一种通过量纲规划模型预测食品微生物的方法与流程

本发明涉及微生物的预测方法，也涉及数据处理的方法，具体而言，涉及通过量纲规划模型预测食品微生物和食品保藏期的方法。

背景技术

食品微生物生长的预测模型学(predictfoodmicroorganismgrowthmodel)是一门在微生物生长学、数学模型以及统计学的基础上建立起来的新兴学科。可根据微生物生长预测模型有效判断出食品内一些特定腐败微生物生长及残存的动态变化，为食品货架期寿命以及食品安全性的快速评估和预测有力的依据。预测微生物生长模型是管理和保障食品安全的重要工具，为食品行业发展的体系提供了合理科学依据。

目前预测微生物的方法主要有一级模型、二级模型和三级模型，一级模型、二级模型只考虑了2-3个因素的影响，由于影响微生物生长的因素比较复杂，所以一、二级模型误差较大。而三级模型是专家系统，它要求所使用者具备一定专业知识，了解系统的使用范围和适用条件，掌握它有一定困难。所以有必要开发新的方法应用于食品微生物预测。在物理和化工原理、食品工程原理等学科中有一种广泛方法--量纲规划法，它可以描述复杂物理现象之间的关系，特别是能做到由小极大，由此及彼，这方面一个经典的例子就是化工原理或食品工程原理中摩擦系数与雷诺数和相对粗糙度之间关系的发现就是利用量纲规划发现的。不过由于微生物是活的，影响其生长的因素很多，还没有具体的量纲规划试验案例来预测微生物生长的。

中国专利数据库中有不少涉及预测微生物的专利申请件，但涉及预测食品微生物生长的不多。例如2009102174276号《预测乳中金黄色葡萄球菌生长和产毒的方法》，利用预测微生物学原理预测金黄色葡萄球菌生长；又如2013800105543号《预测微生物数的增殖的方法》，用概率密度函数建立预测模型；再如2014105217749号《一种冷链物流的冷却肉货架期预测方法及系统》，通过冷却肉货架期预测模型预测冷却肉货架期；又再如2016102892182号《一种生产流通过程中食品所含微生物的生长预测方法》，建立输入、输出变量的模糊关系矩阵得到微生物数量的预测值。迄今为止，尚无通过量纲规划模型预测食品微生物的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种通过量纲规划模型预测食品微生物的方法，利用量纲规划模型预测微生物，并应用于食品保藏期的预测。

发明人在对量纲规划模型不断探索中，结合试验改进，最终找到一个好的量纲规划模型用以预测微生物。由于牛干巴具有营养价值且深受消费者欢迎，发明人一直在对其进行开发研究。所以本发明就以牛干巴为例来说明量纲规划法在预测微生物应用中的原理和具体应用方法。

本发明是通过以下技术方案所获得的：

(1)检测目标的制备：以牛干巴为例

牛干巴发酵剂：以类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)、木糖葡萄球菌和生香酵母为发酵剂；牛干巴辅料配方：葡萄糖添加量1.5％，食盐添加量1.5％，苏麻添加量为2％，茶多酚添加量0.06％,生姜7％、红辣椒0.6％、蒜5％、味精0.075％、白酒、花椒0.6％；牛干巴发酵：4℃低温密闭发酵20天；

(2)通过对食品假单胞菌腐败限量的确定、假单胞菌的腐败限控量的确定制定量纲规划，再通过量纲规划获得微生物生长的量纲规划模型：

其中θ是温度，cp为比热容，t是时间，nt/lt²是时间t时单位质量单位表面积的食品中腐败菌量(nt是t时间时单位质量食品中腐败微生物量cfu/g,由于微生物数量可表示成质量lt是t时间的食品表面积)、pht为t时间的ph、awt为t时刻的水分活度aw，k、n1、n2、n3为待定常数；

(3)通过微生物生长量纲规划模型在其保藏期预测其中的微生物生长情况，从而预测食品保藏期。

上述方法的第(1)步中，所述类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)gufhsl-70(sq-4)已于2016年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccm2016002；所述木糖葡萄球菌，保藏编号：atcc29971；所述生香酵母来自宜昌市安琪酵母股份有限公司。

