一种检测病原体种类分布和耐药性的方法和装置与流程

本发明涉及物理领域，尤其涉及一种光学检测技术，特别是一种检测病原体种类分布和耐药性的方法和装置。

背景技术：

目前临床感染医学诊疗中，因无法快速确定病原体的种类和抗药性，医生常根据经验普遍使用广谱抗生素和联合使用抗生素，往往疗效不确定，造成抗生素滥用问题。而近年抗生素滥用问题越见严重，因滥用抗生素产生的顽固性耐药细菌经以肆虐全球。最新统计数据指出，耐药菌每年造成全球70万人死亡，多集中在发展中国家，按数字推断，到了2050年，全球死亡个案可高达1000万人。

由于每个病原体的个体数量少，不利于进行生理生化和免疫学的鉴定，需要经过体外培养使其数目达到一定程度后，再进行鉴定。传统的病原体检测方法大多只针对特定的、可培养的细菌，并且耗时较长。对于可培养细菌约需2天的检测时间，对于生长较慢的菌种需要7天左右，对于实验室无法培养的细菌则无能为力。而且传统方法难以区分某一传染是由一个还是多个菌病原体所引起的。

现在一些新的病原体分子鉴定方法逐渐发展起来，这些方法不依赖于活的培养物，而是基于高通量基因测序数据的分析、拉曼光谱检测和生物分子质谱分析来鉴定病原体。

基因测序数据的分析是基于细菌产生耐药性的基因突变或获得耐药基因，通过针对性检测基因突变或相关耐药基因从而确定细菌耐药性。

美国专利第4，847，198号公开了一种利用uv激发拉曼光谱法鉴定微生物的方法。根据4，847，198专利，通过紫外光谱范围内的单波长接触细菌悬浮液。部分所用的光能被吸收而部分光能被发射。发射的光能，共振增强拉曼散射，作为反向散射能量进行测定。对该能量进行处理以产生细菌的特征性光谱。

美国专利第6，177，266号公开了一种采用通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof-mq分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株的特异性生物标记对细菌进行化学分类学分类的方法。但是同样的细菌由于培养条件或化学提取方法的不同会产生不同的质谱，从而导致分析结果的误差。即使严格控制以上条件，质谱法仍不能完全准确的测定出细菌种类。另外，与传统药敏试验相比，maldi-tofms技术只能区分敏感株和耐药株，无法获得准确的mic值，且该技术判断耐药株和敏感株需要先利用已知敏感株和耐药株建模。

目前大多临床诊断并不开展病原体精细化检测，尤其在诊治一些严重感染如败血症时，不能够快速精准用药往往造成生命危险。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测病原体种类分布和耐药性的方法，所述的这种检测病原体种类分布和耐药性的方法要解决现有技术中测病原体的种类和耐药性的方法复杂，效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种检测病原体种类分布和耐药性的方法，包括如下步骤：

1)从已知包含或可能包含病原体细胞的体液中通过离心或者过滤获得病原体样品；

2)采用微量注射器将病原体样品和抗生素各取一定量，同时或分步滴入至少一个容器中，所述的容器的上端开口，所述的容器的底部具有平面四极金微电极阵列，在微电极上施加电压信号以产生非均匀电场，使病原体细胞形成介电泳定向运动，向容器底部中心聚集形成2个到1000个之间的病原体细胞聚集体；

3)通过激光扫描所述的病原体细胞聚集体并进行三维拉曼光谱成像，通过拉曼光谱的实时检测分析，进行病原体种类分布和耐药性检测。

进一步，所述的病原体细胞聚集体包含两种以上数目的病原体细胞，通过三维拉曼光谱扫描成像可以区分不同的病原体分布和耐药性情况；

进一步，所述的三维拉曼光谱扫描的分辨率小于10微米；

本发明还提供了实现上述方法的检测病原体种类分布和耐药性的装置，所述的装置包括至少一个容器，所述的容器的上端开口，所述的容器的底部设置有平面四极金微电极阵列，所述的平面四极金微电极阵列连接一个电压信号发生器，所述的电压信号发生器和一个电泳电极连接，所述的容器的上端设置有一个照明光源；还包括有一个ccd摄像头，在所述的ccd摄像头成像方向上依次设置有一个第一分束镜、物镜，所述的第一分束镜的下端设置有一个ccd摄像头，所述的第一分束镜、物镜、ccd摄像头、照明光源在一个中轴线上；所述的第一分束镜和所述的物镜的水平面呈45度的夹角；还包括有一个拉曼光谱激发光源，在所述的拉曼光谱激发光源发射激光照射样品的光路中，依次设置有一个准直透镜、第二分束镜、激光扫描装置，所述的激光扫描装置和一个光束整形系统连接，所述的激光扫描装置和一个光束整形系统设置在所述的第一分束镜的45度的光路上；还包括有一个光谱仪，在所述的光谱仪的吸收光的方向上依次设置有一个耦合透镜、滤光片、第二分束镜，所述的光谱仪、耦合透镜、滤光片设置在所述的第二分束镜的45度的光路上。

