一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其是动物科学中的生猪养殖领域，具体涉及一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌。

背景技术：

我国是世界上第一生猪养殖和猪肉消费大国，猪业在农业产业经济中占据主导地位。但我国还不是养猪强国，与养猪发达国家的养猪水平相比还有一段差距，仍存在一些空间有待提高。仔猪是现代化养猪生产的核心，其健康状况对后期的生长发育产生极其重要的影响。近年来，仔猪腹泻是当前集约化养猪条件下出现的高发病症，是导致仔猪生长受阻和死亡率高的主要原因。大肠杆菌性腹泻是仔猪腹泻的常见病症，主要由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli,etec)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhageescherichiacoli,ehec)和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicescherichiacoli，epec)等致病菌引起。据统计，每年死亡的仔猪约有50％与大肠杆菌感染有关，临床表现为仔猪黄痢、仔猪白痢、败血症等，影响仔猪生长发育、降低饲料报酬，甚至引起仔猪死亡而造成较大的经济损失。

在现代生猪生产过程中，仔猪普遍实行早期断奶。断奶后，食物由母乳变为饲料，又因环境的改变，加剧断奶应激，导致仔猪免疫力下降，腹泻率及死亡率升高，给养殖业带来巨大的损失。为提高养殖经济效益，抗生素作为生长促进剂被广泛应用于畜禽养殖业。但抗生素的长期大量使用，破坏了机体的微生态平衡，导致细菌的变异和耐药菌的产生，并在肉制品中的残留，威胁人类的健康。2006年1月欧盟已全面禁止在饲料中添加任何抗生素，日本、美国和我国都出台了相关法律法规限制或禁止抗生素在饲料中的使用，抗生素作为畜禽促生长添加剂的全面限制使用是畜牧业发展的必然趋势。因此，研发能够预防仔猪腹泻的安全、高效、绿色的饲用抗生素替代品，具有显著的经济、社会和生态效益。

微生物饲料添加剂是指通过改善动物肠道菌群生态平衡、促进营养物质消化吸收、增强畜禽免疫功能，以提高动物健康水平的微生物制剂产品。与抗生素相比，微生物饲料添加剂具有安全、无毒性、无残留、无耐药性以及环境友好等优点，是饲用抗生素最具发展潜力的替代品。菌种即益生菌的种类，是微生物饲料添加剂发挥功能的基础，也是产品安全的首要保证，世界各国对此都有明确规定和严格管理。美国食品药品管理局和美国饲料管理协会1989年公布了42种益生菌可以直接饲喂，我国农业部也于2000年公布了16种安全微生物可以应用于饲料工业中。目前应用于畜牧生产中的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等菌株。

戊糖片球菌属链球菌科、片球菌属，为革兰氏阳性菌，因能发酵葡萄糖产生乳酸而属于乳酸菌的一种。2006年我国农业部658号公告《饲料添加剂品种目录》将戊糖片球菌列入了可允许使用的微生物名录。因此，分离得到具有抑制产肠毒素大肠杆菌等致病菌增殖，耐胃酸、肠液环境，抗生素敏感，有效粘附在肠粘膜上皮细胞等益生功能，以及显著降低断奶仔猪腹泻率，提高成活率和生长性能的戊糖片球菌，在生猪养殖领域具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明提供了一株戊糖片球菌菌株，命名为戊糖片球菌l1。该戊糖片球菌l1具有抑制仔猪腹泻主要致病菌增殖，耐胃酸、肠液环境，抗生素敏感，有效粘附在猪肠粘膜上皮细胞等益生功能，经灌服后，能显著降低断奶仔猪腹泻率，提高仔猪的成活率和生长性能。

