ATP6表达水平作为评估患者生育力的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是atp6表达水平作为评估患者生育力的试剂盒及其应用。

背景技术：

近15％的夫妻在初次怀孕尝试时会遭遇失败，过去20年的有关数据显示，这些临床病例中有大约30％单独出现在男性中，另有20％出现在夫妇双方均异常的人群中。因此，在大约50％的不孕夫妇中男性要负至少一半责任。男性不育是一个影响大部分人的重要医学问题。大概半数的男性不育的原因甚至在全面检查后通常也显示不出任何确定的具体原因。现阶段对这些因素的研究大多停留在单基因水平和基因组水平。研究表明，男性不育症不是一种独立的疾病，而是多种疾病或多因素综合作用的结果。精液常规是男科实验室常用的评估男性生育能力的方法，通过精子浓度、活力、形态等参数的评估能够评价对应精液使女方受孕的能力。然而在临床上仍然存在精液参数正常，却不能使女方受孕的情况。通过纯化精液参数正常却有两种不同生育结局的精子，提取精子rna进行测序，找到了一批在两组精子中表达具有差异的基因。

中国专利申请：cn1790022a公开了精子结合抗体检测试剂，其特征在于：该试剂是由敏化羧化胶乳液、羊抗人丙种球蛋白血清组成的液体型双试剂，敏化羧化胶乳液含有标记人丙种球蛋白的羧化胶乳。该本发明具有以下优点：可满足国内各医院、计划生育部门研究与临床需要，为诊断男性免疫性不育，以及男性在接受输精管复育术后，能否恢复生育能力提供重要依据，具较大的经济价值，它操作简便，快速、敏感、特异。

中国专利申请：cn101563134a公开了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含造成细胞外dna对精细胞的影响降低的试剂。所述试剂可以为例如降解dna的酶(如dna酶)、阻断无细胞dna和精细胞表面受体之间相互作用的物质、结合dna的物质、抑制内源性精细胞dna酶的物质、抑制由结合到精细胞表面受体上的dna介导的信号传导途径的成员的物质、或刺激造成无细胞dna对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂。该发明还提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用该发明的药物组合物。该发明还提供了确定男性受试对象的生育力状况的方法、辅助生育的方法、选择辅助生育技术(art)的方法和在用在辅助生育技术中的精细胞群中选择精细胞的方法。但是关于本发明atp6表达水平作为评估患者生育力的试剂盒及其应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测atp6表达水平的试剂的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种检测atp6表达水平的试剂的应用，所述试剂用于制备检测患者生育力疾病的诊断试剂盒。

作为本发明的一个优选实施方案，所述疾病是精液参数正常但生育力不正常的疾病。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂为实时定量pcr检测试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，检测atp6表达水平的实时定量pcr检测试剂包括序列如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。

作为本发明的一个优选实施方案，所述诊断试剂盒包含检测actb表达水平的试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测actb表达水平的试剂为实时定量pcr检测试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，，检测actb表达水平的实时定量pcr检测试剂包括序列如seqidno.3和seqidno.4所示的引物对。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂进一步包括纯化精液试剂、精子rna抽提试剂、cdna合成试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，所述诊断试剂盒包含操作说明书，所述操作说明书记载有：当受试者精子atp6/actb<5时，即使相关精液参数正常，该被受试者也有潜在的不育风险。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂的使用步骤包括：

