一种鸡育种素材的筛选方法与流程

本发明涉及一种鸡育种素材的筛选方法，属于农业畜禽育种领域。

背景技术：

现有技术的畜禽育种素材筛选，往往是通过体型外貌、系谱以及生产性能测定等信息来进行的。上述方法主要基于畜禽表型值来评估畜禽育种素材，不能真实全面反映畜禽品种的特性，存在一定的局限性和不可预知性，且评估时间长，成本高。

近年来，随着分子生物学技术的发展，科研人员通过从基因水平构建畜禽品种的分子遗传图谱来评估畜禽品种资源。但资源评估与育种素材的选择是分离的，往往只根据表型进行育种素材的选择，而未利用评估结果作为科学依据。因此，育种素材的选择存在准确率低、育种时间长、成本高等缺陷，而且选育出的品种有可能存在遗传多样性不够丰富或有近亲繁殖的可能，导致培育出的新品种生产性能不高。

微卫星又称为简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)或短片段重复序列(shorttandemrepeat，str)，是由1-6bp的碱基作为核心重复单元，串联重复形成的一类dna序列。由于微卫星广泛且较均匀地分布在基因组中(约30-50kb就存在一个微卫星dna)，具有丰富的多态性、信息含量大、呈共显性、符合孟德尔遗传规律等特点，被广泛运用于连锁图谱构建、种群遗传多样性分析、品种品系的选择和建立、以及不同品系间亲缘关系界定、个体识别和亲权鉴定等。

线粒体基因组也叫线粒体dna(mtdna，mitochondrialdna)。mtdna结构与细菌dna相似，成双链环状。线粒体基因组的结构特点也与原核生物相同。mtdna可以独立编码线粒体中的一些蛋白质是核外遗传物质。基因组是细胞携带生命信息dna及其蛋白质复合物的总称。

鸡线粒体基因组一般在16785bp左右，为闭合环状双链结构，能够自主复制和转录。包括37个基因的编码编码区(13个蛋白质编码基因、2个核糖体rna基因、22个转运rna基因)和1个控制区(d-loop区)。d-loop区为mtdna上最重要的非编码区，进化速率较编码区更快，是适合亲缘关系较近的群体进行遗传分化研究的理想分子标记。d-loop区部分或者全部序列已经广泛地应用于动物类群的遗传多样和系统进化研究中。

目前，尚未出现采用微卫星标记结合mtdnad-loop序列分析来进行鸡育种素材的筛选的相关报道。因此，有必要提供一种新的鸡育种素材的筛选方法，以解决现有技术的不足。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种鸡育种素材的筛选方法。本发明采用分子生物技术对育种素材进行遗传多样性及遗传距离分析，选择遗传多样性丰富、保证有丰富遗传信息的个体作为育种素材，减少育种的盲目性和风险，减少育种时间，提高育种效率，降低育种成本。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鸡育种素材的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：基因组dna的提取

提取待测样品血液中的基因组dna；

步骤2：微卫星标记及pcr反应

选择微卫星编号为mcw0123、adl0112、mcw0014、mcw0034、mcw0103、mcw0295、mcw0078、mcw0222、mcw0098、mcw01111、mcw0037、mcw0248、lei0166、adl0268、mcw0216、mcw0020、mcw0206、mcw0183的18对微卫星位点，分别进行pcr-荧光标记-半自动基因组扫描，得到基因组扫描图；

步骤3：mtdnapcr反应及序列测定

mtdnapcr反应的特异性引物包括seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物；且上游引物的5’端用fam荧光标记；

seqidno.1(上游引物)：5’-acccattatatgtatacgggcattaa-3’，

seqidno.2(下游引物)：5’-agttatgcatgggatgtgcctgaccgag-3’；

以步骤1提取的基因组dna为模板，利用上述特异性引物进行pcr扩增；将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若pcr扩增产物的电泳结果与目的片段大小一致，则回收纯化，进行pcr产物测序，得到测序序列；