技术方案

本发明的技术方案：

一株用于预防断奶仔猪腹泻的戊糖片球菌l1，该戊糖片球菌菌株已于2017年5月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.14092，分类命名为戊糖片球菌pediococcuspentosaceus。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该戊糖片球菌具有抑制产肠毒素大肠杆菌等致病菌增殖，耐胃、肠环境，抗生素敏感，有效粘附在肠粘膜上皮细胞等益生功能，经灌服饲喂断奶仔猪，可显著降低断奶仔猪腹泻率，提高成活率和生长性能。

本发明的积极效果有：

(1)降低断奶仔猪腹泻率。

(2)提高成活率和生长性能。

(3)降低抗生素依赖。

附图说明

图1是戊糖片球菌l1仔猪胃肠道环境耐受性检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1戊糖片球菌l1的分离、鉴定

采用mrs选择培养基从泡菜中分离疑似乳酸菌单菌落，应用16srdna序列分析法进行分子生物学鉴定。将扩增的16srdna片段序列在ncbi上使用blast程序比对结果显示，与戊糖片球菌同源性大于99％。基于凡是16srdna可变区序列的同源性大于97.5％便可认为是同一个种的标准，该菌株鉴定为戊糖片球菌，命名为戊糖片球菌l1。其16srdna序列已经提交genbank，序列号为kp792278。

实施例2戊糖片球菌l1对致仔猪腹泻主要肠道致病菌抑菌作用

采用琼脂打孔扩散法，研究戊糖片球菌l1对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli,etec)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhageescherichiacoli,ehec)和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicescherichiacoli，epec)生长繁殖的抑制作用。eteck88ac⁺和eheco157:h7购自中国兽医药品监察所，epec1、etec1、etec3和etec4均为申请人从腹泻仔猪粪便中自主分离得到。将戊糖片球菌l1接种于mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，用mrs肉汤培养基调节菌体数到10⁸cfu/ml；4℃，5000rpm，离心10min，收集上清液；上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，用氢氧化钠调ph至6.2；将20μl浓度为1×10⁸cfu/ml的指示菌菌液(eheco157:h7、epec1、eteck88ac⁺、etec1、etec3和etec4)加入到经高温高压灭菌并冷却到45℃左右的lb固体培养基中，剧烈混合后迅速倒入平皿中，待培养基凝固后用牛津杯在培养基上打孔(直径8mm)，吸取90μl戊糖片球菌l1培养液上清注入小孔中，鼠李糖乳杆菌lgg为参照，灭菌的mrs液体培养基为空白对照，室温下扩散4h后，置于37℃恒温箱中培养24h后，测量抑菌圈直径。戊糖片球菌l1对仔猪腹泻主要肠道致病菌的抗菌活性结果如表1所示，结果表明，戊糖片球菌l1能显著抑制etec、ehec和epec的生长，且抗菌活性均优于参考益生菌菌株鼠李糖乳杆菌lgg。

表1戊糖片球菌l1对仔猪腹泻主要肠道致病菌的抑菌活性

注：“-”表示无抑菌作用；“+”表示抑菌圈半径<3mm；“++”表示抑菌圈半径3-6mm；“+++”表示抑菌圈半径＞6mm。

实施例3戊糖片球菌l1的胃液、肠液耐受性

将戊糖片球菌l1接种到ph3.0的mrs液体培养基中，37℃培养4h，在0、1、2、3、4小时，平板计数法计算活菌数目；随后将戊糖片球菌l1分别接种到含有0.3％猪胆盐的mrs液体培养基中，37℃继续培养4h，在5、6、7、8小时，平板计数法计算活菌数目，检测戊糖片球菌l1的胃液、肠液耐受性。结果如图1所示，与参考菌株鼠李糖乳杆菌lgg比较，戊糖片球菌l1胃肠道环境耐受性更强，且戊糖片球菌l1数量在整个检测时间范围内(8h)均未降低，胃肠道环境耐受性优势突出。

