检测猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒的制作方法

本发明提供了一种用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪日本乙型脑炎病毒(jev)、猪瘟病毒(csfv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪伪狂犬病毒(prv)和猪细小病毒(ppv)6的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒，可实现同时检测6种引起猪病毒性繁殖障碍症候群的病原，属于检验检疫领域。

背景技术：

猪病毒性繁殖障碍是目前危害我国养猪业最重要的疾病之一，该病主要危害怀孕母猪群，导致怀孕期母猪早产、流产、产木乃伊胎，其发病率和仔猪死亡率都较高，并且常伴发子宫内膜炎症和免疫抑制，发病和传播迅速，比较难以控制，极大的危害着规模化养殖场的猪群安全，给养猪业带来重大损失。一旦感染该病，母猪常带毒，易给养殖场带来毁灭性打击。猪病毒性繁殖障碍症候群的常见病原为：猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)、猪日本乙型脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus,jev)、猪瘟病毒(classicswinefevervirus,csfv)、猪圆环病毒2型(porcinecircovirus2types,pcv2)、猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,prv)和猪细小病毒(porcineparvovirus,ppv)等六种病毒引起的。由于该症候群发病迅速，需短时间内确定致病原因并进行预防和治疗，目前尚没有一种方法可以一次性对引起猪病毒性腹泻的多种疾病病原体进行鉴别诊断。

因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于猪猪病毒性繁殖障碍症侯群疾病的预防和控制至关重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种检测猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的mlpa检测试剂盒。该试剂盒可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪日本乙型脑炎病毒(jev)、猪瘟病毒(csfv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪伪狂犬病毒(prv)和猪细小病毒(ppv)。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种检测猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的mlpa检测试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)反转录和预扩增混合液：

该混合液包含反转录和预扩增引物，其序列如seqidno：1～12所示(见表1)，分别用于反转录和预扩增；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)多重连接探针混合液：

该混合液包括探针和通用引物；其中，探针的序列如seqidno：13～24所示(见表2)，通用引物的序列如seqidno：25～26所示(见表3)；

(3)mlpa缓冲液；

(4)连接缓冲液a和b；

(5)连接酶ligase-65；

(6)pcr反应混合液，其包括序列seqidno：25～26所示的通用引物；

(7)salsa聚合酶；

(8)阴性对照；

(9)阳性对照，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪日本乙型脑炎病毒(jev)、猪瘟病毒(csfv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪伪狂犬病毒(prv)和猪细小病毒(ppv)的阳性对照质粒。

本发明中，所述序列seqidno：1-2是猪繁殖与呼吸综合征病毒预扩增引物；所述序列seqidno：3-4是猪日本乙型脑炎病毒预扩增引物；所述序列seqidno：5-6是猪瘟病毒预扩增引物；所述序列seqidno：7-8分别是猪圆环病毒2型预扩增引物；所述序列seqidno：9-10是猪伪狂犬病毒预扩增引物；所述序列seqidno：11-12是猪细小病毒预扩增引物；所述序列seqidno：13-14为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列seqidno：15-16分别为检测猪诺如病毒日本乙型脑炎病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列seqidno：17-18分别为检测猪瘟病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列seqidno：19-20分别为检测猪圆环病毒2型的左侧探针和右侧探针；所述序列seqidno：21-22分别为检测猪伪狂犬病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列seqidno：23-24分别为检测猪细小病毒的左侧探针和右侧探针；其中，所述seqidno：14、16、18、20、22、24的5’端进行磷酸化处理；所述序列seqidno：25、26分别是通用pcr扩增的正向和反向引物。

本发明中，试剂盒中的阳性对照来自病毒核酸rna经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的m基因、猪日本乙型脑炎病毒(jev)的e基因、猪瘟病毒(csfv)的e2基因、猪圆环病毒2型(pcv2)的orf2基因、猪伪狂犬病毒(prv)的ge基因和猪细小病毒(ppv)的vp2基因。

