SNP标志物在II型糖尿病诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及snp标志物在ii型糖尿病诊断中的应用，具体的涉及edv01869.1基因的snp标志物
背景技术：
糖尿病是一种常见的代谢性疾病,发病率与遗传因素、生活方式、饮食结构及年龄等因素有关。根据患者显示的病理学特点，糖尿病可分为两类:i型糖尿病，亦称胰岛素依赖性糖尿病和ii型糖尿病(diabetesmellitustype2，t2dm)，亦称非胰岛素依赖性糖尿病,其中后者占90％以上。ii型糖尿病的主要特征为:胰腺β细胞的胰岛素分泌量下降和胰岛素作用下降，即胰岛素抵抗(insulinresistance，ir)。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，即染色体基因组中单个核苷酸的突变而引起的dna序列的多态性，它以单个碱基的颠换、转换、插入和缺失等形式存在。作为第三代分子标记，snp标记具有很大的发展潜力，被广泛应用于生物、农学、医学、生物进化等众多领域域，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥着重要作用。目前，ii型糖尿病的诊断主要依靠尿糖、尿酮、尿白蛋白、血电解质、血尿素氮和肌酐等实验室检查和各种辅助检查，但是目前基于血糖检测来诊断ii型糖尿病费用高且不适于普遍筛查，基于现有技术对ii型糖尿病早期诊断的局限性，研发一种用于通过易感位点检测ii型糖尿病的产品对于ii型糖尿病的早期诊断具有重要的意义。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断ii型糖尿病易感性的snp位点。通过检测snp基因型来诊断ii型糖尿病具有预警性。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了一种snp标志物，所述snp位点为肠道b.coprocola菌株edv01869.1基因的第424位。进一步，所述snp标志物的突变为c.a424g。本发明提供了snp标志物在制备诊断ii型糖尿病易感性的产品中的应用，所述snp位点为b.coprocola菌株edv01869.1基因的第424位。进一步，在ii型糖尿病患者中，edv01869.1基因的第424位由a突变为g。进一步，所述产品包括检测snp标志物的第424位基因型的试剂。进一步，所述试剂包括特异性扩增edv01869.1的引物，和/或非特异性扩增edv01869.1的引物。进一步，所述特异性扩增edv01869.1基因的引物序列如seqidno.1～6所示，非特异性扩增edv01869.1基因的引物序列如seqidno.7～8所示。本发明提供了一种诊断ii型糖尿病的产品，所述产品包括检测snp标志物的试剂，所述试剂能够检测b.coprocola菌株edv01869.1基因的第424位的基因型。进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。进一步，所述试剂选自：识别所述snp标志物的寡核苷酸探针；或扩增所述snp标志物的引物。进一步，所述引物包括特异性扩增引物，和/或非特异性扩增引物。进一步，所述特异性扩增引物序列如seqidno.1～6所示，非特异性扩增引物序列如seqidno.7～8所示。本发明提供了上述产品在制备诊断ii型糖尿病的工具中的应用。在本发明中，ncbi提供的edv01869.1基因参考基因序列如seqidno.9所示。在本发明中，本领域技术人员能通过检测snp位点的任何方法或技术来检测edv01869.1基因的snp位点。所述方法包括但不限于以单链构象多态性(sscp)、变性梯度凝胶电泳(ddge)、酶切扩增多态性序列(caps)、等位基因特异性pcr(allele-specificpcr，as-pcr)等为代表的以凝胶电泳为基础的检测方法以及以直接测序、dna芯片、变性高效液相色谱(dhplc)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(hrm)等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。sscp是指单链dna由于碱基序列不同可引起空间构象差异，这种差异会导致相同或相近长度单链dna电泳迁移率的不同，从而可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行有效地检测。pcr-sscp是将sscp用于pcr扩增产物的基因突变检测的方法，pcr扩增的dna片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链dna扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。目前，pcr-sscp技术被广泛应用于分子生物学的各个领域。deeg利用双链dna分子在含有一定浓度梯度变性剂的凝胶中进行电泳时，由于存在突变的双链dna分子和不存在突变的双链dna分子在不同的部位解旋而区分。dgge能够检测长达1kb的dna片段，若snp恰好出现在发生部分解旋的dna区域内，其检出率可以高达100％。