本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与鸡冠发育性状相关的snp分子标记及其检测方法。
背景技术
对于优质鸡来说，要求上市的肉鸡具有冠大、脸红等性成熟的外观，因为只有接近性成熟时其脂肪沉积较多，肉质最鲜美，风味最浓郁。而鸡冠的发育是鸡第二性征中最明显、最重要的特征，可作为衡量性成熟程度的指标，也是屠宰上市后区分优质鸡和快大鸡的重要指标。同时早熟性与鸡肉品质之间也有较大的相关，鸡冠的发育程度通常是优质鸡销售的等级和价格的重要影响因素之一，因此，鸡冠将是优质鸡育种工作者重点关注和加强选择的性状。目前，对于鸡冠的选种尚停留在常规选育水平，即待鸡冠发育到一定程度后，根据鸡冠的大小，淘汰小鸡冠个体，这种选种方式无形中增加了饲养成本，从而影响了经济效益。
应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质的重要途径。随着高通量基因型测定平台的发展，通过分子标记手段从遗传上对鸡冠发育进行早期选择成为可能。应用分子标记育种首先是在dna水平上筛查和检测与鸡冠发育密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法，然后实现鸡冠发育性状的早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，更好地服务于优质鸡的育种。因此，研究新的与鸡冠发育性状相关的分子标记具有重要意义。
软骨样基因(chondroadherin-like，chadl)为发明人前期利用rna-seq技术对鸡冠发育差异显著的群体中筛选出的显著差异表达基因，该基因的表达在大鸡冠群体中极显著上调。chadl基因定位于鸡1号染色体上与鸡冠发育相关的qtl区域内。在哺乳动物中，tillgren等(2015)研究发现chadl基因在软骨代谢中具有重要作用。研究发现，鸡冠发育与软骨沉积具有显著的正相关关系(wrightetal.,2008；johnssonetal.,2014)，由此可见，chadl基因可能在鸡冠发育中发挥着重要作用。目前，尚无chadl基因遗传变异与鸡冠发育性状的相关报道。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种与鸡冠发育性状相关的分子标记及其检测方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种与鸡冠发育性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seqidno:1所示，且seqidno:1的第302位为g或a。
本发明还提供了检测所述的snp分子标记的引物组，所述引物组包括seqidno:2所示的上游引物、seqidno:3所示的下游引物和seqidno:4所示的单碱基延伸引物。
本发明还提供了包含所述的引物组的检测试剂盒。
本发明还提供了检测所述的snp分子标记的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组dna，加入上、下游引物进行pcr扩增，得pcr扩增产物；
(2)pcr扩增产物经测序后，获得所述snp分子标记的基因型。
需要进一步说明的，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno:3所示。
进一步的，步骤(3)中，检测得到所述snp分子标记的基因型为g或a。
本发明又提供了所述的引物组或所述的检测试剂盒在鸡遗传育种中的应用。
本发明又提供了所述的引物组或所述的检测试剂盒在早期选择鸡冠发育性状中的应用。
本发明的有益效果：本发明的snp分子标记与鸡冠发育性状相关，是一个新的分子标记，通过检测待测鸡snp位点的基因型，对鸡冠发育性状进行早期选择，可以节省生产成本并加快遗传进展，更好地服务于优质鸡的育种，具有很大的经济价值和科研价值。
附图说明
图1为包含snp位点pcr产物的测序基因分型图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。
本发明与鸡冠小大性状相关的snp分子标记的核苷酸序列如seqidno:1所示，该位点的第302位为g或a。所述snp分子标记位于chadl基因编码区(ncbi转录本登录号：nm_001252276.2)，为第二外显子的619位碱基处的g/a突变。
本发明还公开了所述snp分子标记的引物组，包括：
500nmol/l上游引物：
fprimer:5’-cgccttggtctatcttccag-3’(seqidno:2)
500nmol/l下游引物：
rprimer:5’-atccaggctgatcctcacc-3’(seqidno:3)；
本发明还公开了包括上述引物组的检测试剂盒，所述检测试剂盒中除包含如上引物外，还包括：pcrbufferwith15mmmgcl2，mg2+，dntpmix，hotstartaq，dddh2o、dnamarker。
实施例
检测所述snp分子标记的方法包括以下步骤：
(1)试验材料