本发明的原理是：在平面四极金微电极阵列施加电压信号，在电压信号驱动下产生非均匀电场形成介电泳运动，从而实现利用介电电泳汇集病原体细胞形成一个细胞聚集体，然后采用三维拉曼光谱扫描对所述的病原体细胞聚集体进行三维拉曼光谱成像，通过这些拉曼光谱的实时观察与检测，可以分析不同药物对病原体细胞的刺激作用的拉曼光谱变化和病原体细胞种类分布情况，从而进行病原体种类分布和耐药性筛选。这是因为不同病原体细胞分子结构不同，每种病原体细胞有其独有的特征拉曼光谱，通过分析这些拉曼光谱就可以鉴定病原体细胞种类。另外，药物和病原体细胞发生生化作用后，病原体细胞分子结构会发生变化，立即在病原体的拉曼光谱上出現反应，而对药物有抗药性的病原体细胞並不会有分子结构的变化，病原体细胞光谱维持不变。从而可以快速的反应出病原体对施加的药物有无抗药性。同时还可以获得关于多少药物浓度可以完全抑制病原体生长，这是显著影响治疗成功的重要诊断参数，为高通量药物筛选和细胞药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明利用拉曼光谱确定细胞内部的特性，实时动态监测生物分子细胞发生的变化。研究疾病、药物或毒素的细胞反应；利用微流控技术和三维拉曼光谱扫描成像技术对病原体细胞进行分析，可在不进行样品预处理的情况下直接对待病原体细胞进行收集操控和拉曼光谱测量，从而可以最大限度地维持待测病原体细胞的生理活性。本发明具有极低样品消耗量、非侵入性等优点,使其在病原体细胞分析以及药物敏感性筛选等应用广泛。本发明结合了电泳微流控技术、三维拉曼光谱检测技术，可以利用一滴体液实现病原体快速诊断。它是直接针对病原体生物分子结构变化进行拉曼光谱检测鉴定，不依赖于病原体的繁殖，能够在一小时内完成病原体种类发布、耐药性、最低抑菌浓度（mic）的测定。指导医生参照病原体种类、药物敏感性和病人个体代谢差异开具处方，实现临床用药的精准性和安全性，这也正是精准医疗最核心的本质要求。

附图说明

图1是本发明的一种用于检测病原体种类分布和耐药性的装置的结构示意图。部件名称如下：

1：孔型容器；2：样品；3：病原体细胞聚集体；4：照明光源；5：电泳电极；6：电压信号发生器；7:物镜；8：第一分束镜；9：ccd摄像头；10：光束整形系统；11：激光扫描装置；12：拉曼光谱激发光源；13：准直透镜；14：第二分束镜；15：滤光片；16：耦合透镜；17：光谱仪。

图2是将本发明采用一种大肠杆菌和环丙沙星作用后的拉曼光谱图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，本发明提供了一种用于检测病原体种类分布和耐药性的装置，包括至少一个容器1，所述的容器1的上端开口，所述的容器1的底部设置有平面四极金微电极阵列，所述的四极金微电极连接一个电压信号发生器6，所述的电压信号发生器6和一个电泳电极5连接，所述的容器1的上端设置有一个照明光源4；

还包括有一个ccd摄像头9，在所述的ccd摄像头9成像方向上依次设置有一个第一分束镜8、物镜7，所述的第一分束镜8的下端设置有一个ccd摄像头9，所述的第一分束镜8、物镜7、ccd摄像头9、照明光源4在一个中轴线上；所述的第一分束镜8和所述的物镜7的水平面呈45度的夹角；

还包括有一个拉曼光谱激发光源12，在所述的拉曼光谱激发光源12发射激光照射样品的光路中，依次设置有一个准直透镜13、第二分束镜14、激光扫描装置11，所述的激光扫描装置11和一个光束整形系统10连接，所述的激光扫描装置11和一个光束整形系统10设置在所述的第一分束镜8的45度的光路上。

还包括有一个光谱仪17，在所述的光谱仪17的吸收光的方向上依次设置有一个耦合透镜16，滤光片15，第二分束镜14，所述的光谱仪17、耦合透镜16、滤光片15设置在所述的第二分束镜14的45度的光路上。