caps又称为pcr-rflp。caps是将pcr技术与rflp技术相结合，利用dna片段在酶切位点上碱基的变异，采用相应的限制性内切酶，对该dna片段的pcr扩增产物进行酶切，因而产生多态性。衍生酶切扩增多态性(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence，dcaps)是在caps技术的基础上，通过在引物上引入错配碱基、创造酶切位点，进而实现多态性检测。caps和dcaps结合应用，实际上可以用于检测任何snp。as-pcr的原理是由于taqdna聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与snp位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与snp位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。目前，已出现了基于as-pcr改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系pcr(tetra-primeramplificationrefractorymutationsystempcr,tetra-primerarms-pcr)、片段长度差异等位基因特异pcr(fragmentlengthdiscrepantallelespecificpcr,fldas-pcr)、多等位基因特异扩增(pcramplificationofmultiplespecificalleles,pmasa)等。直接测序检测snp是最直接可靠的方法，检出率高达100％，代表测序技术有焦磷酸测序(pyrosequencing)、taqman技术、微测序(snapshot)等。该方法通过比对不同样本中的同一基因或是基因片段的pcr扩增产物的测序结果，或是重测序分析已定位的序列标签位点(sts)及表达序列标签(est)来检测snp。可以将pcr产物纯化回收后通过连接到载体上进行测序，也可以对pcr产物直接进行测序。通过序列的比对，就能够准确地检测snp的突变类型和位置。dna芯片又被称为基因芯片、生物芯片。该方法根据已知的snp位点设计两种或者多种探针，将设计好的探针固定在特殊的载体上；待测dna经荧光染料标记后，与已固定好的探针进行杂交；依据碱基互补配对，存在单个错配碱基的序列不能与探针杂交，通过杂交分子之间的洗脱差异性即荧光强弱来检测snp位点。dhplc是在dgge和sscp的基础上发展起来了一种新的snp检测的方法，是在接近dna解旋温度条件下进行的离子对反相色谱分析，该方法色谱柱中的固相是其决定性因素，固相对于单链dna和双链dna有着不同的亲和力。存在snp位点的pcr扩增产物经过加热变性后退火，核酸分子由于不同的来源而形成同源及异源的双链dna分子。在部分变性温度时，异源dna双链的解旋温度较低而更易于解旋为单链，先从色谱柱中流出，与同源双链dna分离，这样便可以通过吸收峰峰型和峰的个数比较来检测snp。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixas-sistedlaserdesorptionionizationtimeofflight,mal-di-tof)是目前用于检测snp的质谱法中主要的一种方法。maldi-tof主要有三种不同的检测方式：(一)单碱基引物延伸法(singlenu-cleotideprimerextend,snupe)，若引物3'末端在snp位点上游，且4种ddntps都存在时，引物就会单碱基延伸，依据snp位点碱基类型引入不同质量的ddntp，还可以在引物或者ddntp上引入附加质量，来提高准确度和分辨率。(二)多碱基引物延伸法(primeroligonucleotidebaseextension,probe)，若引物3'末端在snp位点上游，且存在1种ddntp和3种dntps，在第一个与ddntp配对的碱基处，引物延伸并终止于此，由于snp位点的不同而产生具有不同分子量的产物。probe法与dna芯片结合可以实现高度自动化和高通量的分析。(三)肽核酸探针(peptidenucleicacids,pna)杂交法，将变性后的单链dna与pna进行杂交，利用质谱检测技术分析杂交产物的质量差异。hrm由常规熔解曲线技术、饱和荧光染料和采集荧光信号的仪器相结合面发展起来，无需特异性的探针，通过一种饱和荧光染料对pcr产物进行分析。该方法通过dna双链熔解曲线的变化可以反映核苷酸性质的差异。在pcr反应时加入饱和荧光染料，pcr过程中荧光染料会被嵌入到dna双链中，当嵌有染料的dna双链解旋时，仪器就会对荧光信号进行采集，进而呈现出熔解曲线。如果序列中有一个碱基发生了改变，就会出现不同的熔解曲线形状和tm值，利用软件可以快速地对已知及未知样品进行分析。本领域技术人员可选择任一种或几种方法来检测snp位点，只要可以实现snp位点的检测。在本发明中，一种诊断ii型糖尿病易感性的产品，所述产品包括检测edv01869.1基因snp位点的试剂。其中，当edv01869.1的snp位点的基因型为g时，ii型糖尿病的易感性增加。