(1)使用梯度密度离心的方法对精子进行纯化；

(2)精子rna抽提；

(3)使用thermocdna第一链合成试剂盒完成cdna合成；

(4)使用sybrgreen法进行荧光实时定量pcr检测。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤(1)的方法是：取90％梯度液0.5ml加入5ml圆底离心管，上面覆盖45％梯度液0.5ml，取1ml液化后精液小心地覆盖于梯度液上，600g离心20-30min，小心吸去精液层与45％梯度液层，移除层交界处的细胞，加入一倍体积含5％hsa的htf溶液洗涤沉降于90％层的精子，600g20min离心后去除上清，沉淀使用500ultrizol试剂裂解；步骤(1)中所述精子排除血精症精子，因为红细胞与精子有类似的沉降系数，过多的红细胞会影响相关基因的丰度。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤(2)所用的方法是trizol法或离心柱法，所述trizol法是：精液经纯化后，离心去除上清，加入500ultrizol试剂，吹打沉淀重悬混匀后，室温放置5min裂解细胞，加入100ul氯仿，震荡15秒，室温静置10min，4℃，12000g，离心15min，液体分层，取上层水相，加入250ul异丙醇，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min，去除上清，加入500ul75％乙醇(使用rnase-free水配制)，震荡悬起沉淀，8000g离心5min，去除上清，干燥数分钟以去除乙醇，加入10-15ulrnase-free水，溶解沉淀，取1ul使用nanodrop测定rna浓度与质量；所述离心柱法是：trizol法第一步离心得到的上层水相，加入rlt裂解液至350ul，加入350ul70％乙醇(使用rnase-free水配制)，吹打混匀，加至rneasyminielutespincollum(纯化柱)上，闭盖8000g离心15秒，弃废液，加入350ulrw1液，闭盖80000g离心15秒，弃废液，上述步骤重复一次，换新2ml收集管，加入500ulrpe缓冲液，闭盖8000g离心15秒，弃废液，加入500ul80％乙醇(使用rnase-free水配制)，闭盖80000g离心2min，弃废液，打开盖子，全速离心5min，弃收集管，换1.5ml收集管，加入14ulrnase-free水，闭盖，全速离心1min，收集洗脱液，取1ul洗脱液使用nanodrop测定rna浓度与质量。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤(3)的方法是：取0.5-5ugrna，加入引物(oligodt或randomprimer,100μm)1ul，以rnase-free水补充至12ul，65℃水浴5min，立即插冰上冷却2min，加入4ul5x反应缓冲液，1ulribolockrna抑制剂，2uldntp(10mm)，1ulrevertaidm-mulv逆转录酶，混匀后，25℃孵育5min，然后42℃水浴1h，反应结束后于70℃水浴5min终止反应，产物可于-20℃保存，反应体系可等2。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤(4)是以actb作为内参；所述步骤(4)的方法是：使用abi公司2xsybrgreenmix(也可以使用其他公司同类产品)进行荧光实时定量pcr验证，每个反应体系(96模块20ul)按如下配制：10ul2xsybrgreenmix，8ul双蒸水，1ul引物(上下游各10μm)，1ul模板(每个反应体系约100ngcdna，可根据具体产物量作调整)，使用386模块时反应体系等比减半，荧光定量pcr仪上设置95℃变性15秒，60℃退火/延伸1min，在延伸结束后采集荧光信号，共40个循环，使用采集到的ct值来计算atp6相对actb量，计算公式：matp6/mactb＝2^(ctactb-ctatp6)，当计算结果为：

atp6/actb<5时，表明即使相关精液参数正常，该被受试者有潜在的不育风险。

本发明优点在于：

1、本发明为atp6提供了新用途，首次证明了atp6表达水平能够作为评估精液参数正常者生育能力的参考指标。

2、取样方便，易于检测。

3、本发明可为治疗生育力不正常提供理论依据，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是实施例3的实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1检测患者生育力疾病的诊断试剂盒的制备方法

检测患者生育力疾病的诊断试剂盒的制作工艺和操作流程主要是基于pcr技术。

通过定量pcr等技术筛选与生育力不正常患者相关的一类精子mrna，作为预测是否患有精液参数正常、生育力不正常疾病诊断的指标。

此试剂盒包括一批引物，所述引物序列如下：

使用sybrgreen法进行荧光实时定量pcr检测，使用采集到的ct值来计算atp6相对actb量，计算公式：matp6/mactb＝2^(ctactb-ctatp6)，若计算结果为atp6/actb<5，则表明即使相关精液参数正常，被受试者有潜在的不育风险。

实施例2检测患者生育力疾病的诊断试剂盒的使用方法

检测患者生育力疾病的诊断试剂盒的使用方法如下：

(1)使用梯度密度离心的方法对精子进行纯化：取90％梯度液0.5ml加入5ml圆底离心管，上面覆盖45％梯度液0.5ml，取1ml液化后精液小心地覆盖于梯度液上，600g离心20-30min，小心吸去精液层与45％梯度液层，移除层交界处的细胞，加入一倍体积含5％hsa的htf溶液洗涤沉降于90％层的精子，600g20min离心后去除上清，沉淀使用500ultrizol试剂裂解；

(2)采用trizol法或离心柱法进行精子rna抽提：所述trizol法是：精液经纯化后，离心去除上清，加入500ultrizol试剂，吹打沉淀重悬混匀后，室温放置5min裂解细胞，加入100ul氯仿，震荡15秒，室温静置10min，4℃，12000g，离心15min，液体分层，取上层水相，加入250ul异丙醇，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min，去除上清，加入500ul75％乙醇(使用rnase-free水配制)，震荡悬起沉淀，8000g离心5min，去除上清，干燥数分钟以去除乙醇，加入10-15ulrnase-free水，溶解沉淀，取1ul使用nanodrop测定rna浓度与质量；所述离心柱法是：trizol法第一步离心得到的上层水相，加入rlt裂解液至350ul，加入350ul70％乙醇(使用rnase-free水配制)，吹打混匀，加至rneasyminielutespincollum(纯化柱)上，闭盖8000g离心15秒，弃废液，加入350ulrw1液，闭盖80000g离心15秒，弃废液，上述步骤重复一次，换新2ml收集管，加入500ulrpe缓冲液，闭盖8000g离心15秒，弃废液，加入500ul80％乙醇(使用rnase-free水配制)，闭盖80000g离心2min，弃废液，打开盖子，全速离心5min，弃收集管，换1.5ml收集管，加入14ulrnase-free水，闭盖，全速离心1min，收集洗脱液，取1ul洗脱液使用nanodrop测定rna浓度与质量。