本发明的有益效果为：

本发明利用量纲规划模型预测微生物生长情况，进而应用于食品保藏期的预测，这对于控制食品品质和保障食品安全都具有重要价值。本发明适用于各种具有保质期限的食品。

附图说明

图1为牛干巴保藏期间的有关指标的聚类分析图

具体实施方式

下列实施例用来进一步说明本发明，但是本发明的保护范围并不限于下列实施例的范围。

实施例1检测目标牛干巴制备

1制备材料与方法

1.1材料

新鲜牛肉，食盐，大蒜，生姜，鲜红辣椒，苏麻，茶多酚，葡萄糖，花椒粒，味精，白酒等辅料购买于当地超市。发酵剂：类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)gufhsl-70(sq-4)；木糖葡萄球菌和购自宜昌市安琪酵母股份有限公司的生香酵母。规格：类植物乳杆菌sq-4(1×10⁹cfu/g)、增香酵母菌(5×10⁹cfu/g)和木糖球菌(8×10⁸cfu/g)。假单胞菌琼脂培养基：蛋白胨16.0g、水解酪蛋白10.0g、无水硫酸钾10.0g、氯化镁1.4g、甘油10.0ml、假单胞菌培养基选择剂c-f-c(oxoid，英国)1支/200ml、琼脂20g、蒸馏水1000ml；培养基的ph值调节为7.0±0.2。

1.2牛干巴发酵

1.2.1辅料配方

以质量分数计，葡萄糖添加量1.5％，食盐添加量1.5％，苏麻添加量为2％，茶多酚添加量0.06％,生姜7％、红辣椒0.6％、蒜5％、味精0.075％、白酒、花椒0.6％；

1.2.2操作有点

(1)原料新鲜牛肉的选择、整理

挑选牛臀肉色深红、纤维较长、脂肪筋膜较少、光泽有弹性、气味正常、外表微干、不粘手呈“大理石花纹”且符合国家食品卫生标准的牛肉为原料，顺肌肉纹路将原料肉大块切下，剔除筋膜、脂肪，用洗净血水，切分为3cm×2cm×2cm大小的肉条，整齐、厚薄均匀；修整后存放4℃左右，存放时间不超过3h；

(2)接种拌料

先将洗切好的牛肉用白酒浸泡20min左右，接着接入2％sq-4乳酸菌(1×10⁹cfu/g)、2％增香酵母菌(5×10⁹cfu/g)和1％木糖球菌(8×10⁸cfu/g)作为发酵剂加到牛肉中混合，然后加入食盐、葡萄糖、茶多酚、生姜、红辣椒、蒜、味精等辅料进行二次混合，反复搓揉腌制料至肉块表面湿润变软，重复2-4次；

(3)发酵

4℃低温密闭发酵20d。

(4)烘烤和包装

将发酵好的肉条取出放进烘箱供干至水分质量分数为30％时结束烘烤，然后将其冷却包装。

实施例2假单胞菌腐败限量的确定

1样品处理与分析

1.1样品处理

将发酵好的牛干巴分别贮藏在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃和25℃培养箱中，温度波动±0.1℃；

1.2菌落总数、假单胞菌数的测定

在无菌操作环境下，每隔相应时间段取每组样品相应发酵牛干巴样25g置于锥形瓶中，加入225ml无菌生理盐水中并密封好，用摇床摇1h左右，然后按10倍稀释梯度，每个稀释度取100μl样液涂布于培养基表面，共取3个稀释度，每个稀释度做3个重复，进行假单胞菌数的测定，细菌总数的测定按照gb/t4789.2-2008进行；

