一株聚磷菌及其多聚磷酸盐激酶基因在污水除磷中的应用的制作方法

本发明属于环境微生物领域和基因工程领域，具体涉及一株聚磷菌Acinetobacter johnsonii SE63及其三个多聚磷酸盐激酶基因在污水除磷中的应用。

背景技术：

随着人类的活动，水体富营养化已成为全球性问题，许多研究发现导致富营养化的主要原因之一是富含磷的生活废水、农业废水、工业废水排放至水体中，(M,D,Hamilton D P.Nitrogen and phosphorus limitation of phytoplankton growth in New Zealand lakes:implications for eutrophication control.[J].Ecosystems,2010,13(7):966-977),因此，从水体中除去积聚的磷是防治水体富营养化的关键,污水处理目前主要使用化学除磷和生物除磷，强化生物除磷法(EBPR)利用聚磷菌(PAOs)在厌氧条件下水解胞内多聚磷酸盐(poly P)释放磷，在好氧条件下从污水中将过量磷聚集到胞内积累poly P的特性，最后将含有聚磷菌的富磷污泥分排出而使磷从污水中去除。其中增强型生物除磷系统由于其成本低效益高而被广泛应用。(Oehmen,A.,Carvalho,G.,Freitas,F.,Reis,M.A.M.,Assessing the abundance and activity of denitrifying polyphosphate accumulating organisms through molecular and chemical techniques.Water Sci.Technol[J].2010.61,2061–2068.)。聚磷菌是一类对磷超量吸收的细菌，不是单一的微生物而是由不同的微生物群落组成它们能将磷以多聚磷酸盐颗粒的形式存在于细胞内(Acevedo B,Oehmen A,Carvalho G,et al.Metabolic shift of polyphosphate-accumulating organisms with different levels of polyphosphate storage[J].Water Research,2012,46(6):1889-900)。

poly P的形成在聚磷微生物“超量吸磷”过程中起到至关重要的作用,科学家研究发现许多的生物体内都有poly P存在，poly P可作为生物的磷酸储备用于提供磷酸酐键(Brown,M.R.；Kornberg,A.Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species.P.Natl.Acad.Sci[J].USA 2004,101(46),16085-16087.；Brown,M.R.；Kornberg,A.The long and short of it–polyphosphate,PPK and bacterialsurvival.Trends Biochem.Sci[J].2008,33(6),284-290)。研究发现poly P的形成与多聚磷酸盐激酶(PPK 1)密切相关，在PPK 1的作用下，ATP末端的磷酸残基转移到poly P链上，并且这种催化是可逆的。(Akiyama,M.；Crooke,E.；Kornberg,A.The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli.393Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein.J.Biol.Chem.[J].1992,267(31),22556-22561；McGrath,J.W.；Quinn,J.P.Intracellular accumulation of polyphosphate by the yeast Candida humicola G-1in response to acid pH.Appl.Environ[J].Microb.2000,66(9))。2002年，Ishige K等从铜绿假单胞菌中发现另一种多聚磷酸盐激酶，这种酶既能催化GTP上的磷酸基团转移到poly P上，同时又可催化poly P生成GTP的酶PPK2(Ishige K，Zhang H，Komberg A.Polyphosphate kinase(PPK 2)，a potent，polyphosphate-driven generator of GTP[J].Proc NatlAcad Sci USA，2002，99(26):16684-16688)。

本申请发明人随机采集了东寨港红树林134份土壤样品，总共获得185株初筛菌株，有42株菌株的聚磷能力达到20％以上，其中Acinetobacter johnsonii SE63最高聚磷率可达到36.4％，通过对该菌株全基因组测序后，并从中鉴定出了2个ppk 1基因和1个ppk 2基因，经过在原核细菌中异源表达这些基因，证明这些基因能提高原核细菌的聚磷能力，为富营养化水体的快速、高效处理提供了有效的菌种资源和基因资源。

技术实现要素：

本发明提供一株聚磷菌Acinetobacter johnsonii SE63(保藏编号为CCTCC M 2017801，简称SE63)，及其基因组中的三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk44、ppk97、ppk2-07，其特征在于ppk44、ppk97、ppk2-07的DNA序列分别具有如SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3所示的核苷酸序列。

