一株生防贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄瓜白粉病菌中的应用的制作方法

本发明涉及植物病害防治技术领域，具体涉及一株生防贝莱斯芽孢杆菌tb1501及其在防治黄瓜白粉病菌中的应用。

背景技术

白粉病，俗称“白毛病”，是目前我国最重要的植物病害之一，除针叶树之外，在各种粮食作物、经济作物、瓜果蔬菜、观赏植物均有发生，并且分布范围广，在国内各种植区都有发生。在以黄瓜为代表的中国北方温室葫芦科作物中，白粉病危害尤为严重，易造成较大经济损失（可达50%以上）。由于该病潜育期短、发病迅速，生产中须频繁施药以进行防控，以黄瓜白粉病为例，在发病高峰的春秋季节通常7-10天就得喷药一次，从而造成严重的农药残留问题，不仅直接导致严重的经济损失和威胁人们的健康，甚至可能导致严重的社会问题。利用自然界中有益微生物或其代谢产物控制植物病原菌的数量或减轻其危害的策略称为植物病害生物防治。芽胞杆菌具有抗逆性强，繁殖快，在植物根际定殖能力强的特性，是微生物杀菌剂的重要来源。目前，枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌以及蜡样芽胞杆菌等是我国微生物杀菌剂的主要来源。在国家倡导的“药肥双减”的大背景下，安全、环境友好的生物农药可替代或部分替代化学药剂的使用，从而降低化学农药的使用量。因此加强生物农药的开发和作用机制研究是当前植保领域科研工作者的紧迫任务，具有重要的科学和社会生态意义。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌株（bacillusvelezensis）菌株命名为tb1501，其特征在于该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为：cgmccno.16069；保藏时间为：2018年7月6日。

贝莱斯芽孢杆菌tb1501由天津市植物保护研究所植物病害生物防治研究室筛选得到，tb1501被中国科学院微生物研究所鉴定为一株贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis），并保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为：cgmccno.16069；保藏时间为：2018年7月6日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

贝莱斯芽孢杆菌株（bacillusvelezensis）命名为tb1501的生理生化特性如下：

贝莱斯芽孢杆菌tb1501在固体lb培养基（牛肉浸膏粉5g/l，氯化钠10g/l，胰蛋白胨10g/l，琼脂15~20g/l）上菌落呈乳白色，形状近似圆形，边缘不整齐，表面有褶皱，菌体呈杆状，芽孢近椭圆形。在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

因而本发明还请求保护含有如上所述菌株和/或所述菌株的代谢产物的微生物菌剂。优选的，如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为液体菌剂。且在该菌剂中活菌和/或活芽孢的数量≥50～60亿/g。

本发明进一步公开了含有贝莱斯芽孢杆菌菌株的微生物菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）活化tb1501菌株：挑取一环tb1501菌落，接种在5ml液体lb培养基中，37℃，160rpm过夜震荡培养，制成tb1501种子液；

（2）固体lb培养基配制：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉，15-20g/l琼脂粉，去离子水溶解，121℃，湿热灭菌30min；

（3）液体lb培养基配制：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉，去离子水溶解，121℃，湿热灭菌30min；

（4）将制备好的种子液，1/1000接种于100毫升液体lb培养基中，160rpm，培养48-72h，即为制备好的tb1501发酵液。

本发明更进一步公开了贝莱斯芽孢杆菌株（bacillusvelezensis）命名为tb1501在防治黄瓜白粉病菌中的应用。该菌可以较好的防治黄瓜白粉病菌，具有良好的生防潜力。图1为tb1501在固体lb培养基上的菌落形态，图2为tb1501在油镜下观察到的菌体形态。典型的防效试验结果显示：tb1501菌株在防治黄瓜白粉病菌的过程中起到了良好的防治效果，防效高达85%以上，优于化学药剂戊唑醇，几乎与新型药剂粉唑醇相当。

本实施例所制备的贝莱斯芽孢杆菌株制剂的主要理化性质，如下所示：

本发明贝莱斯芽孢杆菌株（bacillusvelezensis）命名为tb1501的有效成分分析方法为：

采用菌落平板计数法，将菌悬液一定倍数稀释后定量涂布于培lb固体养基中，待贝莱斯芽孢杆菌株在培养基表面长出菌落，计数贝莱斯芽孢杆菌株菌落数，以测定样品的单位重量活芽孢数。

