本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法。
背景技术：
l-酪氨酸(l-β-对羟苯基-β-丙氨酸；(2s,3r)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸)属于芳香族氨基酸，是人体的条件必需氨基酸，它常作为营养补充剂及l-多巴、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料被广泛用于食品、饲料、医药和化工等行业。l-酪氨酸的生产方法包括蛋白水解法、化学合成法、酶法和直接发酵法。传统的l-酪氨酸生产方法主要是蛋白水解法和酶法，但这些方法存在诸多缺点，如原料来源有限、反应过程中酶活性和稳定性差、工艺繁琐、产品成分复杂等。而微生物直接发酵法生产氨基酸具有原料来源广泛、反应温和、操作简单等优势。随着代谢工程技术的不断发展，对微生物中l-酪氨酸的合成途径进行合理设计和优化以实现l-酪氨酸的发酵生产成为研究热点。
目前，l-酪氨酸的合成途径和调控机制以大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中研究的最为清晰，其代谢途径改造主要集中在解除途径调控、增加前体供应、阻断竞争途径和调节转运系统等几个方面。虽然已报道的关于l-酪氨酸代谢工程的研究已经充分阐释了其代谢途径中的关键基因、调控机理和改造靶点等，但l-酪氨酸的发酵生产依然存在产量低或糖酸转化率低的问题，且目前还没有成熟的发酵法生产技术来进行l-酪氨酸的工业化生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种l-酪氨酸基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种利用上述基因工程菌生产l-酪氨酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是：
一种l-酪氨酸基因工程菌，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中l-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，阻断竞争途径苯丙氨酸合成途径，解除关键酶的反馈抑制和转录负调控，并利用木糖启动子诱导来源于t7噬菌体的rna聚合酶，结合t7强启动子系统启动关键酶基因的高效表达。
所述基因工程菌敲除了l-苯丙氨酸合成酶基因phea及其调控基因phel，将木糖启动子pxylf控制的t7噬菌体rna聚合酶整合到lacz位点，将由t7启动子控制的tyra(m53i,a354v)-tyrb整合到tyrr位点，t7启动子控制的arog(s180f)整合到yghx假基因位点。
本发明的技术方案之二是：上述基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)采用大肠杆菌crispr/cas9基因编辑技术，以e.coliw3110为出发菌株，敲除phela基因；
(2)构建木糖启动子pxylf和t7rna聚合酶t7rnap的连接片段，并将其整合至lacz位点；
(3)构建pt7启动子和tyra(m53i,a354v)-tyrb的连接片段，并将其整合至tyrr位点。
(4)构建pt7启动子和arog(s180f)的连接片段，并将其整合至yghx假基因位点；
本发明的技术方案之三是：利用上述基因工程菌生产l-酪氨酸的方法。
按10-15％的接种量进行发酵培养，发酵开始时添加10g/l木糖诱导目的基因表达，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加氨水控制ph在7.0-7.2，发髻过程中补加葡萄糖溶液。
优选的发酵培养基组成为：葡萄糖10g/l，木糖10g/l，酵母粉5g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po43g/l，mgso4·7h2o2g/l，柠檬酸钠2g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，feso4·7h2o30mg/l，微量元素混合液(na2moo4·2h2o2.5g/l，alcl3·6h2o2.5g/l，niso4·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o1.75g/l，cacl2·2h2o10g/l，znso4·7h2o0.5g/l，cucl2·2h2o0.25g/l，h3bo30.125g/l)1.5ml/l，vb10.5mg/l，vh0.5mg/l，l-苯丙氨酸0.5g/l，ph7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
5l发酵罐发酵生产l-酪氨酸的步骤如下：
(1)种子培养：当种子培养液od600达到10-15时，准备接入发酵培养基；
(2)发酵培养：按10-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，发酵开始时添加10g/l木糖诱导目的基因表达，培养温度为37℃，通过自动流加氨水控制培养基ph为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲流加80％的葡萄糖溶液，当发酵液中的l-酪氨酸晶体与泡沫结合在一起时，控制溶氧在30％以上。