1.3挥发性盐基氮(tvb-n)的测定

在规定的时间段，取发酵牛干巴样10g绞碎搅匀，置于锥形瓶中，加入100ml蒸馏水备用。按gb/t5009.228-2016微量扩散法测定挥发性盐基氮含量；

1.3色差的测定

每隔相应时间取相应发酵牛干巴用便携式色差仪测ciel值，每个样品至少测定三次，取平均值；

1.4感官评定

由50名评价员组成感官评价小组，以对肉的气味、色泽、粘度、组织状态、煮沸后肉汤及综合评价进行打分。采用一种相对简单的100分法，见表1：

表1感官评分标准

1.5ph值的测定

每隔相应时间取发酵牛干巴样10g绞碎搅匀，放于盛有100ml灭菌后蒸馏水的锥形瓶中，摇床振荡静置30min后过滤，测定滤液的ph值。

2假单胞菌与各品质指标的相关性分析

表24℃贮藏发酵牛干巴各品质指标

由于前30天测不出假单胞菌，所以对表2中35天后的各指标采用spss20.0统计软件进行皮尔逊相关系数分析可得到表3所示的结果，发酵牛干巴在4℃贮藏期间，假单胞菌数量与时间、单位面积的初始假单胞数、水分活度、挥发性盐基氮(tvb-n)、ph值、感官评价分值及色差l值的相关系数差异均极显著(p<0.01)，两两高度相关。贮藏时间在一定时间内可反映出牛干巴可食度，随着时间的延长，牛干巴与环境接触时间较长，假单胞菌污染牛干巴的几率会更大，对牛干巴货架期寿命有着重要的影响。随着贮藏时间的延长，牛干巴的水分活度和ph值会随之改变，从而影响牛干巴中假单胞菌的生长，不同程度的影响牛干巴的货架期。tvb-n是牛干巴中微生物生长引起的脱梭、脱氨作用导致蛋白质分解而形成的产物，是牛干巴腐败变质的重要指标，这是假单胞菌等微生物引起蛋白质水解，分解游离出一定量的盐基氮类物质，如伯胺、仲胺、叔胺等的结果。由于假单胞菌的生长与牛干巴在贮藏期间的单位质量单位表面积的假单胞数、aw、ph等环境条件极显著正相关，与腐败指标tvb-n正相关，与品质指标感官评分、色差等负相关。因此假单胞菌可作为发酵牛干巴的特征腐败菌，以其生长模型预测在有氧贮藏条件下，对牛干巴的腐败程度的预测具有可行性。

表3发酵牛干巴在4℃贮藏下各品质指标的皮尔逊相关系数

注：**.在0.01水平(双侧)上显著。

*.在0.05水平(双侧)上显著。

3假单胞菌的腐败限控量的确定

一般来说，为确定某一产品的货架期，确定特定的质量指标及其关键限值非常重要，即高于或是低于某一指标的某一水平就可判断产品不可被接受。上面的分析我们把假单胞菌确定为腐败指标，那么假单胞菌的腐败限控量则按以下方法确定：

如表2所示，假单胞菌数量在前30d并未检测出，在35～80d逐渐缓慢增加，80d之后增加较快；而菌落总数从0～80d也是呈缓慢增加，到85d达到6.41logcfu/g，相反感官评分呈缓慢下降趋势，在85天后低至62，达到了不可接受值，表明此时的牛干巴已经变质不可食用。而tvbn值在贮藏的前40d变化不大，基本在10mg/100g以内，但到了第45天变化很大升至11.24mg/100g，之后逐渐增加，在80d时达到20.14mg/100g。色差l值描述牛干巴的亮暗程度，贮藏初期肉的颜色虽呈缓慢下降的趋势，但变化不是很大，基本处于35左右，但在贮藏80d以后发酵牛干巴的颜色呈下降趋势，与80天显著差异((p＜0.01)。

聚类分析是研究“物以类聚”的一种科学有效的方法，由试验测试得到的数据是原始数据，原始数据是没有进行分类的、无规律的、错综复杂的变量，要使得这些数据能够反映出一定的规律性或特殊的分类性，需要对数据或变量进行聚类分析，以使数据或变量呈现一定的分门别类的特征。结合聚类分析的特征，将表2中35d后各指标数值通过originpro9.0软件进行聚类分析，结果见附图1。