待测群体来自于江苏立华牧业股份有限公司，用于加工型优质肉鸡新品种(配套系)选育的终端父本a系公鸡。该品系具有青脚、黄麻羽、鸡冠发育较好等特征。各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。饲喂至20周龄达到性成熟，采血取样，测定每只鸡的鸡冠面积和高度并记录数据。
(2)基因组dna的提取
鸡个体称重后，采用一次性注射器鸭翅下静脉中抽取约1ml血液，注入经高压灭菌并装有约200μl2％无菌edta(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。同时对每个个体鸡冠进行拍照，采用“鸡冠发育参数自动测定软件[简称：鸡冠测定软件]v1.0”(软件著作权：登记号：2015sr071422)测定鸡冠面积和高度。参照血液/细胞/组织dna提取试剂盒(天根，dp304)的说明书进行血液dna样品的采集。
(3)目标片段的获得及测序分型
根据鸡chadl基因组序列，设计包含待测位点序列的上下游引物，如seqidno:2和seqidno:3所示。利用pcr技术，扩增被测鸡群的dna，获得的pcr扩增产物委托上海生工公司测序。
(4)pcr反应体系及反应程序设置：pcr反应体系为：50ng/μldna模板1μl、2mmdntp2μl、3mmmg2+0.6μl、10×pcr反应缓冲液2μl、10μm上下游引物各0.4μl、1u/μltaq聚合酶0.2μl，加ddh2o至总体积20μl。
pcr扩增反应程序如下：预变性94℃5min；95℃变性2min，40次循环(94℃90s，50℃1min30s，65℃30s)，65℃延伸10min，4℃保温。
(4)基因型判定
根据测序的结果判定该位点在检测群体中的基因型。结果如图1所示，如果该样本是纯合子，就只有一个产物峰：g峰或a峰。如果是杂合，那么就会出现2个峰：g峰和a峰。
对试验群体中鸡chadl基因第二外显子619位点snp突变等位基因频率和基因型频率统计分析结果见下表1。
表1snp位点在试验群体中的基因频率和基因型频率
所述snp位点突变在试验群体中处于哈代-温伯格平衡状态(χ2＝0.75，p>0.05)，属于中度多态位点(pic＝0.37，0.25<pic<0.5)，杂合度he(0.50)，有效等位基因数ne(1.99)，因此与试验群体的鸡冠性状进行关联分析。
(5)鸡chadl基因编码区的snp位点的多态性与鸡冠发育性状的关联分析
采用sas统计分析软件包的glm过程进行统计分析，根据广义线性模型对供试鸡群的基因型和20周龄鸡冠发育性状(高度和面积)进行方差统计分析，p-value<0.05表示差异显著。
统计分析模型：
y＝μ+g+e
y代表个体表型值；
μ代表群体均值；
g代表基因型效应；
e代表剩余残差效应。
结果见表2。
表2不同基因型个体20周龄的冠面积和冠高
注：在同一列中小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。
由表2可以看出，三种基因型公鸡20周龄的冠面积和冠高有显著差异。aa基因型个体的冠面积高于ga基因型个体，aa和ga基因型个体的冠高显著高于gg基因型个体。aa基因型个体的冠高高于ga基因型个体，aa基因型个体的冠高显著高于gg基因型个体，ga基因型个体的冠高也高于gg基因型个体。因此，选取鸡chadl基因编码区的snp分子标记第619位中的aa基因型作为鸡冠发育性状的辅助选择和分子遗传育种标记。
检测所述snp分子标记的引物组或检测试剂盒在鸡遗传育种或早期选择鸡冠发育性状的应用中，选择所述snp分子标记的基因型为aa的个体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>江苏省家禽科学研究所
<120>一种与鸡冠发育性状相关的snp分子标记及其检测方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>418
<212>dna
<213>鸡(gallus_gallus)
<400>1
cgccttggtctatcttccagacatggtctttcagggcctgcagagcctcaagtggctgag60
gctgtcccacaacgccctccatgtgctgggcaacgaggccttcacggccctgcctgccct120
gcgcaggctcagcctggaccacaacgagctgcaggcactgcccagcgaggctctggcaca180
gctgagcgaggtcacgcggctggagctgggccacaaccccatcacctacctggccgagga240
ggccgtggccatggcgtccctccagcacctctccttggagcacgcagccctgcaggatgt300
ggcacccgatgccttctcccgcagtcccctgctgaggacgctggatctggcacacaacca360
gctgcgggggctgcccgccttggtgggggtcggggggctggtgaggatcagcctggat418
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>2
cgccttggtctatcttccag20
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>3
atccaggctgatcctcacc19