优选的发酵培养基组成为：葡萄糖10g/l，木糖10g/l，酵母粉5g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po43g/l，mgso4·7h2o2g/l，柠檬酸钠2g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，feso4·7h2o30mg/l，微量元素混合液(na2moo4·2h2o2.5g/l，alcl3·6h2o2.5g/l，niso4·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o1.75g/l，cacl2·2h2o10g/l，znso4·7h2o0.5g/l，cucl2·2h2o0.25g/l，h3bo30.125g/l)1.5ml/l，vb10.5mg/l，vh0.5mg/l，l-苯丙氨酸0.5g/l，ph7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
本发明有如下有益效果：
本发明提供的l-酪氨酸基因工程菌的菌株遗传背景清晰，基因操作简单高效，菌株不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素，用t7强启动子控制关键酶基因，使用木糖诱导关键酶基因的高效表达，降低了生产成本，避免了iptg等诱导剂对细胞的伤害，发酵工艺简单、可控性强，摇瓶发酵24h，产量达6.8g/l，5l发酵罐发酵30h，产量可达37.8g/l，适合于工业化大规模生产。
具体实施方式
下面通过具体实施实例对本发明作进一步说明：
本发明公开一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法，所述基因工程菌是通过代谢工程的方法，在基因组层面对大肠杆菌中l-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，阻断竞争途径苯丙氨酸合成途径，解除关键酶的反馈抑制和转录负调控，并利用木糖启动子诱导来源于t7噬菌体的rna聚合酶，结合t7强启动子系统启动关键酶基因的高效表达。利用该菌株进行摇瓶发酵24h可积累l-酪氨酸6.8g/l，在5l发酵罐中发酵30h产量可达37.8g/l。所述基因工程菌不携带质粒，发酵过程中不需要添加抗生素，同时使用木糖诱导关键酶基因的高效表达，降低了生产成本，避免了iptg等诱导剂对细胞的伤害，所述生产l-酪氨酸的方法简单、可控性强，适合于工业化大规模生产。
实施例1：大肠杆菌l-酪氨酸基因工程菌株的构建
以下基因的敲除与整合均采用大肠杆菌crispr/cas9基因编辑技术。
(1)phela基因的敲除
①以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据phela基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物(phela-1、phela-2)和下游同源臂引物(phela-3、phela-4)，通过hs酶pcr扩增获得phela基因的上、下游同源臂；
②以步骤①中获得的扩增片段为模板，通过hs酶重叠pcr获得phela基因敲除片段，所述基因敲除片段由phela基因上、下游同源臂组成；
③以pgrb-phela-f和pgrb-phela-r为引物，通过退火构建pgrb-phela使用的含靶序列的dna片段，并将其化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pgrb-phela；
④将步骤②和③中获得的phela基因敲除片段和pgrb-phela质粒同时电转化至含有predcas9的e.coliw3110电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pgrb-phela、predcas9后获得菌株e.colityr01。
(2)pxylf-t7rnap基因整合至lacz位点
①以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据木糖编码基因xylf基因序列设计引物pxylf-1和pxylf-2，通过hs酶pcr扩增获得木糖启动子pxylf片段；
②以e.colibl21(de3)基因组为模板，根据t7rnap基因序列设计引物t7rnap-1和t7rnap-2，通过hs酶pcr扩增获得t7rnap片段；
③以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据lacz基因序列，分别在基因两端设计上游同源臂引物(lacz-1、lacz-2)和下游同源臂引物(lacz-3、lacz-4)，通过hs酶pcr扩增获得lacz基因的上、下游同源臂；
④以步骤①、②和③中获得的扩增片段为模板，通过hs酶重叠pcr获得pxylf-t7rnap基因整合片段，所述基因整合片段由lacz上游同源臂、pxylf-t7rnap片段和lacz下游同源臂组成；
⑤以pgrb-lacz-f和pgrb-lacz-r为引物，通过退火构建pgrb-lacz使用的含靶序列的dna片段，并将其化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pgrb-lacz；