本发明中根据结合Acinetobacter johnsonii SE63的形态特征和生理生化特征，结合16S rRNA序列(GenBank:KU353552.1)进行鉴定，分析结果将其归类于不动杆菌属，为不动杆菌属中一个新菌株，命名为Acinetobacter johnsonii SE63，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017801，保藏日期为2017年12月15日。以下为Acinetobacter johnsonii SE63的详细描述

本发明中SE63菌株分离自海南东寨港红树林湿地土壤，在LB培养基和YG培养基上显淡黄色圆形菌落，光泽圆润，边缘整齐。经革兰氏染色，吕氏美兰染色和苏丹黑染色后，结果该菌为革兰氏阴性菌，菌体中有被染成深蓝色的异染粒(poly P)和被染成黑色类脂性颗粒(PHB)。扫描电镜观察结果菌体呈短杆状(或椭球形)，无鞭毛、菌毛、微荚膜等特殊的细胞结构，生理生化特征如表1

表1：SE63菌株生理生化鉴定(基于Biolog GenIII)

本发明的实施方案之一提供Acinetobacter johnsonii SE63应用于从污水中除磷的方法。

本发明的另一实施方案提供三个蛋白质的氨基酸序列，其特征在于所述氨基酸序列分别具有如SEQ NO 4、SEQ NO 5、SEQ NO 6所示的氨基酸序列；所述氨基酸序列依次由SEQ NO 1、SEQ NO 2和SEQ NO 3编码。

本发明的另一实施方案提供一种制备上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk44、ppk97、ppk2-07的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

以菌株Acinetobacter johnsonii SE63基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk44、ppk97、ppk2-07。

上述PCR使用的引物与限制性内切酶如表2：

表2：ppk1、ppk2基因引物序列信息表

本发明的另一实施方案提供以上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk44、ppk97、ppk2-07制备的工程菌ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL，及三个工程菌在污水除磷中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述三个新型多聚磷酸盐激酶基因ppk44、ppk97、ppk2-07在制备工程菌ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL中的应用。

本发明的大概方案如下：

本发明的菌株按照以下方法分离鉴定

海南东寨港红树林湿地土壤加入合成废水培养基中，加入玻璃珠，摇床震荡混匀，静置沉淀后，取混悬液稀释至一定梯度，涂布在YG培养基上培养分离，挑选菌落进行聚磷菌的BCIP蓝白斑筛选，初步鉴定染色法及其聚磷能力测定。结合细菌的形态特征和生理生化特征，16S rRNA序列和BIOLOG微生物鉴定系统对上述筛选的菌株进行菌种鉴定。

测量菌株的聚磷率，将分离菌株分别从平板上挑取单菌落，接种于5mLLB培养基中，于28℃下振荡培养过夜，该过程约12h；将过夜培养菌液按1％的比例转接于合成废水培养基中，28℃好氧培养16h后，取1.5mL菌液离心后分别取1mL的上清液、与未接菌的培养液和蒸馏水作为样品，使用钼锑抗分光光度法测量液体中的磷含量，结果Acinetobacter johnsonii SE63的聚磷率为36.4％。

进一步解析菌株Acinetobacter johnsonii SE63的除磷机制，采用Illumina Hiseq 2000测序技术完成高效聚磷菌株Acinetobacter johnsonii SE63的基因组扫描测序，构建300bp文库，利用SOAPdenovo v2.04拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果后，再运用Gap Closer v1.12软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。依据拼接序列的总长、scaffold的数量以及scaffold N50等技术指标，对多个Kmer的组装结果进行综合评定，最终SE63基因组测序分析获得了3543632个scaffolds，GC含量为42.12％。

利用Glimmer 3.02软件进行细菌的基因预测，将预测基因的蛋白序列分别与Nr、genes、string和GO数据库进行blastp比对(BLAST 2.2.28+)，鉴定菌株SE63含2个ppk1基因和1个ppk2基因，命名为ppk44(SEQ NO 1)、ppk97(SEQ NO 2)和ppk2-07(SEQ NO 3)，开放阅读框(ORF)大小分别为2082bp、2061bp和1419bp，分别编码693(SEQ NO 4)、686(SEQ NO 5)和472(SEQ NO 6)个氨基酸。