步骤4：统计分析

根据步骤2得到的基因组扫描图，利用genepop32生物软件,统计18对微卫星位点的等位基因数na、有效等位基因数ne、等位基因频率p、观测杂合度ho、预期杂合度he，计算出多态信息含量pic；计算出遗传距离；

mtdnad-loop序列：以ncbi数据库中登录号为gu261695的红原鸡mtdna全序列作为参考序列，用mega软件对步骤3得到的测序序列进行剪切和比对，查找变异位点，再用dnasp5.0软件计算单倍型数目、单倍型多样性和核苷酸多样性，最后用network软件构建中介网络图；

评估鸡种之间的遗传结构：利用遗传距离，构建upgma系统发生树或nj系统发生树和/或采用structure软件的bayesian聚类方法对个体进行居群分组聚类分析；

步骤5：育种素材选择

根据步骤4的统计分析结果，选择多态信息含量pic>0.5,等位基因数na为5个以上、且遗传距离大于0.1以上的群体或个体、中介网络图中纯度最高的群体作为鸡育种素材。

本发明的原理说明：

本发明的步骤1中，提取待测样品血液中的基因组dna，采用dna试剂盒提取。上述dna试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司，型号为cw0540-version04202010-2.2。

本发明的步骤2中，选用的18对鸡微卫星位点，具有等位基因数多、多态性含量丰富的特点，且表现为多态性好，特异性强且相互之间并不连锁。pcr-荧光标记-半自动基因组扫描，在英潍捷基(上海)贸易有限公司进行。

本发明的步骤3中，上游引物的5’端用fam荧光标记，便于后续的pcr产物片段的基因扫描。上述带5’-fam标记的引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。测序在北京华诺时代科技有限公司进行。

本发明的步骤4中，采用structure软件的bayesian聚类方法对个体进行居群分组聚类分析，是为了更直观地展现出各育种素材之间的遗传分化差异。通过network软件可以构件中介网络图(mediannetwork),这种网络图可包含所有最简约的束，而且可现实序列的信息(如同质性位点的位置、突变热点以及分辨单倍型类群等)，在聚类簇中节点之间的距离越近，它们的单倍型就越相近。对于大样本，通过识别平行进化，可以减少网络图的复杂性。而且通过network软件，可以考察mtdna控制区序列核苷酸替换的模式。

本发明的步骤5中，多态信息含量pic是衡量等位基因片段多态性的理想指标。当座位pic>0.5时，该座位为高度多态，当0.25<pic<0.5时，该座位为中度多态，当pic<0.25时，该座位为低度多态。遗传距离是指不同的种群或种间的基因差异的程度，并且以某种数值进行度量。遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，反映了所研究群体的系统分化。

本发明选择多态信息含量pic>0.5,等位基因数na为5个以上、且遗传距离大于0.1以上的群体或个体、中介网络图中纯度高的群体作为鸡育种素材，是因为群体遗传多样性丰富，品种所携带的遗传信息量大，遗传距离大就不存在近亲繁殖，在生产实际出就可以表现出更好的杂交优势，满足优良性状及生产性能的需求。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤2中，所述pcr的反应体系以15μl计为：模板dna50ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix7.5μl，ddh2o补足15μl。

采用上述进一步的有益效果是：2×taqmastermix是由taqdnapolymerase、mg²⁺、dntps、pcr稳定剂和增强剂组成的预混体系。预配好的pcr混合液使操作更加简单快捷，并可最大限度地减少人为误差和污染。

上述2×taqpcrmastermix购自北京康为世纪生物科技有限公司，型号为cw0716m。

进一步，步骤2中，所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

进一步，步骤3中，所述pcr的反应体系以25μl计为：模板80ng-100ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix13μl，ddh2o补足25μl。

