来源于新陆早24和鲁棉研28的纤维长度主效基因的SNP分子标记的制作方法

本发明属于生物技术应用领域，涉及到陆地棉纤维长度主效qtls及其连锁的snp(singlenecleotidepolymorphism，单核苷酸多态性)及ssr(simplesequencerepeat，简单重复序列)分子标记。

背景技术：

棉花是世界性的重要经济作物，棉纤维是重要的纺织工业原料，在80多个国家广泛种植(jamshedetal.,2016)。也是第二个重要的食用油和蛋白的来源的作物(zhangetal.,2014b)。棉属(gossypium)中有四个栽培种(g.herbaceum,g.arboreum,g.hirsutum和g.barbadense)用于棉花纤维生产(lietal.,2014,2015；wendeletal,2015；zhangetal.,2015)，其中四倍体的陆地棉(gossypiumg.hirsutuml)和海岛棉(g.barbadense)是主要的栽培物种。虽然陆地棉纤维品质、抗病性均表现一般，但其具有产量潜力高、适应性广等特点，仍使其种植面积占总棉花种植面积的95％以上(cai等，2014；chen等，2007)。随着人们生活水平不断提高和纺织技术的不断改进，不仅对产量的要求越来越高，而且对棉花纤维的品质也提出了多样化的要求，如高强纤维、天然彩色棉等。而棉花的产量及纤维品质性状均为数量性状，受多基因控制(said等，2013)，且这些性状间多呈负相关关系(shen等，2007；wang等，2015)。因此通过传统育种方法很难对这些性进行同步改良，需要投入大量的时间及劳动成本(shen等，2005；lacape等，2009；jamshed等，2016；zhang等，2016)。应用基因组学研究的迅猛发展为改进育种效率提供了有效的工具，其中最典型的例子就是分子标记辅助选择和通过与目标基因紧密连锁的分子标记进行基因组选择或分子设计育种。

纤维长度是棉纤维的重要品质性状之一。到目前为止，一系列的陆地棉种内分离群体已建立起来，目标针对棉花的多种性状包括纤维品质((fang等，2014；li等，2016；liu等，2017；jamshed等，2016；shen等，2005；sun等，2012a；tan等，2015；wang等，2015a；xu等，2014；yang等，2016；zhang等，2017b))、产量(liu等，2017；wang等，2015a；xia等，2014；zhang等，2016)、耐旱(levi等，2011)、抗病(jiang等，2009；palanga等，2017；ulloa等，2013；zhao等，2014)、早熟性(li等，2012；2013；stiller等，2004)、株型(qi等，2017；tang等，2014)等。shen等(2005)定位到了11个纤维长度qtl，可以解释表型变异的5.2-20.2％。sun等(2012)利用重组自交系群体定位到了40个纤维品质的qtl，可解释表型变异的1.60-27.86％，其中一个纤维长度的qtl。jamshed等(2016)利用陆地棉重组自交系群体在11条染色体上定位到了31个纤维长度的qtl，其中14个qtl为多环境稳定的qtl，可解释表型变异的5.8-23.6％。zhang等(2015)在25号染色体上定位到了2个多环境稳定的纤维长度的qtl，可解释表型变异的6.21-11.23％。zhai等(2016)定位到了8个与纤维长度相关的qtl，可解释表型变异的1.93-19.68％。

虽然成功定位到了相应的qtl，但成功应用于分子标记辅助选择的qtl和标记却很少有报道。其原因在于：1)前期定位的qtl多是基于ssr标记构建的连锁遗传图谱，ssr的相对较低的多态性使得通过其得到的图谱的饱和度和覆盖度均较低，所定位的qtl区间大，因而影响了其在标记辅助选择中的应用。另一个原因是用某个群体定位到的qtl，在另外一个群体中可能检测不到，这种现象也会影响到这些qtl及其连锁标记的应用(wei等，2014；guo等，2015；ma等，2015；zhang等，2016)。