通过EditSaq软件和SOPMA在线工具预测分析蛋白质一、二级结构，结果如表3所示

表3：蛋白质一、二级结构预测

利用Acinetobacter johnsonii SE63基因组中发掘的ppk基因通过构建克隆菌株对基因加以验证，可以更好的了解ppk基因的聚磷效果，为污水除磷工程补充聚磷基因资源。以菌株Acinetobacter johnsonii SE63基因组为模板，利用PCR的方法获得完整的基因片段ppk44、ppk97、ppk2-07，将PCR产物、表达载体(pET30a)酶切后直接连接，构建亚克隆载体：pET30a-ppk44、pET30a-ppk97、pET30a-ppk2-07。将连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)中，共构建了3个ppk基因表达工程菌株，分别命名为：ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL。以空载pET-30a转入大肠杆菌株BL21(DE3)做为对照菌株，命名为CK-BL。

过快的表达蛋白不利于蛋白在细胞质内正确折叠，容易形成基本无生物活性的包涵体沉淀为了获得有生物活性的蛋白，不断摸索实验中条件，在10℃、0.1mM IPTG、10h培养条件下，在ppk44-BL、ppk97-BL的上清液中检测到相应大小的PPK蛋白，结果如图4所示。

将3个ppk基因表达工程菌株和对照菌株分别接种于合成废水培养基，37℃好养培养，加入IPTG诱导剂10h后采集菌液，测定表达菌株和对照菌株的菌液上清磷含量，并分别统计各菌株的去磷量和聚磷率，结果如表4。

表:4除磷能力测定(培养基磷含量0.889μg/mL)

结果这3个基因均能增强菌株的除磷率，其中导入ppk97-BL基因菌株约为对照菌株的6倍，能将培养基的磷浓度从0.889μg/mL降至0.301μg/mL，显著性的调高了菌株的除磷能力。表明相应的ppk基因在E.coli中过量表达，导致菌体积聚poly P，从而使培养基中大量的磷酸盐得到有效去除。

附图说明

图1是Acinetobacter johnsonii SE63菌体染色图

A:革兰氏染色(10×100)；B:苏丹黑染色(10×100)；C:吕氏美兰染色(10×100)

图2是Acinetobacter johnsonii SE63菌体的扫描电镜图

图3是琼脂糖凝胶电泳图

A:SE63总DNA；B:ppk基因PCR产物C:工程菌质粒酶切产物

图4是ppk基因表达蛋白SDS-PAGE电泳分析图

A:为表达于沉淀的样品；B:为表达于上清的样品

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

以下实施例中所用的酶，试剂盒及其他试剂均购自上海生物工程有限公司。

以下实施例中所用引物由上海生物工程有限公司代为合成。

实施例1：聚磷菌Acinetobacter johnsonii SE63的分离与鉴定

1.样品处理

取出于海南东寨港红树林采集的污泥，在无菌条件下各称取5g加入已灭菌的含玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中，振荡10min，直至淤泥全部打散。在无菌条件下，吸取1mL液体于小离心管中，梯度稀释至10-1、10-2，各取200μL涂布于YG固体培养基上，28℃倒置培养16-24h。从平板中挑出形态不同的菌落，在YG固体培养基的平板上进行点板，于28℃倒置培养12h。

2.BCIP蓝白斑筛选

分别在限磷平板和过磷平板上涂布100μL BCIP。待晾干后，将目标菌从YG平板上转接至限磷平板和过磷平板上，注意同一种菌的位置要一一对应，再分别倒置于28℃厌氧和好氧培养箱中，培养12h。

3.染色鉴定

1)革兰氏染色

在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开。涂片后在室温下自然干燥。将载玻片在火焰上方固定，放置待冷后染色。加草酸铵结晶紫一滴，约1min，水洗。滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。将载玻片上的水甩净，用95％酒精洗脱20-30s，立即用水冲净酒精。用番红液染1-2min，水洗。干燥后，置油镜观察。结果如图1-A