本发明的该产品可以包括采用本领域已知的任何技术检测snp位点基因型的试剂，只要其能够检测样本中snp位点基因型即可。在本发明中，诊断ii型糖尿病的产品可以是芯片、阵列、试剂盒或核酸膜条。所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的edv01869.1基因的snp位点。所述芯片可用于检测包括edv01869.1基因的snp位点在内的多个snp位点(例如与ii型糖尿病易感性相关的一个或多个基因的一个或多个snp位点)。所述核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。在本发明中，针对edv01869.1基因的snp位点的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。在本发明中的一些实施例中，所述检测产品在人类受试者中进行ii型糖尿病的易感性评价和/或诊断和/或预测的体外方法中使用，其中所述产品包含用于进行下列步骤的适当的工具：(1)评价至少一种与所述的基因组dna样品中的edv01869.1基因snp位点的类型和/或水平；(2)将所述的人类受试者的在(1)中评价的生物标记数据与健康的和/或患病的人的生物标记数据进行比较，来做出所述的人类受试者的ii型糖尿病的风险评价和/或诊断和/或预测。在本发明中，术语“基因型”指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。在一些实施例中，所述试剂盒在鉴定人类受试者中的与ii型糖尿病易感性相关的snp的体外方法中使用，所述试剂盒包含用于进行下列步骤的适当的工具：(1)检测所述的人类受试者的核酸样品中的edv01869.1基因的至少一种snp，其中所述至少一种snp预示着ii型糖尿病的易感性；(2)鉴定所述的人类受试者的snp单倍型，其中所述snp单倍型包含所述在(1)中检测的snp。在本发明中，当是指检测试剂盒时，术语“适当的工具”是指任何用于达到所指明的目的的任何技术手段。作为这种适当的工具的非限制性例子，能列举试剂和/或材料和/或流程和/或说明书和/或软件等。本发明所述的所有试剂盒可包含适当的包装和说明书用于在本文所公开的方法中使用。在本发明中，“核酸”意指dna和rna两者，两者均以任何可能的构型存在，即以双链(ds)核酸的形式，或以(ss)核酸的形式，或者以其组合形式(部分ds或ss)。这样的核酸对应于任选地包含至少一种修饰的核苷酸的至少两个连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核酸也可以在核苷酸件的键的水平上被修饰(如硫代磷酸、h-磷酸酯、烷基磷酸酯)，在主链的水平上被修饰(例如α-寡核苷酸)或pna或2′-o-烷基核糖)。这些修饰中的每一种可以联合发生，只要在核酸中存在至少一种磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体rna、信使rna、转移rna、通过酶促扩增技术获得的核酸。所述酶促扩增技术例如是pcr(聚合酶链式反应)及其rt-pcr衍生形式、pcr(修复链反应)、3sr(自动维持序列扩增)、nasba(依赖核酸序列的扩增)、tma(转录介导的扩增)。在本发明中，术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和ph)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖dna或依赖rna的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。进一步，所述检测检测试剂包括针对snp位点的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断ii型糖尿病易感性基因snp位点的引物和/或探针。将一种或多种基因的多个snp位点的检测引物和/或探针放置在同一产品中通过检测多种snp位点指标联合诊断ii型糖尿病易感性的情况也包含在本发明的保护范围之内。在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知ii型糖尿病易感性的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个基因snp位点的不同的寡核苷酸探针，阵列还可含有对照，非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了肠道微生物b.coprocola菌株edv01869.1基因snp位点基因型与ii型糖尿病有关。在此基础上提出一种通过检测snp位点来预判ii型糖尿病易感性风险性的产品。本发明的检测产品具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的产品对正常人群进行ii型糖尿病易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。附图说明图1显示edv01869.1基因聚类分析结果图；图2显示利用sanger测序的方法检测edv01869.1基因特异的snp位点。