本发明进一步提供了利用所述试剂盒实现同时检测6种猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的多重连接探针扩增检测的方法，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品dna/rna；

使用磁珠dna/rna共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的dna和rna，得到200μl样品；

(2)rna反转录成cdna及预扩增

进行一步法反转录rt-pcr反应；

配制25μl反应体系：10μlonestepaheadrt-pcrmastermix，1μlonestepaheadrt-mix，5μldna或rna，1μl随机反转录引物和5μl预扩增引物混合液；终浓度为每条引物0.5μm，3μlh2o补足；

反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，40个循环；72℃2min；

(3)mlpa扩增和检测

a)dna变性

取0.2mlpcr反应管，每管加入0.5μldna溶液和4.5μlte，98℃变性5min，降至室温25℃；

b)探针与样本dna的杂交

配制3μl混匀的探针混合液：1.5μlmlpa缓冲液+1.5μl探针混合液；

将探针混合物加入上述pcr管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育；

c)杂交探针的连接

配制32μl连接酶混合物：25μldh2o+3μl连接缓冲液a+3μl连接缓冲液b+1μl连接酶ligase-65；

pcr仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μl连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育；

d)连接探针的pcr扩增

配制10μlpcr混合液：7.5μldh2o+2μlpcr反应混合液+0.5μlsalsa聚合酶；

取出pcr管，室温下加入10μlpcr混合物；开始pcr反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃；

e)全自动核酸分析仪分析：

pcr扩增产物取20μl，用全自动核酸分析仪进行分析；

(4)结果描述及判定

a)质控标准：

阳性对照在94bp、100bp、106bp、116bp、122bp、127bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b)结果判断：

阳性：在94bp有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸、在100bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪日本乙型脑炎病毒的核酸；在106bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪瘟病毒的核酸；在116bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪圆环病毒2型的核酸；在122bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪伪狂犬病毒的核酸；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪细小病毒的核酸；同时对mlpa扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒。

与现有方法比较，本发明具有以下优势和效果：

1)高通量。一个反应能同时检测6种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。

2)节省费用。通常一个样品采用荧光定量方法检测6种疾病病原核酸，费用通常为200×6＝1200元，而本试剂盒由于在一管中进行反应，费用大约400元左右。

3)特异性好。通过序列比对和blast分析，加强探针设计，确保探针只与目标基因相结合。

4)灵敏度高。普通的mlpa方法至少需要6000个拷贝的目标dna。本发明通过增加rt-pcr这一步骤对目标基因进行富集，最低可检出10拷贝左右的目标基因。

附图说明

图1为6种病毒性繁殖障碍症候群疾病病原的阳性对照重组质粒构建pcr验证；

图中，m为dl2000dnamarker；1为pcv2；2为prrsv；3为csfv；4为ppv；5为prv；6为jev。

图2.1至2.6为猪病毒性繁殖障碍症候群mlpa方法的特异性验证的峰图(单个模板)；

构建好的csfv-e2、prv-ge、prrsv-m、pcv2-cap、jev-e、ppv-vp2阳性质粒，分别单个加入带有6对预扩增引物和6对探针的体系里，按照mlpa反应程序进行检测，结果表明：猪猪繁殖与呼吸综合征病毒在94bp有特异性峰图；猪猪日本乙型脑炎病毒在100bp有特异性峰图；猪瘟病毒在106bp有特异性峰图；猪圆环病毒2型在116bp有特异性峰图；猪伪狂犬病毒在122bp有特异性峰图；猪猪细小病毒在127bp有特异性峰图。

图3为猪病毒性繁殖障碍症候群mlpa方法的特异性验证的模拟电泳图；

结果表明：在94bp有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸、在100bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪日本乙型脑炎病毒的核酸；在106bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪瘟病毒的核酸。在116bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪圆环病毒2型的核酸；在122bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪伪狂犬病毒的核酸；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪细小病毒的核酸。