2)菌体厌氧培养后PHB鉴定

将在限磷和过磷的葡萄糖-MOPS培养基上都产生蓝斑的菌株接种到废水合成培养基上，厌氧培养24h。挑取细菌，按常规制成涂片。

苏丹黑染色法：用甲液染色10min，用水冲洗甲液，用滤纸将水吸干，用二甲苯冲洗涂片至无色素洗脱，再用乙液复染1-2min，水洗，吸干，备油镜镜检。类脂粒呈蓝黑色，菌体呈红色。结果如图1-B

3)菌体好氧培养后poly P鉴定

将在限磷和过磷的葡萄糖-MOPS培养基上都产生蓝斑的菌株接种到废水合成培养基上，连续厌氧好氧培养24h。挑取细菌，按常规制成涂片。

吕氏美兰染色法：按常规方法制片，滴加吕氏美蓝染液，染色5-10min，用水冲去染液，吸干，备油镜镜检。异染粒呈深蓝色，菌体其他部分呈浅蓝色。结果如图1-C

4.形态特征的鉴定

1)扫描电镜

用接种环挑取单菌落于5mL LB培养基中，28℃，200rpm培养12h后，4℃，12,000×g离心10min收集500μL菌液，用预冷的1mol/L NaCl洗涤菌体3次后，将菌体悬浮在500μL预冷的超纯水中；10μL菌液小心平铺在洁净的盖玻片上，然后4℃低温真空干燥；将有样品的盖玻片浸没在2.5％戊二醛固定液中，4℃避光固定24h；先后用30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％乙醇洗脱15min，再用无水乙醇脱水15min(重复二次)；在通风厨中，将样品浸入六甲基二硅胺烷(HMDS)中15min，重复两次；室温下，将样品放入通风厨中进行空气干燥60min，用剪刀剪裁盖玻片，将适合的样品贴在铜板上；镀膜：在溅射仪中进行金属镀膜，镀金厚度约20-30nm；在扫描电子显微镜下，选取适宜的放大倍数观察样品，并拍照，结果如图2。

5.Biolog鉴定

将获得的纯培养菌种接种至BUG培养基上，28℃培养12h；使用未接种的含有IF-A接种液的干净接种管(擦去管壁污垢及指纹)调整浊度仪空白，将浊度仪透光度指针调至100％。用无菌棉签沾取接种物，使目标细胞浓度应为90-98％T；将菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中，按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入GenⅢ微孔板的所有孔中，盖好微孔板的盖子；将微孔板放入培养箱中培养3-36小时。培养温度28℃，每隔8h利用Biolog鉴定系统读取数据，直至出现稳定的测试结果，结果如表1。

7.基因组DNA提取

使用微生物基因组DNA快速抽提试剂盒进行提取，并通过1.0％琼脂糖电泳检测,结果如图3-A所示。

8.16S rRNA的PCR扩增与鉴定

选用细菌16S rDNA序列通用引物F27/R1492进行PCR扩增，F27引物序列为：5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R1492引物序列为：5’–GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

PCR反应体系组成：PCR mix buffer 12.5μL，3’Primer 0.5μL，5’Primer 0.5μL，DNA模版0.5μL，ddH2O 11μL，总体积为25μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min；最后72℃温育10min，4℃保存。

取5μL DNA产物用1.0％琼脂糖胶电泳检测。

经BLAST软件与GenBank中已登录的16S rDNA序列进行比对，菌株SE63与Acinetobacter tandoii的同源性为96％，很可能是一个新种。

实施例2：用SE63的ppk基因构建除磷工程菌

1.通过对SE63基因组进行提取，根据ppk基因序列设计扩增基因全序列的引物。PCR扩增反应体系：12.5μL PCR mix buffer、11μL ddH2O、1μL混合引物(F27/R1492)、0.5μL DNA模板，体系总体积25μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min(30个循环)；72℃终延伸10min，4℃低温保存，退火温度可根据引物Tm值进行调整。PCR产物通过1％琼脂糖电泳胶检验，结果如图3-B所示。

2.重组子构建

(1)PCR产物、pET30a质粒的双酶切

将纯化后的PCR产物、pET30a质粒各取20μL分别装到EP管当中，分别加入10μL 10×R buffer、5μL NdeⅠ、5μLXhoⅠ、60μL ddH2O，于37℃酶切反应4h。将酶切产物使用PCR产物纯化试剂盒纯化处理，并通过1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物质量。

(2)大肠杆菌BL21(DE3)熱激转化感受态细胞的制备

感受态细胞制备方法参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.3版.北京：科学出版社，2002.)