具体实施方式下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例筛选与ii型糖尿病相关的肠道微生物b.coprocola菌中edv01869.1基因的snp位点1、研究对象ii型糖尿病组：随机抽取医院内分泌科收治的72例ii型糖尿病初诊患者，纳入标准：符合《who1999年糖尿病诊断标准》。正常组：选取健康志愿者56例。所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。2、粪便基因组dna的提取取已保存于-80℃冰箱的粪便样本200g，使用天根粪便基因组dna提取试剂盒按照《天根粪便基因组dna提取说明书》的操作流程，提取粪便样本基因组dna。3、dna纯度检测dna纯度：od260/od280比值是衡量dna样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的dna样品，od260/od280值在1.8左右。4、pcr扩增目的基因(1)引物设计根据genbank中edv01869.1基因的编码序列设计pcr扩增产物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。所合成的能够特异扩增目的基因(二次pcr引物)的具体引物序列如下：1)正向引物5’-ttccctcaccgtcagaaagc-3’(seqidno.1)，反向引物5’-agatggtggctgcttcttcc-3’(seqidno.2)2)正向引物5’-cccgggcattttggttcaag-3’(seqidno.3)反向引物5’-gctttctgacggtgagggaa-3’(seqidno.4)3)正向引物5’-tgaacgtcgtgaccgtttct-3’(seqidno.5)反向引物5’-tccgtctactggaccgaagt-3’(seqidno.6)所合成的能够非特异扩增目的基因(一次pcr引物)的具体引物序列如下：正向引物5’-taggacatcaggcgtacgga-3’(seqidno.7)反向引物5’-ctaagccagcacggtctagg-3’(seqidno.8)(2)扩增方式采用普通pcr，运用二次扩增的方式，选用预先设计好的非特异扩增引物进行一次pcr(20μl体系)，反应体系见表1，反应条件：94℃3min，(94℃30s，58℃30s，72℃2min)*40个循环，72℃5min。选用预先设计好的三对特异性扩增引物进行二次pcr(30μl体系)，反应体系见表2，反应条件：94℃3min，(94℃30s，55℃30s，72℃2min)*40个循环，72℃5min。表1一次pcr反应体系试剂体积正向引物0.4μl反向引物0.4μl天根2×pfupcrmastermix10μl模板1μlddh2o补足20μl表2二次pcr反应体系试剂体积正向引物0.6μl反向引物0.6μl天根2×pfupcrmastermix15μl模板1μlddh2o补足30μl5、检测目的条带采用普通琼脂糖凝胶电泳的方法(电泳条件：1％胶；1×tae电泳缓冲液；90v，30分钟)检测目的条带。6、pcr产物测序pcr产物通过sanger测序，正反引物同时测序得到目的序列。7、测序结果分析用mega7和raxml对得到的测序结果做进化树分析，用seqman统计序列中的snp。8、结果结果如图1所示，图中蓝色三角形代表健康人，红色圆点代表糖尿病患者，聚类结果明显分为两类，第一类主要是糖尿病患者，健康人集中在第二类，右图是相应的突变位点分析，第一类在424位几乎都发生了突变，第二类在424位都没有发生突变，or(oddsratio)值为6.22，费舍尔精确检验p＝8.87×10-4，表明b.coprocola菌edv01869.1基因在糖尿病患者和健康人之间有显著差别。如图2所示，edv01869.1基因突变位点分析结果，与ncbi提供的edv01869.1参考基因序列比对，第一类中的68位糖尿病患者中有67位在基因的第424位都发生了突变，由a碱基突变为了g碱基，对应的氨基酸由赖氨酸变为了谷氨酸，属于错义突变，而第二类中的健康人在基因的第424位都未发生突变。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>snp标志物在ii型糖尿病诊断中的应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttccctcaccgtcagaaagc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agatggtggctgcttcttcc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cccgggcattttggttcaag20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gctttctgacggtgagggaa20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgaacgtcgtgaccgtttct20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