进一步的，所述的第一分束镜8和所述的第二分束镜14平行设置。

本发明的病原体细胞聚集过程是：在电泳电极5上，通过电压信号发生器6施加电压信号作为介电电泳收集病原体细胞的控制电压,介电泳是介电常数较低的物体在非匀强电场中，由于极化作用而受力产生的定向运动。介电力大小与物体是否带电无关，与物体的大小、电学性质、周围介质的电学性质以及外加电场的场强、场强变化率、频率有关。在电泳电极5上施加的电压信号可以产生非均匀电场，使病原体细胞形成介电泳定向运动，向容器底部中心聚集形成几个到几百个的病原体细胞聚集体3，病原体细胞聚集体近似球形形状，直径达十几微米；

本发明的三维拉曼光谱扫描成像过程为：首先拉曼光谱激发光源12发射激光，通过准直透镜13准直，然后通过第二分束镜14、激光扫描装置11、光束整形系统10，然后经过第一分束镜8发射，最后通过物镜7聚焦在病原体细胞聚集体3中产生拉曼散射光，一部分拉曼散射光又通过物镜7准直原光路返回，并通过第一分束镜8反射，透过光束整形系统10、激光扫描装置11，并经过第二分束镜14反射，最后通过滤光片15和耦合透镜16聚焦进入光谱仪17，用于病原体细胞拉曼光谱测量。然后拉曼光谱激发光源12发射的激光通过激光扫描装置11扫描以收集三维拉曼光谱图像。拉曼光谱激发光源12使用1064nm激光激发源，通过50倍/na0.75物镜7将约50mw的总激光强度聚焦到样品上。使用0.8μm步长，整个病原体细胞聚集体积分时间为20秒。

本实施例中，检测的过程是：首先取得病人的尿液，通过离心和过滤取得病原体样品2，采用微量注射器将病原体样品2取200微升单独滴入一个容器1中。另外再使用微量注射器将病原体样品2取200微升滴入另一个容器1中，并加入抗生素环丙沙星一定量。然后，通过电压信号发生器6在电泳电极5上施加电压信可以产生非均匀电场，使病原体细胞形成介电泳定向运动，向容器底部中心聚集形成几个到几百个的病原体细胞聚集体3。通过电泳电极5的电压约为4伏和1mhz。由此产生的电泳力指向四电极中心。20分钟后，通过ccd摄像头9可以看到收集到的病原体细胞形成一个紧凑的三维类球体。

60分钟后，开始采用拉曼光谱测量，首先拉曼光谱激发光源12发射激光，通过准直透镜13准直，然后通过第二分束镜14、激光扫描装置11、光束整形系统10，然后经过第一分束镜8发射，最后通过物镜7聚焦在病原体细胞聚集体3中产生拉曼散射光，一部分拉曼散射光又通过物镜7准直原光路返回，并通过第一分束镜8反射，透过光束整形系统10、激光扫描装置11，并经过第二分束镜14反射，最后通过滤光片15和耦合透镜16聚焦进入光谱仪17，用于病原体细胞聚集体拉曼光谱测量。然后拉曼光谱激发光源12发射的激光通过激光扫描装置11扫描以收集三维拉曼光谱图像。

环丙沙星属于氟喹诺酮类抗菌药物，主要作用于细菌细胞的dna螺旋酶的a亚单位，会破坏原有的dna分子结构，抑制细菌dna的合成和复制，进而导致细菌大面积死亡。观察拉曼谱线得到大肠杆菌的特征拉曼谱线。环丙沙星和大肠杆菌作用60分钟后，得到大肠杆菌的拉曼谱线整体变弱，拉曼光谱中归属于dna的两个磷酸骨架峰782cm-1,1084cm-1和脱氧核糖-磷酸振动峰1155cm-1及1262cm-1谱线明显减少;表征a型(dna)构象的特征峰812cm-1及979cm-1,668cm-1消失,并有新峰1075cm-1出现,,这说明dna的磷酸骨架有一定的断裂,从而导致大肠杆菌的分裂繁殖失去作用。测量结果如图2所示。

证明病原体仅仅是大肠杆菌，没有其他细菌感染。另外，没有使用环丙沙星的病原体拉曼光谱没有变化，而使用环丙沙星得拉曼光谱显示出明显的变化，表明环丙沙星对病人尿液中的大肠杆菌有效。

尽管描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以在本发明中进行各种修改和变化。因此，本发明旨在覆盖落入所附权利要求及其等同物的范围内的本发明的修改和变化。