由图1可知，发酵牛干巴贮藏前60d的被聚为一类，65～95d的聚为一类，结合感官评定值及tvbn值可以判断前80d的发酵牛干巴为可接受的，之后为不可食用的牛干巴。由可以知，假单胞菌与各指标相关性极显著(p＜0.01)，再结合图1发酵牛干巴的贮藏时间聚类分析，当贮藏在第85d时，可得出，假单胞菌数量对数值为2.69(4.9×10²cfu/g)作为发酵牛干巴的腐败控量。不过为安全起见，这里以假单胞菌数nt≤200cfu/g)作为发酵牛干巴的腐败控量。

实施例3量纲规划在预测食品微生物中的应用原理与应用

⑴原理

食品中营养丰富，适于微生物生长，在食品腐败前，食品的营养成分充足能满足微生物的生长。那么影响食品腐败菌生长量nt的因素主要有温度θ、比热容cp、时间t、单位质量单位表面积中腐败菌量nt/lt²(nt是t时刻单位质量食品中微生物量cfu/g,由于微生物数量也可表示成质量，所以nt本身无量纲；lt是t时刻的食品表面积)、t时刻的pht、t时刻的水分活度awt和食品贮藏t时刻的气体空间中氧气的百分含量o2t等。也即nt＝f(nt/lt²,θ,cp,t,pht，awt，o2t)。根据量纲规划，可建立一个准数he＝(nt/lt²)cpθt²。另外，pht，awt，o2t本身就是无量纲，也可把他们看成准数。所以根据π定理，可以写成下面的表达式：

式中，t为时间d，k、n1、n2、n3、n4为待定常数。牛干巴的比热容cp为1.1

kj/(kg·℃)，在贮藏期间基本不变。

考虑到牛干巴密封包装，基本认为少量氧气对假单胞菌生长的影响基本不变，因此为了简化后续运算过程，在后续牛干巴中腐败微生物的预测中暂不考虑氧气的影响，那么量纲规划所得的表达式变为

令y＝nt，a＝cpθt²(nt/l²)，b＝awt，c＝pht。将等式②两边取对数化成线性函数得：logy＝logk+n1loga+n2logb+n3logc③

⑵量纲规划在预测食品微生物中的应用方法

将制备好的包装的发酵牛干巴分别贮藏在4℃，10℃，15℃，20℃，25℃，每隔5天取样(取样后仍然密封包装)测定牛干巴中的假单胞总菌、水分活度、表面积、生长速率。

⑶分析检测

假单胞菌nt的检测由假单胞菌培养基平板计数法测定，cfu/g；lt²的测定：由纸巾刚好完全包裹，然后测纸巾的面积即为测出lt²的值，m²。ph测定：取发酵牛干巴样10g绞碎搅匀，放于盛有100ml灭菌后蒸馏水的锥形瓶中，摇床振荡静置30min后过滤，测定滤液的ph值。aw测定：由水分活度仪测定。

⑷量纲规划模型应用

4.14℃时量纲规划模型及验证

由于前30天没能测到假单胞菌，所以量纲规划模型从第35天开始。根据量纲模型的方程式③，对表2数据进行运算，结果见表4。

表4根据量纲模型的方程式③对表2的有关数据进行运算结果

通过spss软件分析线性回归方程运行结果：

logy＝2.239+0.512loga+91.002logb+5.460logc(r²＝0.995)

由于ph的回归系数不显著，所以回归方程变为

logy＝7.668+0.512loga+102.085logb(r²＝0.994)

模型为:

由式④可得

所以

模型验证，当nt＝32时，awt＝0.794，lt²＝0.0033，cp＝1.1，θ＝4℃时，tpre＝58.9天，而实测是50天。进一步根据这个预测其保质期：取nt≤200，此时假设aw＝0.798，而l²＝0.0033，cp＝1.1保持不变，那么预测的保质期t值＝86d，而实测值82d之间。

4.210℃时量纲规划模型及验证

由于前20天没能测到假单胞菌，所以量纲规划模型从第25天开始(表5)。根据量纲模型的方程式③，对表5数据进行运算，结果见表6。

表5贮藏在θ＝10℃状态下的牛干巴品质指标

表6根据量纲模型的方程式③对表5的有关数据进行运算结果

利用spss对表6中数据进行回归计算得：

因此y＝-3.122+0.567a(r²＝0.99)

