基于Y型DNA结构的microRNA快速检测方法与流程

本发明属于microrna检测技术领域，涉及一种基于y型dna结构的microrna快速检测方法。

背景技术：

microrna是一类非编码单链rna分子，长度大约为22bp，在人体内具有多种复杂的生物调节功能，由于其与多种疾病的发生发展密切相关，因此可以通过检测相应microrna的含量而辅助诊断疾病的进展。目前用于microrna诊断的方法主要有rna印迹法和逆转录pcr，这类传统的方法普遍存在操作过程复杂，易于引入污染致使结果不可控的缺点，极大地限制了microrna检测在临床上的应用。近年来，生物传感器技术以其操作简便、准确度高的优点逐渐应用于检测领域，相应的microrna检测技术也层出不穷。

目前的生物传感器技术大多基于选用新型金属离子材料作为基底或者通过对探针的特殊标记来提高检测的灵敏度，但这两种方法均提高了该技术应用的成本，不利于技术的推广。而dna纳米材料则完全利用dna构建，其具有远超于其他材料的生物相容性和低廉的价格，并且可以获得同样甚至更好的检测效果。其中y型dna是一种制备较为简单的dna纳米材料，其由三条dna单链相互杂交组成，结构的稳定性使其在生物检测领域拥有独特的优势。y型dna目前在生物检测领域多是通过固定一条链，随后将第二条链与待测靶目标一起加入组成y型dna结构从而实现相应信号的改变及获得。这种相对粗糙的方法一方面没有充分发挥该结构在检测特异性方面的优势，另一方面缺少后续的信号放大步骤，难以实现检测的高灵敏度。竞争性的结合方式通过在y型dna结构中引入错配碱基，从而当靶目标出现时可以竞争性结合该部分从而拆解y型dna结构，随后辅以信号放大机制则可以最大限度地发挥这种dna结构的优势。然而目前，运用这种方法综合考虑y型dna结构特异性和灵敏度两方面的microrna检测技术目前还未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于y型dna结构的microrna快速检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

y型dna结构，是由三条部分互补的dna单链杂交而得，它们的核苷酸序列如下：

h1:5’-tggatccgcatgatctcggtctgactagttgatgaagctg-3’，如seqidno.1所示；

h2:5’-gtcgaagtagttgatccattgcactttcatgcggatcca-3’，如seqidno.2所示；

h3:5’-tcagaccgagacaagtgcaatg-3’，如seqidno.3所示。

上述y型dna结构的制备方法，是将上述三条dna单链杂交而得，杂交条件为：95℃变性2分钟，65℃变性5分钟，随后降至60℃保持2分钟，然后以1℃/min的速度缓慢降温至20℃。

优选的，所得y型dna结构于4℃保存。

基于上述y型dna结构的microrna快速检测方法，包括步骤：

(1)y型dna结构的拆解：将y型dna结构与microrna混合，孵育，y型dna结构被拆解；

(2)信号放大过程：将s1、s2、a1、a2与拆解后的y型dna结构混合孵育，实现信号放大过程；其中，s1是通过s1a和s1b混合反应得到，s2是通过s2a和s2b混合反应得到，s1a、s1b、s2a、s2b、a1、a2的核苷酸序列如seqidno.4～9所示；

s1a:gtgtgcctattatgtctcctcctgtgtgcctattatgtctcctcctcagcttcatcaactagtcagacc，如seqidno.4所示；

s1b:gactagttgatgaagctggacataataggcacacgacataataggcacac，如seqidno.5所示；

s2a:aggaggagacataataggcacacccacaaactagttgatgaagctg，如seqidno.6所示；

s2b:cagcttcatcaactaggtgtgcctattatgtctc，如seqidno.7所示；

a1:gtgcctattatgtcgtgtgcctattatgtccagctt，如seqidno.8所示；

a2:gcacacctagttgatgaagc，如seqidno.9所示；

(3)电化学检测。

优选的，所述microrna为mir-25。

优选的，步骤(1)的具体方法是：y型dna结构与microrna等体积等浓度混合，然后溶于缓冲液中，37℃孵育2小时后，y型dna结构被拆解。

进一步优选的，所述缓冲液的组成为：1mmtris-hcl，25mmnacl，1mmedta。

优选的，步骤(2)中，s1的制备方法如下：将s1a和s1b混合溶于缓冲液中，95℃变性5分钟，随后缓慢降温至4℃，得s1。

进一步优选的，所述缓冲液的组成为：40mmtris-base,20mm醋酸,2mmedta,12.5mm醋酸镁。

优选的，步骤(2)中，s2的制备方法如下：将s2a和s2b混合溶于缓冲液中，95℃变性5分钟，随后缓慢降温至4℃，得s2。

进一步优选的，所述缓冲液的组成为：40mmtris-base，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁。

