的中部，所述出水容器安装在反应装置腔体的外部，所述出水管的出水端插入出水容器内的液面下，所述出水管上安装有出水泵。

优选地，所述出气液封装置包括出气孔、出气液封容器和出气管路，所述反应装置腔体的顶部设置有出气孔，所述出气液封装置安装在反应装置腔体的外部且装有液体，所述出气管路的一端从出气孔伸入反应装置腔体内部，所述出气管路的另一端插入出气液封装置的液面下。

本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置的工作原理为：

本发明装置采用中空纤维膜无泡供气的方式，气体直接以分子状态扩散进入液相，不产生气泡，传质效率几乎可高达100％，安全高效地同时将氧气与甲烷溶解至反应装置液相中，提高氧气与甲烷的传质效率，通过调节供气压力，突破气液传质阻力，实现甲烷和氧气高效气液传质，氧气和甲烷在水中的溶解不再是限制甲烷氧化菌生长的决定因素。

一种利用所述双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置富集好氧甲烷氧化菌的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一：将富含甲烷氧化菌的土壤混悬液或污泥接种物过滤掉固体杂质后稀释，稀释后投至反应装置腔体内；

步骤二：将配置好的好氧甲烷氧化菌生长繁殖所需的培养基置于进水容器内输送至反应装置腔体内，并通过搅拌装置将培养基与步骤一内的富含甲烷氧化菌的土壤悬液或污泥接种物均匀混合；

步骤三：搅拌装置持续搅拌，打开温控装置，同时通过甲烷曝气膜组件和氧气曝气膜组件向反应装置腔体内无泡供给甲烷和氧气，为好氧甲烷氧化菌的高效富集提供充足的底物；

步骤四：经过富集培养后关闭搅拌装置，沉淀后从出水管排出部分上清液至出水容器；

步骤五：排水过程后打开进水泵向反应装置腔体内输送新鲜的培养基；

步骤六：重复步骤一至步骤五，直到获得所需的培养物。

优选地，所述甲烷曝气膜组件的膜腔内部的甲烷气体相对压强和氧气曝气膜组件的膜腔内部的氧气气体相对压强均为0.02mpa～0.15mpa。

优选地，所述好氧甲烷氧化菌高效富集反应温度为30±1℃，所述好氧甲烷氧化菌高效富集反应体系ph值为6.5～7.0。

优选地，所述富集培养的时间为20～50h，所述沉淀的时间为1～60min。

优选地，所述培养基为液体矿物质培养基，其中添加维生素和微量元素，不添加任何其他有机碳源。

本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置及培养方法的有益效果为：

1)、本发明提供了一种双膜曝气反应培养装置高效富集好氧甲烷氧化菌的方法，该方法通过建立双膜曝气系统，分别提供氧气和甲烷，实现两种气体在液相中的快速溶解，突破气液传质阻力而提高两种气体液相的传质效率，为培养装置中好氧甲烷氧化菌的生长繁殖提供充足的底物。

2)、本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置采用无泡供气的方式，反应装置内不存在气相混合物，有效避免氧气和甲烷两种气体的直接接触，实现反应装置的安全运行。

3)、本发明不仅适用于甲烷氧化菌的高效富集培养，也适用于甲烷温室气体减排、甲烷氧化菌中间产物如甲醇的生产和甲烷氧化菌污染物的降解等。

4)、本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置实现装置安全高效运行的同时，有效地降低工艺的运行成本，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置的结构示意图；

图2为本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置富集好氧甲烷氧化菌的生物量变化图；

图中：1-反应装置腔体；2-温控系统；3-搅拌系统；4-氧气曝气膜组件；5-甲烷曝气膜组件；6-出气孔；7-出气液封容器；8-出气管；9-高压氧气气体储存罐；10-氧气气体减压阀；11-氧气供气管路；12-高压甲烷气体存储罐；13-甲烷气体减压阀；14-甲烷供气管路；15-进水泵；16-进水管；17-进水容器；18-出水管；19-出水泵；20-出水容器；21-ph传感器；22-溶解氧感应探头；23-溶解氧控制装置。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明：

具体实施方式一：参见图1-图2说明本实施方式。本实施方式所述的一种双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置包括反应装置腔体1、温控系统2、搅拌系统3、氧气曝气膜组件4、甲烷曝气膜组件5、高压氧气气体储存罐9、氧气供气管路11、高压甲烷气体存储罐12、甲烷供气管路14、进水装置、出水装置、出气液封装置、ph传感器21、溶解氧感应探头22和溶解氧控制装置23；