模型为:

或

所以

模型验证：当nt＝25时，l²＝0.0037，cp＝1.1，θ＝10℃时，tpre＝35天，而实测是35天。进一步根据这个预测其保质期：取nt≤200，而l²＝0.0037，cp＝1.1保持不变，那么预测的保质期t值＝78.5d，而实测值约80d。

4.320℃时量纲规划模型及验证

由于前15天没能测到假单胞菌，所以量纲规划模型从第20天开始(表7)。根据量纲模型的方程式③，对表7数据进行运算，结果见表8。

表7贮藏在θ＝20℃状态下的牛干巴品质指标

表8根据量纲模型的方程式③对表7的有关数据进行运算结果

利用spss对表8中数据进行回归计算得：

y＝-4.434+0.738a(r²＝0.989)

模型为:

或

所以

模型验证：当nt＝41时，l²＝0.0057，cp＝1.1，θ＝20℃时，tpre＝31.5天，而实测是25天。进一步根据这个预测其保质期：取nt≤200，而l²＝0.0057，cp＝1.1保持不变，那么预测的保质期t值＝41.7d，而实测值约39d。

4.425℃时量纲规划模型及验证

由于前10天没能测到假单胞菌，所以量纲规划模型从第15天开始(表9)。根据量纲模型的方程式③，对表9数据进行运算，结果见表10。

表9贮藏在θ＝25℃状态下的牛干巴品质指标

表10根据量纲模型的方程式③对表9的有关数据进行运算结果

利用spss对表10中数据进行回归计算得：

因此y＝-4.556+0.772a(r²＝0.996)

模型为:

或

所以

模型验证：当nt＝32时，l²＝0.0048，cp＝1.1，θ＝25℃时，tpre＝19.6天，而实测是15天。进一步根据这个预测其保质期：取nt≤200，而l²＝0.0048，cp＝1.1保持不变，那么预测的保质期t值＝25.6d，而实测值23d。

4.5预测的货架期与实际牛干巴的货架期比较

由上述基于4℃、10℃、20℃、25℃牛干巴贮藏期间的品质指标所建立的微生物生长的量纲规划模型可知：所建立量纲规划模型的r²都是大于0.985，这说明模型的高度合适性，另外4℃、10℃、20℃、25℃的预测货架期分别是：86d,78.5d,41.7d,25.6d；而实测的货架期分别是82d,80d,39d,23d，预测值与实测值相对偏差在5％～10％之间，而且温度越小偏差也越小。这也说明量纲规划模型的高度可靠性。说明量纲规划模型可应用于食品货架期的预测。

另外对比分析各温度下的量纲规划模型发现，影响微生物生长的主要影响准数是he准数，这说明cp、θ、t、nt/l²等参数对微生物生长有关键影响，这从生物学上容易理解：cpθ反应食品的热容量，肯定影响微生物的生长，食品中微生物的污染一般来自外界自表面开始，因此微生物的生长也与nt/l²密切相关。aw有一定影响但随着温度的升高其影响可忽略，而ph的影响基本可忽略。还有参数n1基本上介于0-1之间。另外随着温度的升高，k是呈减小趋势。

这也说明量纲规划模型可靠简单，而且不用测初始腐败菌数量，由于正常包装的食品初始腐败菌一般难以检测出，而好多预测模型都需要初始腐败菌才能预测，这就带来了检测上的困难。而量纲规划模型不用检测初始腐败菌含量，这给应用带来了很大的方便性。而且量纲规划模型简单易懂，这更将促进其应用。对于液态食品，推测也可以用量纲规划模型进行：l²可取液态食品与包装物相接触的面积，量纲规划模型中的其它参数与固态食品的相应参数意义相同。

以上实施方式仅是本发明的具体例子，显然本发明的实现并不受上述方式的限制。只要采用本发明的方法构思和技术方案进行的非实质性改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。