(3)ppk基因表达工程菌及其对照菌株的构建

1)ppk基因与pET-30a载体的连接

PCR产物与表达载体连接反应体系：6μL PCR酶切产物、2μL pET30a质粒酶切产物、1μL Ligase Buffer、1μL T4DNA Ligase。于4℃放置过夜。

2)将得到的10μL连接产物，加入150μL的感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；

3)42℃热激转化1.5min，将含有ppk基因的载体一转入大肠杆菌中,在含有35μg/ml卡那霉素的LB平板上进行筛选,从中挑取菌株进行质粒提取，双酶切验证，验证结果见图3-C，将验证正确的阳性重组质粒菌株送往上海生工公司测序，通过上述验证鉴插入基因正确的菌株即为阳性重组子，本实施例中共构建了3个用于表达ppk基因的工程菌株，分别命名为ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL。

以上述同样的方法，用空载pET-30a转入大肠杆菌株BL21(DE3)构建对照菌株，命名为CK-BL。

实施例3：PPK蛋白的表达

1.IPTG诱导表达

活化正确载有目的基因克隆菌株，挑取单个菌落转接到5mL含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇床培养16h；按1:100的比例转接到5mL含有Kan抗生素的LB培养基中，培养至OD600值为0.4(约2h)。诱导条件为：加入1μL 0.5M IPTG，10℃摇床培养4h。(CK-BL作为空载对照，诱导条件同上)

2.超声波破碎细胞

10000r/min离心2min收集约2mL体积的菌液；用1mL 1M NaCl洗涤、离心2次；加入0.7mL ddH2O，吹打混匀，使之形成均匀的悬浮菌体；冰浴超声波破碎，超声波条件为：20KHz、25％振幅、破碎10s间歇10s、破碎时间3min。

13000r/min离心5min，收集沉淀和上清，沉淀使用50～100倍体积的ddH2O悬浮；上清和沉淀的悬浮液作为待测样品。

3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法步骤参照《分子克隆实验指南》

将20μL待测样品、空载对照分别与5μL 5×Roading Buffer混匀，沸水中煮5min，12000r/min离心5min，作为供试的蛋白质电泳样品，结果如图4所示。

实施例4：聚磷率的测定

1.合成废水培养基配方如下：

0.89g三水合醋酸钠、0.01g酵母粉、0.1g蛋白胨、0.05g K2HPO4、0.028g CaCl2、0.05g NaCl、0.075g NaHCO3、0.075g MgSO4、1L ddH2O

2.测定总磷使用钼锑抗分光光度法，具体方法如下：

配制磷标准使用溶液。分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2、3、4、5mL磷标准溶液于带盖试管中，加入蒸馏水至总体积为10mL，加入1.6mL过硫酸钾，混匀，120℃消解30min。冷却后，加入0.4mL抗坏血酸溶液，混匀；30s后，加入0.8mL钼酸盐混合液，混匀，室温静置15min。700nm波长下，以1号为空白参照，测定其吸光度，并绘制标准曲线。

3.菌株SE63的聚磷率：使用平板过夜培养活化菌种，从平板上挑取单菌落，接种于5mLLB培养基中，于28℃下振荡培养过夜，该过程约12h；将过夜培养菌液按1％的比例转接于200mL合成废水培养基中，28℃好氧培养16h后，取1.5mL菌液置于已灭菌的离心管中，4℃，6000rpm离心15min。分别取1mL离心后的上清液、未接菌的培养液、蒸馏水置于带盖试管中,使用钼锑抗分光光度法测量液体中的磷含量，计算SE63的聚磷率，结果为36.4％