最近，有两套snp芯片研究制成功(cottonsnp63k和cottonsnp80k)(hulse-kemp等，2015；cai等，2017)，均在棉花研究中得以应用。其中cottonsnp80k芯片是基于陆地棉标准系tm-1的基因组数据，对100个陆地棉重测序后开发出的芯片数据，因而可能对陆地棉的相关研究更具实际应用价值(cai等，2017)。本项发明中进行qtl定位的图谱总图距2477.99cm，包含有122个ssr标记和4729个snp标记，平均标记间的距离为0.51cm。与以前图谱相比，图谱的饱和度得到较大提高，更能有效地进行qtl定位(liu等，2015；li等，2016；zhang等，2016；2017；tan等，2018)。

在传统育种方法中提高陆地棉品种的纤维品质的手段，主要是在杂种后代的选育过程中根据纤维品质的表型进行选择，且纤维品质的鉴定需要在收获后在室内通过仪器进行检测鉴定。这就要求在生育期单株选择中，要选入足够大的群体，以对纤维品质进行室内仪器检测鉴定，然后再进行单株选择。而且在每个选择世代都要对纤维品质进行室内仪器检测鉴定。这就需要投入较高的劳动成本、时间成本和资金成本。而且棉花的纤维品质性状是多基因控制的数量性状，其表型受环境影响较大，会极大地影响选择的效果和效率。分子标记技术可以在较短的时间内进行大量的个体或家系检测，由于分子标记的基因型是可以识别的，如果目标性状与某个分子标记紧密连锁，就可以利用分子标记对目标性状进行选择，可以大大提高检测及选择的效率。

技术实现要素：

本发明是通过陆地棉重组自交系群体的遗传连锁图谱和该群体的表型鉴定，获得的来自陆地棉种内的与纤维长度紧密连锁的snp分子标记，利用这些与纤维长度紧密连锁的分子标记，可以在育种过程中的分离世代在dna水平上对纤维长度进行直接选择而无需对其通过纤维长度的仪器检测鉴定的表型进行选择，从而提高选择的效率和效果。本发明人在利用新陆早24和鲁棉研28构建重组自交系群体及其大田鉴定过程中，发现该重组自交系群体在大田自然条件下，分离产生一系列不同纤维品质的重组自交系且这些自交系的纤维长度的表型表现较为稳定。本发明人通过构建该分离群体的遗传图谱及其相关表型鉴定，定位出了6个多环境稳定的纤维长度的qtls。

本发明提供的技术方案是：与陆地棉纤维长度主效基因位点qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1紧密连锁的分子标记，其中这些纤维长度主效基因位点qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1分别依次分别位于陆地棉第6、11、16、17、19和26号染色体上。与qfl-chr06-2连锁的标记有：tm18200、tm18194、tm18195、tm18184、tm18161、tm18157、tm18153、tm18151、tm18152、tm18141、tm18320、tm18322、tm18316、tm18317和tm18321；与qfl-chr11-1连锁的标记有：tm39956、tm39960、tm39959、tm39958和tm39953；与qfl-chr16-1连锁的标记有：tm66757；与qfl-chr17-1连锁的标记有：tm53503、tm53502、tm53501、tm53504、tm53571和tm53577；与qfl-chr19-1连锁的标记有：tm57055、tm57058、tm57057、tm57069和tm57082；与qfl-chr26-1连锁的标记有：tm77259和tm77261。

其中这7个棉花纤维长度主效基因位点的含义为：qfl-chr06-2表明在陆地棉6号染色体上第一定位到的第2个位点为主效基因位点，余类推；与主效基因位点紧密连锁的标记的含义为：以tm18200为例，表明其为snp标记，在棉花80ksnp芯片中编号为tm18200，tm表明该标记开发来源于陆地棉标准系tm-1的测序数据。

本发明所述的与陆地棉纤维长度主效基因位点连锁的分子标记，是通过以下方法获得的：

1)利用大面积推广的具有高产潜力的陆地棉栽培品种鲁棉研28和优质陆地棉品种新陆早24为亲本构建含有231个自交系的重组自交系群体；

2)利用棉花80ksnp芯片，对该重组自交系群体及其亲本进行基因型分析，获得了4729个在两个亲本之间和重组自交系群体中均具有多态性的snp标记。同时选用同样在两个亲本之间和重组自交系群体中均具有多态性的ssr标记122个，构建了共包含有4851个标记的遗传连锁图谱；