图4.1至4.6为猪病毒性繁殖障碍症候群mlpa方法的特异性验证峰图(单个模板病毒液为模板)；

分别用csfv、prv、jev、prrsv、pcv2、ppv病毒提取的cdna或dna为模板，单个加入带有6对预扩增引物和6对探针的体系里，按照mlpa反应程序进行检测，结果表明猪猪繁殖与呼吸综合征病毒在94bp有特异性峰图；猪猪日本乙型脑炎病毒在100bp有特异性峰图；猪瘟病毒在106bp有特异性峰图；猪圆环病毒2型在116bp有特异性峰图；猪伪狂犬病毒在122bp有特异性峰图；猪猪细小病毒在127bp有特异性峰图。

图5为猪病毒性繁殖障碍症候群mlpa方法的特异性验证的峰图(混合模板)。

构建好的csfv、prv、prrsv、pcv2、jev、ppv基因阳性质粒，一起加入带有6对预扩增引物和6对探针的体系里，按照mlpa反应程序进行检测的结果。猪猪繁殖与呼吸综合征病毒在94bp有特异性峰图；猪猪日本乙型脑炎病毒在100bp有特异性峰图；猪瘟病毒在106bp有特异性峰图；猪圆环病毒2型在116bp有特异性峰图；猪伪狂犬病毒在122bp有特异性峰图；猪猪细小病毒在127bp有特异性峰图。

具体实施方式

多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，mlpa)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。该技术将核酸的杂交检测和pcr链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析，在同一反应管中对45个不同的靶基因进行检测和定量分析。mlpa的基本原理包括探针和靶序列dna进行杂交，之后通过连接、pcr扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，dna分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个mlpa探针包括两个寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由m13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在mlpa反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每对探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在90～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，软件分析，得出结论。

本发明构建了基于mlpa技术的同时检测6种猪病毒性腹泻症候群的检测方法，为该类症状的疾病提供了特异性强、灵敏度高的高通量诊断技术。

本发明为了提高mlpa的检测灵敏度，依据6种疾病的genbank上的特异序列，经blast分析，每一种疾病设计了一对预扩增引物(序列见表1)，这些序列包含mlpa探针的序列，通过基于一步法cdna的合成和预扩增，然后按照本发明的操作流程进行mlpa，其探针(序列见表2)经变性、杂交、连接后，利用通用引物(序列见表3)进行pcr扩增，然后进行毛细管电泳检测。

表16种猪病毒性繁殖障碍症侯群多重连接探针扩增技术(mlpa)预扩增引物序列(5’-3’)

表26种猪病毒性繁殖障碍症侯群多重连接探针扩增技术(mlpa)探针序列(5’-3’)

其中，上述seqidno：14，seqidno：16，seqidno：18，seqidno：20，seqidno：22和seqidno：24的5’端进行磷酸化处理；

表3通用引物序列

本发明采用多重连接探针扩增技术建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒6的多重连接探针扩增检测方法并组装了试剂盒，本试剂盒组分组成如下：

(1)反转录和预扩增引物混合液，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的预扩增引物，所述引物序列见表1，混合液中每条引物的浓度为2.5μm；

(2)探针混合液，其包括检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的左侧和右侧探针，所述探针的序列见表2，其中，所述seqidno：14、16、18、20、22、24的5’端进行磷酸化处理；混合液中每种探针的浓度为1.33nm；

(3)mlpa缓冲液；

(4)连接缓冲液a；

(5)连接缓冲液b；

(6)连接酶ligase-65；

(7)pcr反应混合液，其包括序列表seqidno:25、26所示的通用引物；

(8)salsa聚合酶；

(9)阴性对照：te；

(10)阳性对照：为csfv-e2、prv-ge、prrsv-m、pcv2-cap、jev-e、ppv-vp2基因阳性质粒dna的混合物。

本发明还进一步利用前述试剂盒建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的6种病毒性腹泻疾病的鉴别检测方法。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