4.ppk基因的聚磷活性：将菌株ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL和CK-BL于平板上活化后分别接种于合成废水培养基，37℃好氧培养，加入IPTG诱导剂10h后采集菌液，取1.5mL菌液置于已灭菌的离心管中，4℃，6000rpm离心15min。分别取1mL离心后的上清液、未接菌的培养液、蒸馏水置于带盖试管中，加入蒸馏水至总体积为10mL，加入1.6mL过硫酸钾，混匀，120℃消解30min。冷却后，加入0.4mL抗坏血酸溶液，混匀；30s后，加入0.8mL钼酸盐混合液，混匀，室温静置15min。700nm波长下，以蒸馏水管为空白参照，分别测定其吸光度。测定表达菌株和对照菌株的菌液上清磷含量，并分别统计各菌株的除磷率，统计结果如表4所示。由表4可知，ppk44-BL、ppk97-BL、ppk2-07-BL除磷率分别是对照菌株的3.96、6.76、1.5倍，其中ppk97-BL除磷率可提升至70％。活性测定结果表明Acinetobacter johnsonii SE63的ppk基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株体内表达，能使菌体累积poly P，提高细菌的聚磷能力，从而使培养液中的磷酸盐得到有效移除。

序列表

<110> 海南师范大学

<120> 一株聚磷菌及其多聚磷酸盐激酶基因在污水除磷中的应用

<130> 1

<141> 2018-09-05

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2082

<212> DNA

<213> Acinetobacter johnsonii

<400> 1

atgaatacgg cggcacagac tcctttagag ccagttgaat atacttataa tgatcgattt 60

attaatcgtg aactttctat tttagatttc catttacgtg ttcttgagca agctgtcgat 120

ccgctgcatc cactcttgga gcgcatgaac ttcctgctta ttttctcacg taatttagat 180

gagttttttg aaattcgtgt cgcaggcatg atggaacagc ttgatttggg caatgaaagt 240

cacaccccag atggtttgac gccgaaacaa gtgttggaac agatttcgca aactgcccat 300

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gaagatatct gtttcttacg ccgtggagag ttgacgccag cccaatcttc ttgggtgaaa 420

aaatacttcc aagaacaggt tgcacctgtc ttaactccaa ttagcctcga ccctgcacat 480

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gcttttggtc gtcagattga cttggccgtt gtacctgcac cacgctcatt gcctcgtgtg 600

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aactgtccga aacatattta tgattatttg ctgaatgagt ttgatcttga agaagagcaa 900

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ggtttactca cgactgataa ggaactctgt gaagatgtgc atcgcatttt ccaagagtta 1500

acgggcatgg gtaaaatggc taagttgaaa aagctgttgc atgcgccatt taccttgcac 1560

gcacaactcc ttaatttcat tgatgatgag attgccaatg ccaaagcagg caaacctgcg 1620

caaatcattg tcaaagtgaa tgcgctgact gaattgcaat taattaataa actttatgaa 1680

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ggtttgccgg gtctgtctga aaatattcgt gtacgttcaa ttgtcggtcg tttcttggaa 1800

catacccgcg tttattattt tagtaataat ggcaatccga atgtgtactg ctcaagtgca 1860

gactggatgg atcgtaactt atttaatcga gttgaagcgt gcttcccaat tgaagatcca 1920

gcactgaaaa agcggattta tcagcaaggt ttatttaatt atttaaaaga taatcaacag 1980

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<210> 2

<211> 2061

<212> DNA

<213> Acinetobacter johnsonii

<400> 2

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accttgctgc atgcaccgtt taccttgcat gctgaattac tcaagctgat tgagcaggaa 1560

atagaatatg cgcaagcagg tgaaattgcg cggattatca ttaaggtcaa tgccctgact 1620

gaaccgcagt tgattgctgc gctgtatcga gcgtcacagg ctggggtaaa gattgacctg 1680

attatccgtt ctatttgttg cttagtgccg caactggcag ggctgtccga taatattcgg 1740

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<210> 3

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<212> DNA

<213> Acinetobacter johnsonii

<400> 3

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accgattatg ccccgtggta tatcgttgcc aacgatgata aatatggggc gaggctggaa 1380

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<210> 4

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<212> PRT

<213> Acinetobacter johnsonii

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<212> PRT

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<213> Acinetobacter johnsonii

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