tccgtctactggaccgaagt20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7taggacatcaggcgtacgga20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ctaagccagcacggtctagg20<210>9<211>1908<212>dna<213>bacteroidescoprocola<400>9atggaacaacccatttcttacgaattgttgaataaaatagatagcccggaagatttgcgt60catcttcctatcgagtctttacctgaggtctgtcgggagctcagggataaaatcattgat120gaactttctcgcaatcccgggcattttggttcaagtttaggagtaatagaattaactgtt180gcacttcattatatattcaataccccctatgaccgcattgtatgggacgtaggacatcag240gcgtacggacataagatactgactgaacgtcgtgaccgtttctgtacaaacagaaaacta300aacggtttatgcccttttccctcaccgtcagaaagcgaatatgatacgtttacctgtgga360catgcatccaactctatctccgtagctctaggcatggctgttgctgcggcccgcaaaggt420gaaaaaaaccgccatgtagtagccgtaatcggggatggttcgatgagtggcgggctggct480tttgaaggattgaataatgcgtcttctactcccaacaatttgctgattatcttgaacgat540aacaacatggcgatcgatcggagcgtaggaggaatgaaacaatatctgctaaatctccaa600acatcagaaggatacaaccgactgagatataacatctcaaagaagctacatcagtgggga660gttctgaatgaagaacgccggaaaagcttaatccgtttcaacaatagcctgaaatctgtt720cttacccaacaacagaacatttttgagggaatgaatatccgctacttcggtccagtagac780ggacacgatgtttttgctctggcaaaagtactgaaagaaattaaggacatgaagggaccg840aaactacttcatatccatacaatcaaaggcaaaggattcaaacctgcggaagaagcagcc900accatctggcatgctccaggcatattcgataaagaaactggagaaagaatcgtaaatgat960acaagtggtatgccacctttattccaggatgtgtttggcaaaaccttactggaactggca1020aaaaagaacgacaaaattattggagtgactccagccatgcctactggctgttctatgaat1080atcttaatgaaagctatgcccgaccgtgcattcgatgtaggcattgccgaaggacatgcc1140gtaactttttcgggaggtatggccaaagagggattactgcctttctgtaacatttactcc1200tcgttcatgcaacgggcatacgacaatattatccacgacatagccatacagaaactgaat1260gtagtgttatgcctagaccgtgctggcttagtaggagaagacggtccaacgcatcatggc1320gtattcgatctggcgtatttacgtcctatccctaacctaacaatagcttcaccttacgac1380gaacaggaactgcgccggctgatgtatacagcacagcttcccgaccaaggtccttttgtt1440atccgctatcctcgcggacgaggtgtgctgaccaactgggaatgtccacttaaagctgtt1500gaagtgggaaagggcagaaaactgaaagacggttccgacctggctgtaatcacaatcggt1560cctatcggaaatacagcagccaaagctattacagaagccgagaatactcataattgcagc1620attgcccactacgatctccgttttttaaaaccactggatgaagcattattacacgagata1680ggaaaaaaattctcacgtatcattacaatagaagatggagtgctcaaaggtggaatggga1740agtgctgttctggaatttatgtcagacaataactacacccctatggtaaagcgtatgggt1800attcctgaccattttatacaacatggtcctgtaaatgctctttactccatttgtggtatc1860gatcaaacaggtatatataatacattaattcatattctgaactcatga1908当前第1页12