进一步，步骤3中，所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

进一步，步骤2和步骤3中，所述琼脂糖凝胶的质量百分数均为1.5％。

进一步，步骤4中，所述多态信息含量pic的计算公式为：

式中，pi、pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，j＝i+1，n为某一基因座上等位基因数。

本发明的有益效果是：

1.本发明是根据畜禽资源的评估结果结合育种目标来畜禽育种素材，为育种素材的选择提供科学准确的基础资料，该方法可实现畜禽早期选择，缩短世代间隔，加速育种进程。

2.本发明通过科学客观地筛选育种素材，提升了选择的准确度，保证育种素材内在的遗传信息。

3.本发明可以减少育种时间、降低成本，提高育种效率。因选择的育种素材具有丰富的遗传信息，培育出的下一代就会带有相应的遗传信息和性状表现，达到育种目的，减少无效实验，减少世代间隔时间，从而减少育种时间，降低育种成本、提高育种效率。

附图说明

图1为广西三黄鸡种的网络结构图。图中cm代表玉林1，zs代表玉林2，jl代表南宁，gd代表岑溪古典三黄鸡，a代表东亚世系，b代表东南亚世系，c代表东亚特有世系，e代表欧美商品鸡世系，f代表云南及相邻地区特有世系，h代表haplogroup(单倍体型)。

图2为广西6个三黄鸡品系的nj系统发生树。图中，nn代表南宁三黄鸡，xy代表玉林兴业三黄鸡，rx代表北流容县三黄鸡，bb代表玉林博白三黄鸡，xd代表贺州信都三黄鸡，gd代表岑溪古典三黄鸡。

图3为广西地方鸡种的网络结构图。图中，ty代表三黄鸡，xy代表霞咽鸡，gx代表广西乌鸡，ma代表麻鸡，nd代表南丹瑶鸡，ls代表龙胜凤鸡。re代表红色原鸡，a代表东亚世系，b代表东南亚世系，c代表东亚特有世系，e代表欧美商品鸡世系。

图4为广西地方鸡种与外来鸡种的分子聚类图。图中，ty代表三黄鸡，xy代表霞咽鸡，ma代表麻鸡，nd代表南丹瑶鸡，gx代表广西乌鸡，ls代表龙胜凤鸡，aa代表艾维因鸡，rm代表罗曼鸡。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：桂凤二号黄鸡育种素材的选择

本实施例的桂凤二号黄鸡育种素材的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：基因组dna的提取

样品来自广西三黄鸡的南宁三黄鸡(nn)60个、玉林兴业三黄鸡(xy)60个、北流容县三黄鸡(rx)60个、玉林博白三黄鸡(bb)60个、贺州信都三黄鸡(xd)60个、岑溪古典三黄鸡(gd)60个等6个品系，共360个样品。

采用dna试剂盒提取，提取上述待测样品血液中的基因组dna。

步骤2：微卫星标记

选择微卫星编号为mcw0123、adl0112、mcw0014、mcw0034、mcw0103、mcw0295、mcw0078、mcw0222、mcw0098、mcw01111、mcw0037、mcw0248、lei0166、adl0268、mcw0216、mcw0020、mcw0206、mcw0183的18对微卫星位点，分别进行pcr-荧光标记-半自动基因组扫描，得到基因组扫描图。

所述pcr的反应体系以15μl计为：模板dna50ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix7.5μl，ddh2o补足15μl。所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

步骤3：mtdnapcr反应及序列测定

mtdnapcr反应的特异性引物包括seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物；且上游引物的5’端用fam荧光标记；

seqidno.1(上游引物)：5’-acccattatatgtatacgggcattaa-3’，

seqidno.2(下游引物)：5’-agttatgcatgggatgtgcctgaccgag-3’；

以步骤1提取的基因组dna为模板，利用上述特异性引物进行pcr扩增；

所述pcr的反应体系以25μl计为：模板80ng-100ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix13μl，ddh2o补足25μl。所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

将pcr扩增产物进行质量百分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，若pcr扩增产物的电泳结果与上述引物对应的dna片段大小一致，则回收纯化，进行pcr产物测序，得到测序序列。