本发明贝莱斯芽孢杆菌株的毒理学：

按照我国农药毒性分级标准，1000亿贝莱斯芽孢杆菌株制剂属低毒杀菌剂。对家兔眼有轻度刺激性，对家兔皮肤无刺激性，对豚鼠为弱致敏物。

本发明公开了的一株贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）菌株与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）贝莱斯芽孢杆菌tb1501菌株属于芽孢杆菌属，液体菌剂制备方法简单。

（2）贝莱斯芽孢杆菌tb1501菌株在黄瓜白粉病防治方面应用推广价值较高。

（3）贝莱斯芽孢杆菌tb1501菌株的应用能够减少农药的使用，在保护及修复土壤微生态环境方面具有积极的意义。

附图说明

图1为tb1501在固体lb培养基上的菌落形态；

图2为tb1501在油镜下观察到的菌体形态；

图3为tb1501与粉唑醇、戊唑醇防效对比。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

（1）贝莱斯芽孢杆菌tb1501由天津市植物保护研究所植物病害生物防治研究室筛选得到，tb1501被中国科学院微生物研究所鉴定为一株贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis），并保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2018年7月6日；保藏登记号为：cgmccno.16069。

（2）贝莱斯芽孢杆菌tb1501菌株的筛选方法：

tb1501菌株是从蔬菜根际土壤中分离而得，取样地点：天津市武清区。

(1)称取1克土壤，放入50ml三角瓶中，加入灭菌自来水9ml，100rpm，震荡混匀30min，制成土壤菌悬液；

（2）将土样菌悬液放入85℃水浴15min，后吸取上清液，将其稀释100倍、1000倍；

（3）将100倍、1000倍上清稀释液涂布固体lb平板（10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉，15g/l琼脂粉），37℃过夜培养；

（4）选取平板上芽孢杆菌菌落，保存入库以备生测使用。

黄瓜白粉病生防菌初筛：

实验室建有自己的生防菌库（这些生防菌作为实验用，对外可以免费索取），库容5000株，用以筛选黄瓜白粉病菌防治较好的生防菌。

（1）挑取一环生防菌，接入5ml液体lb培养基（10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉），37℃，150rpm，过夜培养制成生防菌发酵液；

（2）选取生长状态，大小一致的健康黄瓜叶子，喷施×100生防菌发酵液，两天后接种黄瓜白粉病菌（本实验室保存）孢子悬浮液（10⁵个孢子/ml），10天后调查。调查结果显示tb1501菌株防治黄瓜白粉病效果最好，达到75%，保存tb1501作为科研菌株。

实施例2

tb1501发酵液的制备：

（1）活化tb1501菌株。挑取一环tb1501菌落，接种在5ml液体lb培养基中，37℃，160rpm过夜震荡培养，制成tb1501种子液。

（2）固体lb培养基配制：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉，15g/l琼脂粉，去离子水溶解，121℃，湿热灭菌30min。

（3）液体lb培养基配制：10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l牛肉浸膏粉，去离子水溶解，121℃，湿热灭菌30min。

（4）将制备好的种子液，1/1000接种于100毫升液体lb培养基中，160rpm，培养48-72h，即为制备好的tb1501发酵液。

实施例3

tb1501防治黄瓜白粉病试验：

将×100tb1501发酵液稀释液、戊唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）、粉唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）同时喷施白粉病菌发病初期的黄瓜叶片，设置清水对照，喷药后一周调查防治效果。防效试验结果显示，tb1501菌株在防治黄瓜白粉病菌的过程中起到了良好的防治效果，防效高达85%，优于化学药剂戊唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供），几乎与新型药剂粉唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）相当。

实施例4

露地黄瓜白粉病防治试验：

将×100tb1501发酵液稀释液、戊唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）、粉唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）同时喷施白粉病菌发病初期的露地黄瓜叶片，喷药后一周调查防治效果。防效试验结果显示，tb1501菌株防效达80.65%，化学药剂粉唑醇防效达80.62%，化学药剂戊唑醇防效达72.34%。

实施例5

设施黄瓜白粉病防治试验：

将×100tb1501发酵液稀释液、戊唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）、粉唑醇（由天津市汉邦植物保护剂有限责任公司提供）同时喷施白粉病菌发病初期的设施黄瓜叶片，喷药后一周调查防治效果。防效试验结果显示，tb1501菌株防效达85.67%，化学药剂粉唑醇防效达86.34%，化学药剂戊唑醇防效达77.34%。