本发明涉及一种高效厌氧除磷菌的快速富集培养方法。
背景技术
磷是造成水体富营养化的重要因子。受磷污染的水体，藻类大量繁殖，藻体死亡后分解产生有毒有害物质，所以降低污水中的磷有着非常重要的意义。目前去除废水中磷的主要方法是化学法和生物法，化学法除磷的缺点是消耗药剂并产生大量的化学污泥，处理成本高且容易造成二次污染；而生物法除磷则比较经济，其中聚磷菌除磷是当前该领域的研究热点。但是，聚磷菌除磷也存在诸多缺陷，如曝气能耗大、产生一定量的污泥、厌氧释磷和好氧摄磷较难控制等问题。
厌氧条件下磷酸盐还原成磷化氢是自然界中磷循环途径之一。多种细菌(如大肠杆菌、丁酸梭菌和溶剂发酵菌等)都具有磷酸盐还原成磷化氢的活性，在污泥生物处理中也证实了磷化氢产生途径的广泛存在。因此，近年来厌氧除磷生成磷化氢的方法引起了人们的高度关注。由于磷酸盐还原反应具有无需充氧耗能且产生的气态磷化氢能从水中逸出的特点，据此而开发的除磷工艺将会具有剩余污泥少、占地面积小、操作简便等优点，同时还能解决了聚磷菌在除磷过程中厌氧释磷和好氧摄磷的矛盾问题。但要开发这一新型除磷工艺，还缺乏适宜的厌氧除磷菌。因此，筛选分离出高效厌氧除磷菌具有重要的现实意义。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种高效厌氧除磷菌的快速富集培养方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种高效厌氧除磷菌的快速富集培养方法，其特征是按以下步骤进行：
步骤一、配置厌氧除磷菌富集培养基；在培养基中添加微量元素溶液和维生素溶液，进行厌氧除磷菌的富集；
步骤二、配置厌氧除磷菌分离培养基；
步骤三、进行厌氧除磷菌的纯化分离。
较佳的，执行完所述步骤三后返回顺序执行步骤一到步骤三，直到获得厌氧除磷菌纯菌株。
较佳的，所述步骤三后还包括厌氧除磷菌的分子生物学检测、生理特性鉴定与除磷效果测定的步骤。
较佳的，所述厌氧除磷菌富集培养基包括naac、(nh4)2so4、kh2po4、k2hpo4、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、微量元素溶液和维生素溶液。
较佳的，所述厌氧除磷菌富集培养基包括2g的naac、0.14g的(nh4)2so4、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.1g的cacl2·2h2o、0.2g的mgso4·7h2o、1ml微量元素溶液和1ml维生素溶液，用蒸馏水定容至1000ml，ph调节为7.0～7.2。
较佳的，每升所述微量元素液是由1.5g的fecl3·6h2o、0.15g的h3bo3、0.03g的cuso4·5h2o、0.18g的ki、0.12g的mncl2·4h2o、0.12g的znso4·7h2o、0.15g的cocl2·6h2o和余量的蒸馏水组成。
较佳的，每升所述维生素溶液由50mg的维生素b1、50mg的维生素b2、100mg的维生素b6、20mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸和余量的蒸馏水组成。
较佳的，厌氧除磷菌的富集使用120ml血清瓶厌氧条件下富集培养。
较佳的，分离培养基包括酵母膏、kh2po4、k2hpo4、mgso4·7h2o、cacl2、(nh4)2fe(so4)2·6h2o、纤维素、葡萄糖、乙酸钠、蛋白胨、nano3、nh4cl和琼脂。
较佳的，分离培养基组成为：0.25g的酵母膏、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.2g的mgso4·7h2o、0.075g的cacl2、0.04g的(nh4)2fe(so4)2·6h2o、0.5的纤维素、0.5的葡萄糖、0.5g的乙酸钠、0.5g的蛋白胨、0.5g的nano3、0.5g的nh4cl和15g的琼脂，用蒸馏水定容至1000ml，制成固体培养基进行厌氧除磷菌的纯化分离。
较佳的，厌氧除磷菌的纯化分离操作在厌氧无菌操作台中进行，将步骤一所得富集物稀释10-1～10-8倍，涂布于步骤二中制成的固体培养基，经过37℃恒温培养后挑选单个菌落进行培养。
较佳的，厌氧除磷菌的分子生物学鉴定通过对16srrna片段进行高通量测序完成，生理特性鉴定与除磷效果测定通过在不同底物磷浓度、温度、ph等条件下进行培养测定。
本发明的有益效果是：本发明对高效厌氧除磷菌的富集、分离与纯化为厌氧除磷菌的生理特性研究奠定基础，为充分认识污水处理过程中磷循环途径提供理论支撑，利用高效厌氧除磷菌菌剂可以强化污水处理过程中的除磷效果，为开发低能耗、高效率的新型除磷工艺提供基础，解决污水处理过程中的除磷难题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
本发明提供的一种高效厌氧除磷菌的快速富集培养方法按以下步骤进行：