优选的，步骤(2)中，孵育条件为：37℃孵育3小时。

优选的，步骤(3)的具体方法是：

采用辰华chi760e型号电化学传感器平台，选用三电极系统，金电极作为工作电极，铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，检测均在5m铁氰化钾溶液中，循环伏安法扫描电压为-0.2～0.6v，扫描速率为100mv/s，阻抗谱频率范围为0.1hz～100khz，差分脉冲伏安法检测扫描电压为-0.2～0.6v，脉冲幅度为50mv，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为0.1s；通过循环伏安法和阻抗谱表征电极表面的反应过程，差分脉冲伏安法得到的电流变化用于反应结果的定量计算；分别检测加入靶标rna后和信号扩增反应后的差分脉冲伏安法信号数值，计算δi/i作为信号变化的定量指标。

本发明的有益效果在于：

本发明检测的靶物质为microrna，与dna、微生物等相比，更加不稳定，microrna在空气中很快会被降解，检测难度大。本发明依据的是当待测靶目标出现后y型探针结构被拆解。由于dna碱基杂交时并不是完全互补配对，因此即使有个别碱基不互补，两条dna链之间的杂交依然可以实现，因此其特异性方面不能实现微小差异的识别，而竞争性结合的方式，则必须满足两条链之间完全互补结合才能够实现，因此对于检测的特异性更有保证。实验结果也表明本发明可以实现对单碱基突变等微小差异的识别(设计与mir-25存在单个碱基突变、两个碱基突变、三个碱基突变的序列，进行上述检测实验。所得结果如图3所示，在相同浓度下，单碱基突变产生的信号变化明显低于正常mir-25)。

本发明在识别靶目标之后，可以启动后续的信号放大过程，能够实现更高的检测灵敏度。具体来说：y型dna结构末端为信号放大过程的启动序列，当microrna将其拆解后，本来被保护在结构内部的启动序列暴露，引发后续非线性杂交链式反应，具有更广的线性范围和更低的检测限。

本发明在无酶无标记无其他材料修饰的情况下，即可完成对microrna的检测，在操作的简单性及性价比上具有较大的优势。

具体优势如下：

1)检测灵敏度高：线性检测范围为1fm-10pm，最低检测限为0.3334fm；

2)检测特异性好：可以实现对单碱基突变、多碱基突变以及其他不同种类microrna的检测；

3)可以用于检测临床血清标本。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为聚丙烯酰氨凝胶电泳图，其中泳道1：h1，泳道2：h1+h2，泳道3：h1+h2+h3，即y型dna，泳道4：加入mir-25致使y型dna结构被拆解，泳道5：被拆解后的y型dna结构启动信号放大过程，泳道6：未被拆解的y型dna结构及非线性杂交链式反应所需序列(s1、s2、a1、a2)，即阴性对照。

图2为电化学传感器表征图，a为循环伏安法，b为电化学阻抗谱。图中曲线a为裸金电极所产生的电信号，b为固定y型dna后，c为mch封闭后，d为加入mir-25拆解y型dna结构后，e为被拆解的y型dna结构启动非线性杂交链式反应后的信号放大图。

图3为本发明的检测应用于碱基突变的检测结果，a为mir-25产生的信号变化，b为单碱基突变后的mir-25产生的信号变化，c为包含有两个碱基突变的mir-25产生的信号变化，d为包含有三个碱基突变的mir-25产生的信号变化，e为空白对照。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1y型dna结构的获得

y型dna结构是由三条不分互补的单链相互杂交而成，分别是

h1:5’-tggatccgcatgatctcggtctgactagttgatgaagctg-3’

h2:5’-gtcgaagtagttgatccattgcactttcatgcggatcca-3’，

h3:5’-tcagaccgagacaagtgcaatg-3’，其中，h3是根据mir-25进行设计的，两者之间完全互补。而在组成y型dna结构时，h3一半与h1杂交、另一半与h2杂交，其中，h3与h2杂交的部分存在1个碱基的缺失，以便于提高竞争性结合时的效率。h1、h2链分别在3’或5’端有一端启动序列，可以启动后续的信号放大反应，但在y型dna结构被拆解之前，这段启动序列有一部分被h3杂交，使得整段启动序列无法发挥作用。y型dna结构形成的条件为95℃变性2分钟，65℃变性5分钟，随后降至60℃保持2分钟，然后以1℃/min的速度缓慢降温至20℃，将获得的y型dna结构4℃保存。