3)在大田生产条件下，在中国农业科学院棉花研究所(河南安阳)试验田(2013，2014，2015，2016)、在山东棉花中心临清试验站(2013，2014)、中国农业大学曲周试验站(2013)、中国农业科学院棉花研究所新疆库尔勒试验基地(2014)和中国农业科学院棉花研究所新疆阿拉尔试验基地(2015)等9个环境条件下，对该重组自交系群体的纤维品质性状的表型进行了多环境的调查鉴定。

4)根据上述该重组自交系群体的纤维品质表型的鉴定结果，利用上述含有4851个标记的遗传连锁图谱，进行多环境下的纤维长度主效基因位点/qtl的定位。共定位出6个多环境稳定的纤维长度主效qtl。即：qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1。其中，qfl-chr06-2、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1的纤维长度增效基因来源于新陆早24；qfl-chr11-1的纤维长度增效基因来源于鲁棉研28。与qfl-chr06-2连锁的标记有：tm18200、tm18194、tm18195、tm18184、tm18161、tm18157、tm18153、tm18151、tm18152、tm18141、tm18320、tm18322、tm18316、tm18317和tm18321；与qfl-chr11-1连锁的标记有：tm39956、tm39960、tm39959、tm39958和tm39953；与qfl-chr16-1连锁的标记有：tm66757；与qfl-chr17-1连锁的标记有：tm53503、tm53502、tm53501、tm53504、tm53571和tm53577；与qfl-chr19-1连锁的标记有：tm57055、tm57058、tm57057、tm57069和tm57082；与qfl-chr26-1连锁的标记有：tm77259和tm77261。

所述的与陆地棉纤维长度主效基因位点qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1相关的分子标记，其特征序列、在物理图谱中的位置以及snp突变位点如表1所示：

表1：qfl在遗传图谱和物理图谱上的位置、snp侧翼序列(中括号内的碱基为snp位点)及亲本基因型

本发明的具有如下优点：

本发明所涉及的与陆地棉纤维长度主效基因有关的6个位点(qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1)。其中，qfl-chr06-2、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1的纤维长度增效基因来源于新陆早24；qfl-chr11-1的纤维长度增效基因来源于鲁棉研28。该6个主效基因位点均表现为多环境稳定效应，可用于陆地棉纤维长度的分子标记辅助选择。qfl-chr06-2解释的表型变异为6.35％–6.62％，加性效应为0.30–0.41(mm)之间；qfl-chr11-1解释的表型变异为5.15％–9.41％，加性效应为0.23–0.32(mm)之间；qfl-chr16-1解释的表型变异为5.24–6.23％，加性效应为0.27(mm)；qfl-chr17-1解释的表型变异为3.95％–4.79％，加性效应为0.22–0.28(mm)之间；qfl-chr19-1解释的表型变异为4.65％–5.07％，加性效应为0.23–0.28(mm)之间；qfl-chr26-1解释的表型变异为4.56％–5.59％，加性效应为0.26–0.30(mm)之间。

本发明通过这些分子标记在重组自交系群体中的基因型构建其遗传连锁图谱，并在多环境条件下对该群体的纤维长度表现型进行鉴定。将遗传图谱的基因型与表现型结合分析得到了与纤维长度相关的分子标记。利用这些与纤维长度紧密连锁的分子标记进行辅助选择可以有效地、有针对性地对陆地棉品种进行纤维长度改良并提高陆地棉品质育种效率。

附图说明

图1为本发明重组自交系群体部分分子标记连锁图谱及主效基因位点/qtl。这些主效基因位点分别位于6号、11号、16号、17号、19号和26号染色体上。

其中，与qfl-chr06-2连锁的标记有：tm18200、tm18194、tm18195、tm18184、tm18161、tm18157、tm18153、tm18151、tm18152、tm18141、tm18320、tm18322、tm18316、tm18317和tm18321；与qfl-chr11-1连锁的标记有：tm39956、tm39960、tm39959、tm39958和tm39953；与qfl-chr16-1连锁的标记有：tm66757；与qfl-chr17-1连锁的标记有：tm53503、tm53502、tm53501、tm53504、tm53571和tm53577；与qfl-chr19-1连锁的标记有：tm57055、tm57058、tm57057、tm57069和tm57082；与qfl-chr26-1连锁的标记有：tm77259和tm77261。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，与陆地棉纤维长度主效基因连锁的分子标记是通过以下方法得出的：