步骤一、配置厌氧除磷菌富集培养基；在培养基中添加微量元素溶液和维生素溶液，进行厌氧除磷菌的富集；
步骤二、配置厌氧除磷菌分离培养基；
步骤三、进行厌氧除磷菌的纯化分离。
本实施例中，执行完所述步骤三后返回顺序执行步骤一到步骤三，直到获得厌氧除磷菌纯菌株。
本实施例中，所述步骤三后还包括厌氧除磷菌的分子生物学检测、生理特性鉴定与除磷效果测定的步骤。
本实施例中，所述厌氧除磷菌富集培养基包括2g的naac、0.14g的(nh4)2so4、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.1g的cacl2·2h2o、0.2g的mgso4·7h2o、1ml微量元素溶液和1ml维生素溶液，用蒸馏水定容至1000ml，ph调节为7.0～7.2。
本实施例中，每升所述微量元素液是由1.5g的fecl3·6h2o、0.15g的h3bo3、0.03g的cuso4·5h2o、0.18g的ki、0.12g的mncl2·4h2o、0.12g的znso4·7h2o、0.15g的cocl2·6h2o和余量的蒸馏水组成。
本实施例中，每升所述维生素溶液由50mg的维生素b1、50mg的维生素b2、100mg的维生素b6、20mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸和余量的蒸馏水组成。
本实施例中，厌氧除磷菌的富集使用120ml血清瓶厌氧条件下富集培养，培养世代周期为1周。
本实施例中，分离培养基组成为：0.25g的酵母膏、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.2g的mgso4·7h2o、0.075g的cacl2、0.04g的(nh4)2fe(so4)2·6h2o、0.5的纤维素、0.5的葡萄糖、0.5g的乙酸钠、0.5g的蛋白胨、0.5g的nano3、0.5g的nh4cl和15g的琼脂，用蒸馏水定容至1000ml，制成固体培养基进行厌氧除磷菌的纯化分离。
本实施例中，厌氧除磷菌的纯化分离操作在厌氧无菌操作台中进行，将步骤一所得富集物稀释10-1～10-8倍，涂布于步骤二中制成的固体培养基，经过培养后挑选单个菌落进行培养。
本实施例中，厌氧除磷菌的分子生物学鉴定通过对16srrna片段进行高通量测序完成，生理特性鉴定与除磷效果测定通过在不同底物磷浓度、温度、ph等条件下进行培养测定。
本具体实施方式中，使用120ml血清瓶厌氧条件下富集培养，富集培养基主要包括2gnaac、0.14g(nh4)2so4、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.1gcacl2·2h2o、0.2gmgso4·7h2o、1ml微量元素溶液和1ml维生素溶液，，用蒸馏水定容至1000ml，调节ph为7.0～7.2，分装至血清瓶中进行曝氮气除氧，密封并灭菌。
微量元素溶液组成为：每升微量元素液是由1.5g的fecl3·6h2o、0.15g的h3bo3、0.03g的cuso4·5h2o、0.18g的ki、0.12g的mncl2·4h2o、0.12g的znso4·7h2o、0.15g的cocl2·6h2o和余量的蒸馏水组成。
维生素溶液组成为：每升维生素溶液由50mg的维生素b1、50mg的维生素b2、100mg的维生素b6、20mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸和余量的蒸馏水组成。
富集过程中及时跟踪监测总磷(tp)浓度，当tp减少了90％的时候即进行下一次接种培养，每一次培养周期为1周。
将经过培养得到的厌氧除磷菌富集物用于后续纯化分离，分离培养基主要组成为：0.25g的酵母膏、0.5g的kh2po4、0.64g的k2hpo4、0.2g的mgso4·7h2o、0.075g的cacl2、0.04g的(nh4)2fe(so4)2·6h2o、0.5的纤维素、0.5的葡萄糖、0.5g的乙酸钠、0.5g的蛋白胨、0.5g的nano3、0.5g的nh4cl和15g的琼脂，用蒸馏水定容至1000ml，高温灭菌制成固体培养基后即可进行厌氧除磷菌的纯化分离。
厌氧除磷菌的纯化分离操作在厌氧无菌操作台中进行，将所得高纯度富集物稀释10-1～10-8倍，取0.1ml涂布于制成的固体平板培养基表面，30～35℃经过培养后挑选单个菌落进行培养，反复进行富集与分离操作，直至获得厌氧除磷菌的纯菌株。
厌氧除磷菌的分子生物学鉴定通过对16srrna片段进行高通量测序完成，生理特性鉴定与除磷效果测定通过在不同底物磷浓度(0.5、1、2、3mg/l)、不同温度(25、30、35、40℃)、不同ph(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)等条件下进行培养测定。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。