⑥将步骤④和⑤中获得的pxylf-t7rnap基因整合片段和pgrb-lacz质粒同时电转化至含有predcas9的e.colityr01电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pgrb-lacz、predcas9后获得菌株e.colityr02。
(3)pt7-tyra(m53i,a354v)-tyrb基因整合至tyrr位点
①以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据tyra基因序列，分别在基因两端设计tyra(m53i)突变上游同源臂引物(tyra(m53i)-1、tyra(m53i)-2)和tyra(m53i)突变下游同源臂引物(tyra(m53i)-3、tyra(m53i)-4)，其中tyra(m53i)-2和tyra(m53i)-3同时含突变序列(atg突变为atc)且反向互补，通过hs酶pcr扩增获得tyra(m53i)基因的上、下游同源臂，再以其上、下游同源臂为模板，通过ex.taq酶重叠pcr扩增获得含tyra(m53i)突变的片段，所述突变片段由tyra(m53i)突变上游同源臂和tyra(m53i)突变下游同源臂组成。将突变片段与t载体连接后化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒后测序确定成功构建t载-tyra(m53i)；
②以t载-tyra(m53i)为模板，根据tyra基因序列，分别在基因两端设计tyra(a354v)突变上游同源臂引物(tyra(m53i)-1、tyra(a354v)-1)和tyra(a354v)突变下游同源臂引物(tyra(a354v)-2、tyra(m53i)-4)，其中tyra(a354v)-1和tyra(a354v)-2同时含突变序列(gca突变为gtc)且反向互补，通过hs酶pcr扩增获得tyra(m53i)基因的上、下游同源臂，再以其上、下游同源臂为模板，通过ex.taq酶重叠pcr扩增获得含tyra(m53i,a354v)突变的片段，所述突变片段由突变上游同源臂和突变下游同源臂组成。将突变片段与t载体连接后化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒后测序确定成功构建t载-tyra(m53i,a354v)；
③以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据tyrr基因序列，分别在基因两端设计tyrr上游同源臂引物(tyrr-1、tyrr-2)和tyrr下游同源臂引物(tyrr-3、tyrr-4)，根据tyrb基因序列设计引物(tyrb-1，tyrb-2)，以步骤②中构建的t载-tyra(m53i,a354v)为模板，根据tyra基因序列设计引物(tyra(m53i,a354v)-1、tyra(m53i,a354v)-2)，其中t7启动子序列设计在tyrr-2和tyra(m53i,a354v)-1上，t7终止子序列设计在tyrb-2和tyrr-3上，通过hs酶pcr扩增获得各基因片段，再以其为模板，通过hs酶重叠pcr获得pt7-tyra(m53i,a354v)-tyrb基因整合片段，所述基因整合片段由tyrr上游同源臂、pt7-tyra(m53i,a354v)-tyrb片段和tyrr下游同源臂组成；
④以pgrb-tyrr-f和pgrb-tyrr-r为引物，通过退火构建pgrb-tyrr使用的含靶序列的dna片段，并将其化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pgrb-tyrr；
⑤将步骤③和④中获得的pt7-tyra(m53i,a354v)-tyrb基因整合片段和pgrb-tyrr质粒同时电转化至含有predcas9的e.colityr02电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pgrb-tyrr、predcas9后获得菌株e.colityr03。
(4)pt7-arog(s180f)基因整合至yghx位点
①以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据arog基因序列，分别在基因两端设计arog(s180f)突变上游同源臂引物(arog(s180f)-1、arog(s180f)-2)和arog(s180f)突变下游同源臂引物(arog(s180f)-3、arog(s180f)-4)，其中arog(s180f)-2和arog(s180f)-3同时含突变序列(tct突变为ttt)且反向互补，通过hs酶pcr技术扩增获得arog(s180f)基因的上、下游同源臂，再以其上、下游同源臂为模板，通过ex.taq酶重叠pcr获得含arog(s180f)突变的片段，所述突变片段由arog(s180f)突变上游同源臂和arog(s180f)突变下游同源臂组成。将突变片段与t载体连接后化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒后测序确定成功构建t载-arog(s180f)；