步骤4：统计分析

根据步骤2得到的基因组扫描图，利用genepop32生物软件,统计18对微卫星位点的等位基因数na、有效等位基因数ne、等位基因频率p、观测杂合度ho、预期杂合度he，计算出多态信息含量pic；计算出遗传距离。

其中，多态信息含量pic的计算公式为：

式中，pi、pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，j＝i+1，n为某一基因座上等位基因数。

表1三黄鸡不同保种场微卫星标记多态性

注：表1中，cm代表玉林1，zs代表玉林2，jl代表南宁，gd代表岑溪。

mtdnad-loop序列：以ncbi数据库中登录号为gu261695的红原鸡mtdna全序列作为参考序列，用mega软件对步骤3得到的测序序列进行剪切和比对，查找变异位点，再用dnasp5.0软件计算单倍型数目、单倍型多样性和核苷酸多样性，最后用network软件构建中介网络图。广西三黄鸡种的网络结构图，结果如图1所示。

需要说明的是，图1中，字母a、b、c、e、f是前人按字母命名的各家鸡的世系。根据liu(2006)和miao(2013)等人基于家鸡线粒体全基因组构建的系统发生树，确定世界家鸡及其近缘种红原鸡可分为a、b、c、d、e、f、g、h、i、w和x等11世系。其中，a世系和b世系为东亚和东南亚地区普遍存在的世系，c世系为东亚特有世系，e世系为欧美商品鸡世系，f为云南及相邻地区(如中国广西，越南等)特有世系。

评估鸡种之间的遗传结构：利用遗传距离，构建广西6个三黄鸡品系的nj系统发生树，如图2所示。由图2可知，玉林博白三黄鸡(bb)、北流容县三黄鸡(rx)和玉林兴业三黄鸡(xy)聚为一类，贺州信都三黄鸡(xd)、岑溪古典三黄鸡(gd)聚为一簇；南宁三黄鸡(nn)单独聚为一类。其中，南宁三黄鸡(nn)和玉林兴业三黄鸡(xy)距离最远，遗传变异最大。

步骤5：育种素材选择

根据步骤4的统计分析结果，选择多态信息含量pic>0.5,等位基因数na为5个以上、且遗传距离大于0.1以上的群体作为鸡育种素材。

根据品种评价及检测结果，筛选遗传多样性丰富、遗传距离最远的南宁三黄鸡(nn)和玉林兴业三黄鸡(xy)为桂凤二号黄鸡育种素材。

采用上述桂凤二号黄鸡育种素材培育出的三黄鸡，保持了三黄鸡的体型外貌和肉质好的特性，同时提高了其生产性能，产蛋量达175个，料重比达3.6:1。

实施例2：金陵花鸡育种素材的选择

本实施例的金陵花鸡育种素材的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：基因组dna的提取

样品来自广西三黄鸡(ty)60个，霞咽鸡(xy)60个，麻鸡(ma)60个，南丹瑶鸡(nd)60个，广西乌鸡(gx)60个，龙胜凤鸡(ls)60个，艾维因鸡(aa)50个，罗曼鸡(rm)50个，共8个品种的460个样品。

采用dna试剂盒提取，提取上述待测样品血液中的基因组dna。

步骤2：微卫星标记

选择微卫星编号为mcw0123、adl0112、mcw0014、mcw0034、mcw0103、mcw0295、mcw0078、mcw0222、mcw0098、mcw01111、mcw0037、mcw0248、lei0166、adl0268、mcw0216、mcw0020、mcw0206、mcw0183的18对微卫星位点，分别进行pcr-荧光标记-半自动基因组扫描，得到基因组扫描图。

所述pcr的反应体系以15μl计为：模板dna50ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix7.5μl，ddh2o补足15μl。所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