实施例4戊糖片球菌l1的抗生素敏感性

在益生菌使用过程中，如果益生菌携带有抗性基因，就有可能将抗性基因转移给致病菌，使致病菌的耐药性增强。因此，评价抗生素敏感性是研究乳酸菌益生特性的重要指标。采用纸片扩散法检测了戊糖片球菌l1对7种常用抗生素的药敏性，结果如表2所示，戊糖片球菌l1对氨苄青霉素、链霉素、红霉素、四环素和氯霉素敏感，对卡那霉素中度敏感，对万古霉素具有耐药性。研究显示，戊糖片球菌l1对万古霉素的耐药性是先天固有的，一般不会转移给其他菌株。因此，上述研究结果显示戊糖片球菌l1对常用抗生素敏感。

表2戊糖片球菌l1对抗生素的敏感性

实施例5戊糖片球菌l1的猪肠上皮细胞粘附能力

将戊糖片球菌l1接种于mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养18h，4℃，5000rpm，离心10min，除去上清液，收集菌体，用dmem高糖培养基将菌体重新悬起，使菌体浓度达到5×10⁷cfu/ml备用。在培养至汇合的ipec-j2猪肠上皮细胞(细胞密度9×10⁵细胞/ml)中，加入2ml5×10⁷cfu/ml的戊糖片球菌l1-dmem高糖培养基混合液，co2培养箱中37℃培养1h，移除培养基，pbs清洗三次除去未黏附的乳酸菌后，加入1ml含有0.1％tritonx-100的pbs，37℃作用30min裂解ipec-j2细胞，裂解液经pbs梯度稀释后涂布在mrs琼脂平板中，37℃培养48h，计算黏附在ipec-j2细胞上的乳酸菌数量。与参考菌株lgg比较，按下列公式计算黏附指数：黏附指数(％)＝(黏附的细菌数/细胞数)×100。戊糖片球菌l1对猪肠上皮细胞的黏附能力结果如表3所示，戊糖片球菌l1在ipec-j2细胞表面的黏附指数为14.4％，与参考菌株lgg比较差异不显著，表明戊糖片球菌l1可有效粘附在猪肠上皮细胞，发挥益生功能。

表3戊糖片球菌l1对猪肠上皮细胞黏附能力

注：同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著(p<0.05)

实例6戊糖片球菌l1对etec感染断奶仔猪生长性能和腹泻的影响

试验采用30头杜×长×大三元杂交断奶仔猪(断奶日龄21d)，饲喂仔猪日粮过度7d后，随机分配到空白对照组、etec组、戊糖片球菌+etec组。各组处理如下：

a.空白对照组：第1-8天连续灌服10ml无菌生理盐水。

b.etec组：第1-7天连续灌服10ml无菌生理盐水，第8天灌服10ml浓度为10⁹cfu/ml的eteck88ac⁺菌。

c.戊糖片球菌+etec组：第1-7天连续灌服10ml含戊糖片球菌l1(10⁹cfu/ml)的无菌生理盐水，第8天灌服10ml浓度为10⁹cfu/ml的eteck88ac⁺菌。

实验周期为14天，自由采食、自由饮水，称量仔猪初始重、末重，记录每天的采食量和仔猪腹泻情况，计算日增重、日采食量、料肉比和腹泻率。

腹泻率(％)＝[(每组仔猪总腹泻天数)/(仔猪头数×试验天数)]×100

戊糖片球菌l1对etec感染断奶仔猪生长性能和腹泻的影响如表4所示，与空白对照组、etec组相比，戊糖片球菌+etec组仔猪的日增重分别增加了2.72％(p＞0.05)和6.32％(p＞0.05)，料肉比分别降低了0.65％(p＞0.05)和4.94％(p＞0.05)，腹泻率分别降低了30.75％(p<0.05)和61.70％(p<0.05)。结果表明，戊糖片球菌l1可显著降低etec感染断奶仔猪的腹泻率，且有提高仔猪生长性能的趋势。

表4戊糖片球菌l1对etec感染断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。