(1)用于鉴定陆地棉纤维长度以及用于构建遗传连锁图谱的重组自交系的培育方法及过程：以山东棉花研究中心培育的大面积推广的具有高产潜力的陆地棉栽培品种鲁棉研28为母本，新疆康地公司培育的优质品种新陆早24为父本，在2008年夏天于中国农业科学院棉花研究所(河南安阳)试验农场配置杂交组合，2008年底在海南种植f1。2009年春在安阳种植238个f2单株，自交后获得f2:3家系。选取231个f2:3家系，并结合冬季海南加代繁殖，每世代均自交，家系内每单株各选一个自交铃，混收直至f2:6，在f2:6家系随机选择一个单株，再自交2代获得f6:8世代群体。将f6:8世代及以后的群体作为重组自交系(ril)群体。

(2)取重组自交系群体(f6：8)的叶片样本，采用ctab法提取231个家系和两亲新陆早24和鲁棉研28的dna。

(3)利用棉花80ksnp芯片，对该自交系群体及其亲本进行基因型分析，获得了4729个在两个亲本之间和重组自交系群体中均具有多态性的snp标记。同时选用同样在两个亲本之间和重组自交系群体中均具有多态性的ssr标记122个。本发明中，与陆地棉纤维长度主效基因位点qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1相关的分子标记，其特征序列、在物理图谱中的位置以及snp突变位点如表1所示。

表1：qfl在遗传图谱和物理图谱上的位置、snp侧翼序列(其中，中括号内的碱基为snp位点)及亲本基因型

(4)利用highmap作图软件(liuetal.,2014)构建遗传连锁图谱，采用kosambi函数(kosambi,1943)，对图距进行估算。构建了含有4851个标记位点(包括4729个snp标记和122个ssr标记)遗传连锁图谱，共构建了26个连锁群，全部定位到陆地棉26条染色体上，覆盖陆地棉基因组2477.99cm，平均标记间距离为0.51cm。其中a亚组含3300个标记，覆盖了基因组1474.63cm，平均标记间距离为0.45cm。d亚组含1551个分子标记，覆盖了基因组1003.36cm。平均标记间距离为0.65cm。本发明重组自交系群体部分分子标记连锁图谱及主效基因位点/qtl请参见图1。

(5)结合重组自交系群体纤维品质的鉴定结果，利用windowsqtlcartographer2.5进行qtls定位，进行1000次排序测验，筛选与多环境下稳定表达的纤维长度主效qtl，筛选到6个主效纤维长度qtls，即：qfl-chr06-2、qfl-chr11-1、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1。其中，qfl-chr06-2、qfl-chr16-1、qfl-chr17-1、qfl-chr19-1和qfl-chr26-1的纤维长度增效基因来源于新陆早24；qfl-chr11-1的纤维长度增效基因来源于鲁棉研28。与qfl-chr06-2连锁的标记有：tm18200、tm18194、tm18195、tm18184、tm18161、tm18157、tm18153、tm18151、tm18152、tm18141、tm18320、tm18322、tm18316、tm18317和tm18321；与qfl-chr11-1连锁的标记有：tm39956、tm39960、tm39959、tm39958和tm39953；与qfl-chr16-1连锁的标记有：tm66757；与qfl-chr17-1连锁的标记有：tm53503、tm53502、tm53501、tm53504、tm53571和tm53577；与qfl-chr19-1连锁的标记有：tm57055、tm57058、tm57057、tm57069和tm57082；与qfl-chr26-1连锁的标记有：tm77259和tm77261。该6个主效基因位点均表现为多环境稳定效应，可用于陆地棉纤维长度的分子标记辅助选择。qfl-chr06-2解释的表型变异为6.35％–6.62％，加性效应为0.30–0.41(mm)之间；qfl-chr11-1解释的表型变异为5.15％–9.41％，加性效应为0.23–0.32(mm)之间；qfl-chr16-1解释的表型变异为5.24–6.23％，加性效应为0.27(mm)；qfl-chr17-1解释的表型变异为3.95％–4.79％，加性效应为0.22–0.28(mm)之间；qfl-chr19-1解释的表型变异为4.65％–5.07％，加性效应为0.23–0.28(mm)之间；qfl-chr26-1解释的表型变异为4.56％–5.59％，加性效应为0.26–0.30(mm)之间。