②以e.coliw3110(atcc27325)基因组为模板，根据yghx基因序列，分别在基因两端设计yghx上游同源臂引物(yghx-1、yghx-2)和yghx下游同源臂引物(yghx-3、yghx-4)，以步骤①中构建的t载-arog(s180f)为模板，根据arog基因序列设计引物(arog(s180f)-5、arog(s180f)-6)，其中t7启动子序列设计在yghx-2和arog(s180f)-5上，t7终止子序列设计在arog(s180f)-6和yghx-3上，通过hs酶pcr扩增获得各基因片段，再以其为模板，通过hs酶重叠pcr获得pt7-arog(s180f)基因整合片段，所述基因整合片段由yghx上游同源臂、pt7-arog(s180f)和yghx下游同源臂组成；
③以pgrb-yghx-f和pgrb-yghx-r为引物，通过退火构建pgrb-yghx使用的含靶序列的dna片段，并将其化转至dh5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pgrb-yghx；
④将步骤②和③中获得的pt7-arog(s180f)基因整合片段和pgrb-yghx质粒同时电转化至含有predcas9的e.colityr03电转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，消除质粒pgrb-yghx、predcas9后获得菌株e.colityr04。
上述实验过程所用引物见下表：
实施例2
摇瓶发酵实验
(1)种子培养：将斜面菌种接种至装液量为30ml的500ml圆底三角瓶中，九层纱布封口，37℃、200rmp培养10h；
(2)发酵培养：按10％的接种量接种至装液量为30ml的500ml挡板三角瓶中，九层纱布封口，37℃、200rmp培养，发酵开始时添加10g/l木糖诱导目的基因表达，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加25％的氨水控制ph在7.0-7.2，通过补加60％的葡萄糖溶液维持发酵进行。发酵24h，l-酪氨酸产量为6.8g/l。
发酵培养基组成为：葡萄糖10g/l，木糖10g/l，酵母粉5g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po43g/l，mgso4·7h2o2g/l，柠檬酸钠2g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，feso4·7h2o30mg/l，微量元素混合液(na2moo4·2h2o2.5g/l，alcl3·6h2o2.5g/l，niso4·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o1.75g/l，cacl2·2h2o10g/l，znso4·7h2o0.5g/l，cucl2·2h2o0.25g/l，h3bo30.125g/l)1.5ml/l，vb10.5mg/l，vh0.5mg/l，l-苯丙氨酸0.5g/l，ph7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
实施例3
5l发酵罐发酵具体方法如下：
(1)种子培养：在无菌条件下，将适量无菌水倒入斜面中，用接种环将菌体悬浮，然后采用火焰接种的方式将菌悬液接种于种子培养基中进行培养。培养温度为37℃，初始通气量为2l/min，初始搅拌转速为200r/min，通过自动流加25％的氨水控制培养基ph为7.0-7.2，当溶氧低于25％时，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，以泡敌消泡，每隔2h测样、记录数据，当od600达到10-15时，准备接入发酵培养基。
(2)发酵培养：按10％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，发酵开始时添加10g/l木糖诱导目的基因表达，培养温度为37℃，通过自动流加25％的氨水控制培养基ph为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，间歇流加80％的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖残糖浓度为0.05-5g/l，当发酵液中的l-酪氨酸晶体与泡沫结合在一起时，控制溶氧在30％以上。发酵30h，l-酪氨酸产量为37.8g/l。
间歇流加是指：根据发酵液中葡萄糖残糖浓度调节补糖脉冲比(18-30:1)，已提供残糖浓度具体数值。
发酵培养基组成为：葡萄糖10g/l，木糖10g/l，酵母粉5g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po43g/l，mgso4·7h2o2g/l，柠檬酸钠2g/l，cacl2·2h2o0.015g/l，feso4·7h2o30mg/l，微量元素混合液(na2moo4·2h2o2.5g/l，alcl3·6h2o2.5g/l，niso4·6h2o2.5g/l，cocl2·6h2o1.75g/l，cacl2·2h2o10g/l，znso4·7h2o0.5g/l，cucl2·2h2o0.25g/l，h3bo30.125g/l)1.5ml/l，vb10.5mg/l，vh0.5mg/l，l-苯丙氨酸0.5g/l，ph7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>天津科技大学
<120>一种l-酪氨酸基因工程菌及其生产l-酪氨酸的方法
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