一种BMP-2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用的制作方法

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及干细胞成骨分化。
背景技术：
巨大骨缺损一直是临床上常见的难题，骨移植是其主要治疗方法，但存在感染、免疫排斥等诸多缺点。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmscs)具有多向分化潜能，可在不同诱导条件下向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等细胞分化，由于其提取方便、增殖活跃、低免疫原性以及能向成骨细胞分化，无疑成为理想的组织工程种子细胞。骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticprotein2，bmp-2)是一种多功能蛋白，可以诱导新骨形成和骨折愈合，在胚胎发育过程中调节干细胞增殖分化方面有着重要的作用，且在体外能够诱导干细胞成骨和成软骨分化。vegf是目前认为成血管性能最强的因子，它在成骨过程中也是一个不可缺少的因子。vegf常见有vegf-121、145、206、189、165这5种异构体，其中vegf-165以其含量最多、生物作用性最强而被广泛研究。vegf-165可以增加血管的通透性，更利于骨形成区域各类养分、因子及修复细胞的渗透并发挥作用；vegf-165可直接作用于血管内皮细胞，促进其分裂同时抑制其凋亡；它又能促进新的血管形成，使无血管区域的组织工程骨产生新的血管；它也能促进bmscs向成骨细胞分化。以bmp-2或vegf-165为靶标筛选bmscs成骨分化促进剂是公认可行的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种bmp-2激活剂及在干细胞诱导分化方面的应用。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：山金车内酯c用作骨形态发生蛋白2激活剂的用途。山金车内酯c用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶(alp)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，alp的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。alp活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，alp活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故alp的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。待测化合物1～3通过激活hbmscs中bmp-2蛋白表达促进hbmscs成骨分化，待测化合物4、5通过激活hbmscs中vegf-165蛋白表达促进hbmscs成骨分化。附图说明图1是待测化合物的化学结构式。图2是待测化合物1～3对hbmscs中bmp-2蛋白表达水平的影响。图3是待测化合物4～6对hbmscs中vegf-165蛋白表达水平的影响。图4是各化合物对hbmscs中alp活性的影响。具体实施方式一、实验材料待测化合物分别为飞蓬属倍半萜内酯(待测1，cas号：54999-07-4)、山金车内酯c(待测2，cas号：34532-67-7)、旋覆花内酯c(待测3，cas号：79383-83-8)、异淡红乳菇素(待测4，cas号：62024-77-5)、3β,8β,5,13-二环氧-5,7(13)-乳菇二烯(待测5，cas号：72601-36-6)、5,13-环氧-3β-羟基乳菇-2(9),5,7(13)-三烯-4,8-二酮(待测6，cas号：135010-63-8)，结构式如图1所示。胎牛血清购自美国thermo公司；dmem培养基购自美国gibco公司；alp、cck-8检测试剂盒、总蛋白定量测试盒(bca法)和ripa细胞裂解液均购自南京建成生物工程研究所；bmp-2单克隆抗体购自北京中杉金桥，vegf-165单克隆抗体购自abcam公司。二、实验方法1、hbmscs的分离培养于健康志愿者签署知情同意书后，在髂后上棘穿刺采集志愿者的骨髓液5ml，将骨髓液肝素抗凝后，加等量pbs混匀，使之成为单细胞悬液，2500r/min离心15min。吸出试管中间骨髓单个核细胞层，加入pbs3ml，1000r/min离心5min，共洗2次。弃pbs，加入含有10％胎牛血清的dmem培养基混匀，移至塑料细胞培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱内培养48h后弃除悬浮细胞半量换液，之后每2d换液1次，利用hbmscs可黏附于塑料培养瓶壁生长这一特性进行分离纯化。细胞传代2次后基本除去非贴壁的球形骨髓造血干细胞，得到纯化的hbmscs，提取生长良好的第3代细胞进行实验。2、细胞分组和给药将处于对数生长期的hbmscs接种于含有10％胎牛血清dmem培养基的培养皿中，37℃、5％co2的细胞培养箱中常规培养。细胞分为对照组和给药组。对照组：连续用含10％胎牛血清的dmem培养液培养；给药组：含10％胎牛血清的dmem培养液加终浓度为10μm的药物培养。3、westernblotting法检测hbmscs中bmp-2和vegf-165蛋白表达水平hbmscs以5×104/ml的密度接种于6孔板中，每孔2ml，对照组及给药组诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后回收，pbs漂洗2次，加入细胞裂解液ripa，冰上静置15min后收集裂解液，将裂解产物反复冻融裂解3次，12000r/min离心30min，按照bca蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，取20μg蛋白经sds-page凝胶电泳分离后，转移至pvdf膜5％脱脂牛奶封闭2h后，孵育一抗(1:500)4℃过夜。0.1％tbst洗涤3次，每次5min；加入用0.1％tbst稀释的二抗(1:1000稀释)，室温孵育1h。0.1％tbst洗5次，每次5min。以ecl化学发光法检测蛋白印迹，并进行曝光、显影和定影。数码相机拍照，imagej2x软件进行分析，以bmp-2或vegf-165蛋白与β-actin蛋白的灰度值比值表示蛋白表达水平。蛋白表达水平＝bmp-2或vegf-165蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。4、alp活性检测hbmscs以5×104/ml的密度接种于96孔板，24h待其铺满孔底后，对照组及给药组使用对应的培养基诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后弃培养液，采用alp试剂盒测定细胞的alp活性，酶联免疫检测仪测定420nm处吸光度(a)值，以a值表示alp活性。5、统计学方法使用spss20.0软件对各组数据比较进行成组设计的f检验，所有参数均用均值±标准差表示，p<0.05为差异有显着性意义。三、实验结果1、待测化合物1～3对hbmscs中bmp-2蛋白表达水平的影响westernblotting检测结果如图2所示。从图2可见，待测化合物1、2、3可以显著提高hbmscs中bmp-2蛋白表达水平。2、待测化合物4～6对hbmscs中vegf-165蛋白表达水平的影响westernblotting检测结果如图3所示。从图3可见，待测化合物4、5可以显著提高hbmscs中vegf-165蛋白表达水平，而待测化合物6作用不明显。3、各化合物对hbmscs中alp活性的影响测定结果如表1和图4所示。结果可见，待测化合物1～5可以显著提高hbmscs中alp活性，而待测化合物6作用不明显。表1各组alp活性检测结果(a值)a值(均值±标准差)对照组8.9±0.2待测化合物1给药组16.2±0.1待测化合物2给药组15.7±0.2待测化合物3给药组16.4±0.2待测化合物4给药组17.8±0.1待测化合物5给药组17.5±0.2待测化合物6给药组9.1±0.2碱性磷酸酶(alp)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，alp的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。alp活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，alp活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故alp的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。由此可见，待测化合物1～3通过激活hbmscs中bmp-2蛋白表达促进hbmscs成骨分化，待测化合物4、5通过激活hbmscs中vegf-165蛋白表达促进hbmscs成骨分化。当前第1页12