所述反应装置腔体1的外壁内夹有温控系统2，用于控制反应装置腔体1内的温度，所述反应装置腔体1的底部下方安装有搅拌装置3，所述反应装置腔体1的侧壁安装有ph传感器21，所述ph传感器21的一端伸入反应装置腔体1内部，用于监测反应装置腔体1内部的ph值；所述反应装置腔体1的内部上方安装有氧气曝气膜组件4，所述氧气曝气膜组件4通过氧气供气管路11与安装在反应装置腔体1外部的高压氧气气体储存罐9连接，所述反应装置腔体1的内部上方还安装有甲烷曝气膜组件5，所述甲烷曝气膜组件5通过甲烷供气管路14与安装在反应装置腔体1外部的高压甲烷气体存储罐12连接；所述反应装置腔体1的内部的顶部还安装有溶解氧感应探头22，用于检测反应装置腔体1内部的溶解氧量，所述溶解氧感应探头22与安装在反应装置腔体1外部的溶解氧控制装置23连接；

所述反应装置腔体1的顶部安装有出气液封装置，所述反应装置腔体1一侧的中部安装有出水装置，所述反应装置腔体1另一侧的下部安装有进水装置。

所述甲烷曝气膜组件4和氧气曝气膜组件5的材质均为中空纤维膜。所述甲烷曝气膜组件4和氧气曝气膜组件5用于向反应装置腔体1内无泡供给甲烷和氧气。

所述进水装置包括进水泵15、进水管16和进水容器17，所述进水管16的出水端伸入反应装置腔体1的下部，所述进水容器17安装在反应装置腔体1的外部，所述进水管16的进水端插入进水容器17内的液面下，所述进水管16上安装有进水泵15。

所述出水装置包括出水管18、出水泵19和出水容器20，所述出水管18的进水端伸入反应装置腔体1的中部，所述出水容器20安装在反应装置腔体1的外部，所述出水管18的出水端插入出水容器20内的液面下，所述出水管18上安装有出水泵19。

所述出气液封装置包括出气孔6、出气液封容器7和出气管路8，所述反应装置腔体1的顶部设置有出气孔6，所述出气液封装置7安装在反应装置腔体1的外部且装有液体，所述出气管路8的一端从出气孔6伸入反应装置腔体1内部，所述出气管路8的另一端插入出气液封装置7的液面下。

所述氧气供气管路11上安装有氧气气体减压阀10；所述甲烷供气管路14上安装有甲烷气体减压阀13。所述氧气气体减压阀10和甲烷气体减压阀13用于控制氧气和甲烷的供气稳定性。

所述搅拌装置3为磁力搅拌器，所述搅拌装置3的转速为300～350rpm。

一种利用所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置富集好氧甲烷氧化菌的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一：将富含甲烷氧化菌的土壤混悬液或污泥接种物过滤掉固体杂质后稀释，稀释后投至反应装置腔体1内；

步骤二：将配置好的好氧甲烷氧化菌生长繁殖所需的培养基置于进水容器17内输送至反应装置腔体1内，并通过搅拌装置3将培养基与步骤一内的富含甲烷氧化菌的土壤悬液或污泥接种物均匀混合；

步骤三：搅拌装置3持续搅拌，打开温控装置2，同时通过甲烷曝气膜组件4和氧气曝气膜组件5向反应装置腔体1内无泡供给甲烷和氧气，为好氧甲烷氧化菌的高效富集提供充足的底物；

步骤四：经过富集培养后关闭搅拌装置3，沉淀后从出水管18排出部分上清液至出水容器20；

步骤五：排水过程后打开进水泵15向反应装置腔体1内输送新鲜的培养基；

步骤六：重复步骤一至步骤五，直到获得所需的培养物。

所述甲烷曝气膜组件4的膜腔内部的甲烷气体相对压强和氧气曝气膜组件5的膜腔内部的氧气气体相对压强均为0.02mpa～0.15mpa。

所述好氧甲烷氧化菌高效富集反应温度为30±1℃，所述好氧甲烷氧化菌高效富集反应体系ph值为6.5～7.0。

所述富集培养的时间为20～50h，所述沉淀的时间为1～60min

本实施方式中的培养物通过反应装置的温控系统于30±1℃进行富集培养，磁力搅拌器转速控制在300～350rpm，ph值控制在6.5～7.0之间，反应期内总有效工作体积为2l。

