抗PDPN蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及肿瘤学和医学领域，具体涉及可特异结合pdpn蛋白的单克隆抗体oti3h5、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于肿瘤来源鉴定的方法和用途。

背景技术

平足蛋白(podoplanin，pdpn)最早发现表达在淋巴管，是淋巴管内皮的特异性标志物，在人类各种肿瘤细胞的表面广泛表达，其表达与和肿瘤的恶性程度以及预后相关。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对pdpn蛋白的单克隆抗体对ihc检测pdpn表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的pdpn蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测pdpn蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为cgmccno.15592。

本发明还提供了一种特异性结合pdpn蛋白的单克隆抗体oti3h5，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据pdpnorf核苷酸序列(pdpnorf核苷酸序列如seqidno.1所示，714bp；pdpn氨基酸序列如seqidno.2所示)

设计引物pcr扩增pdpnorf第67bp位到第393bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pet23a-n-his，构建pdpn氨基酸序列第23位到第131位的重组表达质粒pet23a-rpdpn；上游扩增引物序列，seqidno.3:cacgcgatcgcggctcgggcaccctccct下游扩增引物序列seqidno.4:accgacgcgtctaggttcctggagtcaccac

(2)pdpn重组蛋白的表达与纯化：将pdpn重组表达质粒转化e.coli细胞，裂解离心获得上清，镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的pdpn重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的pdpn重组蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗pdpn特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为oti3h5，亚型鉴定为igg2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得pdpn单克隆抗体oti3h5。分别通过westernblot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体oti3h5在制备用于检测pdpn蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体oti3h5，可检测组织细胞中pdpn的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与pdpn的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于淋巴瘤组织。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cgmccno.15592)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体oti3h5。本发明还提供了单克隆抗体oti3h5在制备用于检测pdpn蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体oti3h5的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体oti3h5在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与pdpn蛋白特异性结合，真实反映肿瘤细胞内pdpn蛋白表达水平，可应用于区分组织淋巴管内皮与血管内皮。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株oti3h5的分类命名为：pdpn鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2018年4月26日；

保藏编号：cgmccno.15592。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为orf区；

图2-4示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的正常肺、淋巴瘤、正常扁桃体组织免疫组化结果图(一抗为pdpn单克隆抗体oti3h5)；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、pdpn重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc224811(含pdpnorf714bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pet23a-n-his，建立pdpn重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、pdpn重组蛋白的表达与纯化

1、转化e.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒dna轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗lb培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至od值达到0.4～0.6时加入iptg(终浓度1mm)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-his抗体做wb鉴定。

3、镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后进行sds-page鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并加入10％甘油，纯化后的重组pdpn蛋白用sds-page鉴定。

实施例3、pdpn单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的pdpn蛋白片段用于对balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的pdpn抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用pdpn纯化重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为oti3h5。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株oti3h5产生的单抗为igg2a，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、wb检测、分装、冻存在-20℃。

实施例4、单克隆抗体oti3h5为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的人淋巴结组织与人扁桃体组织块进行石蜡包埋，使用finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入pdpn单抗(oti3h5)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlogno.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图2-4。

(2)、实验结果：

由图2～4结果可见，在正常的肺、扁桃体与淋巴瘤的淋巴管内皮中可见到特异性染色，且对血管内皮无交叉。结果与pdpn在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体oti3h5可用于免疫组织化学检测pdpn蛋白的水平。

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗pdpn蛋白单克隆抗体及其用途

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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