一、试剂盒的使用说明

1试剂盒的组成

其中，mlpa缓冲液、连接缓冲液a、连接缓冲液b、连接酶ligase-65和salsa聚合酶购自mrc-holland公司。

储存条件：

除阳性对照以外，其他组分保存在-15℃到-25℃。阳性对照保存于-80℃。

为了保证实验效果，试剂盒应在一年之内使用完毕。

2使用方法

2.1磁珠法提取样品dna/rna；

用tiangen公司的磁珠dna/rna共提取试剂盒(货号：dp422)，使用天隆np968全自动核酸提取仪同时提取样品中的dna和rna，得到200μl样品。

2.2rna反转录成cdna及预扩增

按照qiagenonestepaheadrt-pcrkit说明书进行一步法反转录rt-pcr反应。配制25μl反应体系：10μlonestepaheadrt-pcrmastermix，1μlonestepaheadrt-mix，5μldna或rna，1μl随机反转录引物和5μl预扩增引物混合液(终浓度为每条引物0.5μm)，3μlh2o补足。反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，40个循环；72℃2min。

2.3mlpa扩增和检测

2.3.1dna变性

取0.2mlpcr反应管，每管加入0.5μldna溶液和4.5μlte，98℃变性5min，降至室温25℃。

2.3.2探针与样本dna的杂交

配制3μl混匀的探针混合液：1.5μlmlpa缓冲液+1.5μl探针混合液。将探针混合物加入上述pcr管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育。

2.3.3杂交探针的连接

配制32μl连接酶混合物：25μldh2o+3μl连接缓冲液a+3μl连接缓冲液b+1μl连接酶ligase-65。pcr仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μl连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育。

2.3.4连接探针的pcr扩增

配制10μlpcr混合液：7.5μldh2o+2μlpcr反应混合液+0.5μlsalsa聚合酶。取出pcr管，室温下加入10μlpcr混合物。开始pcr反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃。

2.3.5全自动核酸分析仪分析：

pcr扩增产物取20μl，用全自动核酸分析仪(qsep100dnaanalyzer)进行分析。

2.4结果描述及判定

2.4.1质控标准：

阳性对照在94bp、100bp、106bp、116bp、122bp、127bp处有特异性扩增条带。

阴性对照无特异性扩增条带。

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。

2.4.2结果判断：

阳性：在94bp有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸、在100bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪日本乙型脑炎病毒的核酸；在106bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪瘟病毒的核酸。在116bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪圆环病毒2型的核酸；在122bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪伪狂犬病毒的核酸；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪细小病毒的核酸。同时可对mlpa扩增产物进行测序，进一步确认。

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒。

注意事项：

1)dna样品：

a.尽可能减少dna溶液中盐离子、醇类等的含量。

b.用te而不是水溶解或稀释dna，避免dna高温时脱嘌呤。

c.实验前将所有dna样本浓度稀释到大致相等(建议20-40ng/ul)。

2)探针、连接酶ligase-65、连接缓冲液a在使用前应分装，避免反复冻融；

3)缓冲液和试剂使用前应震荡混匀离心，混合时用枪头轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡或将打到管壁上，所有含酶步骤均不可离心；

4)加连接酶反应时，pcr管要放置在pcr仪中，切勿取出；

5)蒸发质控：8μlte/水空白连接，连接完成管底至少剩余5μl。

6)全自动核酸分析仪设置：优化注射电压和时间，pcr产物可用稀释液稀释后上样，使得信号处在最佳分析范围。

二、试剂盒的特异性

1材料

本试验所用到的病毒与细菌见表4。

表4本试验所用到的病毒与细菌

注：表4中所述病毒或菌株，均为现有公知技术，本领域技术人员可通过市购方式自行获得。本申请人承诺在本申请提交之日起20年内，向社会公众提供上述病毒或菌株样本。

2方法

2.1分别用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的六种病原单一探针分别针对常见的猪病病原如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌进行mlpa检测，验证探针的特异性。