(3)使用thermocdna第一链合成试剂盒进行cdna合成：取0.5ugrna，加入引物(oligodt或randomprimer,100μm)1ul，以rnase-free水补充至12ul，65℃水浴5min，立即插冰上冷却2min，加入4ul5x反应缓冲液，1ulribolockrna抑制剂，2uldntp(10mm)，1ulrevertaidm-mulv逆转录酶，混匀后，25℃孵育5min，然后42℃水浴1h，反应结束后于70℃水浴5min终止反应，产物可于-20℃保存，反应体系可等2。

(4)使用sybrgreen法进行荧光实时定量pcr检测：使用abi公司2xsybrgreenmix(也可以使用其他公司同类产品)进行荧光实时定量pcr验证，每个反应体系(96模块20ul)按如下配制：10ul2xsybrgreenmix，8ul双蒸水，1ul引物(上下游各10μm)，1ul模板(每个反应体系约100ngcdna，可根据具体产物量作调整)，使用386模块时反应体系等比减半，荧光定量pcr仪上设置95℃变性15秒，60℃退火/延伸1min，在延伸结束后采集荧光信号，共40个循环，使用采集到的ct值来计算atp6相对actb量，计算公式：matp6/mactb＝2^(ctactb-ctatp6)。

实验过程中所用到的引物序列为：

实施例3临床验证

本实施例中的实验均是在本人知情同意的前提下进行的，且签署知情同意书。

1实验资料

收集医院确诊为参数正常且生育力正常的成年男子的精液与参数正常但有生育缺陷成年男性患者的精液，分别分为正常组和患者组。

2实验方法

按照如下方法分别对正常组和患者组的精子进行处理：

(1)使用梯度密度离心的方法对精子进行纯化：取90％梯度液0.5ml加入5ml圆底离心管，上面覆盖45％梯度液0.5ml，取1ml液化后精液小心地覆盖于梯度液上，600g离心20-30min，小心吸去精液层与45％梯度液层，移除层交界处的细胞，加入一倍体积含5％hsa的htf溶液洗涤沉降于90％层的精子，600g20min离心后去除上清，沉淀使用500ultrizol试剂裂解；

(2)采用trizol法进行精子rna抽提：精液经纯化后，离心去除上清，加入500ultrizol试剂，吹打沉淀重悬混匀后，室温放置5min裂解细胞，加入100ul氯仿，震荡15秒，室温静置10min，4℃，12000g，离心15min，液体分层，取上层水相，加入250ul异丙醇，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min，去除上清，加入500ul75％乙醇(使用rnase-free水配制)，震荡悬起沉淀，8000g离心5min，去除上清，干燥数分钟以去除乙醇，加入10-15ulrnase-free水，溶解沉淀，取1ul使用nanodrop测定rna浓度与质量；

(3)使用thermocdna第一链合成试剂盒进行cdna合成：取0.5ugrna，加入引物(oligodt或randomprimer,100μm)1ul，以rnase-free水补充至12ul，65℃水浴5min，立即插冰上冷却2min，加入4ul5x反应缓冲液，1ulribolockrna抑制剂，2uldntp(10mm)，1ulrevertaidm-mulv逆转录酶，混匀后，25℃孵育5min，然后42℃水浴1h，反应结束后于70℃水浴5min终止反应，产物可于-20℃保存，反应体系可等2。

(4)使用sybrgreen法进行荧光实时定量pcr检测：以actb作为内参，使用abi公司2xsybrgreenmix进行荧光实时定量pcr验证，每个反应体系(96模块20ul)按如下配制：10ul2xsybrgreenmix，8ul双蒸水，1ul引物(上下游各10μm)，1ul模板(每个反应体系约100ngcdna，可根据具体产物量作调整)，使用386模块时反应体系等比减半，荧光定量pcr仪上设置95℃变性15秒，60℃退火/延伸1min，在延伸结束后采集荧光信号，共40个循环，使用采集到的ct值来计算atp6相对actb量，计算公式：matp6/mactb＝2^(ctactb-ctatp6)。

引物序列为：

对照组的精子做与实验组的精子相同的处理。

3实验结果

实验结果如图1所示，显示结果为患者组的精子的atp6/actb<5，表明即使相关精液参数正常，被受试者有潜在的不育风险。

正常组的精子的atp6/actb大于≥5，表明精液参数正常，受试者不存在潜在的不育风险。

4实验结论

由以上实施例表明atp6可被用作检测精液参数正常、生育力不正常的疾病的标志物，atp6表达水平能够作为评估精液参数正常者生育能力的参考指标。

本发明为atp6提供了新用途，首次证明了atp6表达水平能够作为评估精液参数正常者生育能力的参考指标；取样方便，易于检测；可为治疗生育力不正常提供理论依据，具有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海市第一人民医院

<120>atp6表达水平作为患者生育力评估的应用及其试剂盒

<130>/

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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