所述培养基为液体矿物质培养基，添加维生素和微量元素，不添加任何其他有机碳源。

所述培养基配方为：每升培养基中含有0.8mm(毫摩)mgso4·7h2o、10mmnano3、0.14mmcacl2、1.2mmnahco3、2.35mmkh2po4、3.4mmk2hpo4、20.7μm(微摩)na2moo4·2h2o、1μmcuso4·5h2o、10μmfe-edta、1mltracemetalsolution(包含每升500mgfeso4·7h2o、400mgznso4·7h2o、20mgmncl2·7h2o、50mgcocl2·6h2o，10mgnicl2·6h2o、15mgh3bo3和250mgedta)和10mlvitaminsolution(包括每升2.0mg维生素h、2.0mg叶酸、5.0mg维生素b1、5.0mg泛酸钙、0.1mg维生素b12、5.0mg维生素b2和5.0mg烟酰胺)。

本实施方式中反应装置腔体1内的接种物中甲烷氧化菌能够够以甲烷为唯一碳源和能源物质，通过一段时间同时提供甲烷和氧气的富集培养过程可以得到能以甲烷和氧气作为底物生长繁殖的好氧甲烷氧化菌。

所述双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置培养运行方式采用序批式运行，可分为4个阶段：进水期—富集期—沉淀期—排水期，每个运行阶段总时长为4个阶段时长的总和，甲烷和氧气无泡供气贯穿整个运行过程，为好氧甲烷氧化菌提供充足的底物，使好氧甲烷氧化菌高效生长繁殖。

本发明所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置的具体操作过程为：

启动反应装置，将混合好的接种物置于反应装置腔体1内，打开进水泵15将进水容器17中配置好的培养基溶液通过进水管16加入反应装置腔体1内，温控系统2和搅拌系统3开启，进水一定时间后反应装置腔体1内培养物与培养基溶液充分混合；打开氧气气体减压阀10和甲烷曝气膜组件5，高压氧气气体储存罐9中的高压氧气减压后通过氧气供气管路11传输至氧气曝气膜组件4，打开氧气气体减压阀10，高压氧气气体储存罐9中的高压氧气气体减压后通过氧气供气管路11传输至氧气曝气膜组件4；打开甲烷气体减压阀13，高压甲烷气体储存罐12中的高压甲烷气体减压后通过甲烷供气管路14传输至曝气膜组件5，分别向反应装置腔体1内无泡供气氧气和甲烷，为反应装置腔体1内的培养物提供充足的底物；持续无泡供气，温控系统2和搅拌系统3持续工作一定时间；然后进入沉淀期，关闭搅拌系统3，经过一定时间的沉淀过程后，排水一段时间，打开出水泵19，上清液由出水管18排至出水容器20，关闭出水泵19，一个完整的运行阶段完成。

一个完整的运行阶段结束后立即打开进水泵15向反应装置腔体1内部注入新鲜培养基开始下一阶段的培养。

为了更好的说明利用所述的双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置富集好氧甲烷氧化菌的方法取得的有益效果，进行实验如下：

将双膜曝气好氧甲烷氧化菌培养装置按照序批式运行。一个完整的序批阶段分为进水期15min—富集期23h—沉淀期30min—排水期15min，整个运行模式阶段总时长24h，甲烷和氧气无泡供气贯穿整个运行过程，为好氧甲烷氧化菌提供充足的底物，使好氧甲烷氧化菌高效生长繁殖。序批式培养50d，每24h取10ml培养物测定混合液悬浮固体浓度(mixedliquidsuspendedsolids，mlss)，实验结果如图2所示，所接种的泥水混合物初始混合液悬浮固体浓度为25g/l，经过10d左右的培养，由于自身消化等因素，混合液悬浮固体浓度下降至6.5g/l左右，此后混合液悬浮固体浓度逐渐上升，至20d左右基本达到稳定状态，约15-20g/l。在第20d和50d分别取培养物样品进行菌种测序以示富集前后菌种变化。结果显示，在20d富集前的细菌主要为疣微菌门(verrucomicrobia)、变形菌门(proteobacteria)、酸杆菌门(acidobacteria)、装甲菌门(armatimonadetes)、厚壁菌门(firmicutes)，经过富集过程好氧甲烷氧化菌大量生长，不能以甲烷为碳源和能源的菌群逐渐死亡，50d时富集出较多的甲基球菌目(methylococcales)中甲基球菌科(methylococcaceae)、根瘤菌目(rizobiales)中甲基孢囊菌科(methylocystaceae)和甲基杆菌科(methylobacteriaceae)、嗜甲基菌目(methylophilales)中嗜甲基菌科(methylophilaceae)等科的好氧甲烷氧化菌，富集效果明显良好。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明。所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，还可以是上述各个实施方式记载的特征的合理组合，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。