2.2用六种病原的混合探针分别对表4中的所有病毒和细菌进行mlpa检测。

3结果

3.1用设计的任意一组探针进行检测，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，而对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌均无扩增信号。说明探针特异性良好。

3.2用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒六种病原混合的探针分别对表4中的所有病毒和细菌进行mlpa检测，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，而对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒、产气荚膜梭菌和猪胸膜肺炎放线杆菌均无扩增信号。表明所建立的方法特异性良好。

三、试剂盒的灵敏度

1材料

见表4。

2方法

2.1质粒的构建

将扩增的csfv-e2、prv-ge、prrsv-m、pcv2-cap、jev-e、ppv-vp2基因片段与pzero-blunt载体连接，转化escherichiacolidh5a，提取重组质粒，并进行pcr验证和测序验证。

2.2灵敏度验证

用紫外分光光度计测定重组质粒的吸光值a260和a280，计算出重组质粒的拷贝数，用easydilution试剂将阳性重组质粒稀释到10¹⁰拷贝·μl^－1，再进行10倍梯度稀释，以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰拷贝·μl^－19个拷贝数梯度作为标准模板，进行mlpa反应。质粒质量浓度(g·l^－1)＝λ(a260)×50(g·l^－1)/1000×准模板释稀释倍数。拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝·μl^－1)＝质粒浓度(g·μl^－1)×阿弗加德罗常数/重组质粒分子量。

3结果

该方法最低可检测到7个拷贝的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸、8个拷贝猪日本乙型脑炎病毒的核酸、8个拷贝猪瘟病毒的核酸、3个拷贝猪圆环病毒2型的核酸、7个拷贝猪伪狂犬病毒的核酸、9个拷贝猪细小病毒的核酸。

以猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒6种病毒进行倍比稀释后，提取rna或dna，其rna合成cdna，以此作为模板按照mlpa的程序进行反应和荧光定量rt-pcr反应，检测出该方法的最低检测限(见表5)，结果表明mlpa方法比荧光定量方法约差5倍左右。

表56种病毒性繁殖障碍症候群mlpa方法与荧光定量rt-pcr方法灵敏度比较

a表示以病毒的5倍进行倍比稀释的最低稀释倍数。

四、试剂盒的重复性

以6种病毒为模板进行倍比稀释，取三个浓度梯度5^-2、5^-3、5^-4，每个梯度设置3个重复，以此作为模板按照4.2.2-4.2.5的程序进行mlpa反应，同时按照上述方法进行3次重复试验，得出该方法的组间和组内变异系数，所得数值均小于10％，变异系数小，说明本方法重复性好见表6。

表66种病毒性繁殖障碍症候群mlpa检测方法重复性

序列表

<110>浙江农林大学

<120>检测猪病毒性繁殖障碍症候群病原核酸的mlpa检测试剂盒

<160>26

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtacatgacattcgcgcac20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cggatgaaagcccgcggcact21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agaagcgagctgatagtagct21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gccgcctgggacgccccaacttg23

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tggacatgtgtgaaaggcga20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

catctgatgcatgcaccttgac22

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

atctcatcatgtccaccgcc20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gacgtatccaaggaggcgtt20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgatgaccgtgacgtactcg20

<210>10

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cgtgcagcttcacctcg17

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

ctgtgaatgttagtgttcctttcc24

<210>12

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gaacttgatacagatctaaaacctagactaca32

<210>13

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gggttccctaagggttggagaaacctggaaattcatcacctccag45

<210>14

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

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<210>15

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

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<210>16

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

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<210>17

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>18

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>19

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>20

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>21

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>22

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<212>dna

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<212>dna

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<400>23

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<210>24

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>25

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

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<210>26

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

gtgccagcaagatccaatctaga23