步骤3：mtdnapcr反应及序列测定

mtdnapcr反应的特异性引物包括seqidno.1所示的上游引物和seqidno.2所示的下游引物；且上游引物的5’端用fam荧光标记；

seqidno.1(上游引物)：5’-acccattatatgtatacgggcattaa-3’，

seqidno.2(下游引物)：5’-agttatgcatgggatgtgcctgaccgag-3’；

以步骤1提取的基因组dna为模板，利用上述特异性引物进行pcr扩增；

所述pcr的反应体系以25μl计为：模板80ng-100ng、上游引物1.0μmol/l、下游引物1.0μmol/l、2×taqpcrmastermix13μl，ddh2o补足25μl。所述pcr的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；之后，72℃延伸5min；4℃保存。

将pcr扩增产物进行质量百分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，若pcr扩增产物的电泳结果与上述引物对应的dna片段大小一致，则回收纯化，进行pcr产物测序进行pcr产物测序，得到测序序列。

步骤4：统计分析

根据步骤2得到的基因组扫描图，利用genepop32生物软件,统计18对微卫星位点的等位基因数na、有效等位基因数ne、等位基因频率p、观测杂合度ho、预期杂合度he，计算出多态信息含量pic；计算出遗传距离。

其中，多态信息含量pic的计算公式为：

式中，pi、pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率，j＝i+1，n为某一基因座上等位基因数。

结果如表2所示。

表2广西地方鸡种的多态性

注：表2中，ty代表三黄鸡，xy代表霞咽鸡，ma代表麻鸡，nd代表南丹瑶鸡，gx代表广西乌鸡，ls代表龙胜凤鸡，aa代表艾维因鸡，rm代表罗曼鸡。

由表2可见，18个微卫星标记均表现出较高的多态性。共检测到144个等位基因，各位点平均等位基因数为8±3.43个，平均有效等位基因为3.59±1.30。单个位点最多可达16个等位基因(mcw0034)，最少的为3个(mcw0103)；而有效等位基因数从1.66(mcw0098)到5.91(mcw0034)不等。18个微卫星位点的观察杂合度(ho)从0.2478(mcw0222)到0.7756(mcw0111)不等，均值为0.5605±0.1673；期望杂合度(he)从0.3998(mcw0098)到0.8322(mcw0034)不等，均值为0.6798±0.1329。

mtdnad-loop序列：以ncbi数据库中登录号为gu261695的红原鸡mtdna全序列作为参考序列，用mega软件对步骤3得到的测序序列进行剪切和比对，查找变异位点，再用dnasp5.0软件计算单倍型数目、单倍型多样性和核苷酸多样性，最后用network软件构建中介网络图。结果如图3所示。

评估鸡种之间的遗传结构：采用structure软件的bayesian聚类方法对个体进行居群分组聚类分析。结果如图4所示。

步骤5：育种素材选择

根据步骤4的统计分析结果，选择多态信息含量pic>0.5,等位基因数na为5个以上，中介网络图中纯度最高的群体作为鸡育种素材。

根据品种评价及检测结果，麻鸡多态信息含量最高，受外来品种基因的侵入小，因此选麻鸡作为金陵花鸡的育种素材。

采用上述金陵花鸡的育种素材培育出的金陵花鸡，保持了麻鸡抗病力强，肉质好的优点，同时鸡群羽毛颜色一致，均匀度可达80％以上。

对比例1桂凤二号黄鸡育种素材的选择

现有技术的桂凤二号黄鸡育种素材的选择，只是在后备鸡群中选择鸡个体体型外貌符合本品种特征的鸡作为育种素材，培育出来的鸡分离严重，后代个体毛色、体重差异大，生产性能未能达到选育目标。

对比例2金陵麻鸡育种素材的选择

现有技术的金陵麻鸡育种素材的选择，只是在后备鸡群中选择鸡个体体型外貌符合本品种特征的鸡作为育种素材，培育出来的鸡分离严重，后代个体毛色、体重差异大，生产性能未能达到选育目标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。