杂交形成的y型dna结构经过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，如图1中的1、2、3泳道分别为h1、h1+h2和h1+h2+h3，可见三条泳道中的条带位置不同，且符合碱基数逐渐增多的规律。除此之外，为能够定量的检测信号的变化，我们选取电化学传感器作为感受信号变化的平台，将利用tcep(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)活化的y型dna结构通过金硫键固定在电极表面，反应条件为37℃过夜孵育，随后通过循环伏安法和电化学阻抗谱对电极表面进行表征，如图2中b曲线，作为y型dna固定于电极表面的基础信号，为后续的反应过程提供对照。

实施例2y型dna结构的拆解

y型dna当在mir-25出现之后，h3链由于其可以与mir-25完全杂交，而h2链则与h3之间存在1个碱基的缺失，故而可以将h3从y型dna结构上竞争下来，反应条件为37℃孵育2小时，从而使得y型dna结构被拆解，而其末端的启动序列也被暴露出来。该过程同样由聚丙烯酰氨凝胶电泳验证，如图1中第4泳道即为y型dna结构被拆解后的条带分布，可见原有的y型dna结构对应的条带亮度明显减少，而同时出现了一条较短的序列对应的条带，即为mir-25与h3杂交的产物。另一方面，在电化学传感器验证过程中，首先将电极表面滴涂mch(巯基己醇)以封闭表面未固定有y型dna结构的空白位点，利用循环伏安法和阻抗谱进行表征，可得曲线c，随后将电极浸泡于含有一定量mir-25的缓冲液当中，反应条件依然为37℃孵育2个小时，同样得到曲线d，可见相较于曲线c，y型dna结构被mir-25拆解之后，产生的阻抗变小，因其表面结构的改变使得对电流的影响变小。

实施例3信号放大过程

非线性链式杂交反应作为本发明选用的信号放大过程，具有无酶、恒温、效率高的特点。y型dna结构被拆解后暴露出的启动序列可以与s1中的s1a部分结合，从而替代部分s1b，而此时由于部分s1b处于游离状态，故而可以与a1杂交，进而整条s1b被从s1中拆解下来，而暴露的s1a则包含有两段序列可以与s2a部分结合，同理可将s2b从s2中拆解下来，而同时暴露的s2a则含有与之前相同的启动序列，可以继续启动s1，如此反复，即可实现信号的放大。反应条件为事先将进行信号放大反应的s1a和s1b混合溶于缓冲液中，95℃变性5分钟，随后缓慢降温至4℃，得s1，同理可得s2。随后，将s1、s2、a1、a2与拆解后的y型dna结构混合，37℃孵育3小时。该过程同样可利用聚丙烯酰氨凝胶电泳验证，如图1中第5、6泳道所示，其中5泳道即为将被拆解后的y型dna结构启动非线性杂交链式反应后的条带，而6泳道为未被拆解的y型dna结构与s1、s2、a1、a2混合后的条带，两者对比可明显发现被拆解后的y型dna结构启动了后续的信号放大反应，而未被拆解的y型dna结构则没有。同样，在电化学传感器验证过程中，将表面固定有被拆解的y型dna的电极浸泡于含有s1、s2、a1、a2的缓冲液当中，37℃孵育3小时，测得其循环伏安法和阻抗谱，如图2中曲线e，可见经过信号放大过程之后，信号改变明显，从而提升了反应的灵敏度。

实施例4临床血清样本检测

取正常人全血静置1小时使其分层，吸取上层清液即为血清，由于其中所含蛋白质较高，对电极表面吸附性太强，故将血清稀释十倍备用。为能准确评价这一新技术对于临床标本检测的准确性，将特定浓度的mir-25(最终换算得到表1中的实际浓度)加入到稀释好的血清当中作为待测样本。检测过程为：首先制备y型dna结构，并将其固定在电极之上，随后将电极浸泡在准备好的待测样本当中，37℃孵育2小时，之后将电极用清水冲洗后浸泡入含有s1、s2、a1、a2的缓冲液(与合成s1、s2时的缓冲液相同：40mmtris-base，20mm醋酸，2mmedta，12.5mm醋酸镁)当中，37℃孵育3小时，测得其循环伏安法和阻抗谱，如表1所示，检测结果与实际添加的浓度差异在5.61％以内，证明该方法可以应用与临床检测过程。

表1.本发明临床模拟标本的检测浓度与实际浓度对比

实施例5灵敏度检测

将mir-25从10pm梯度稀释至1fm，将其经过上述检测过程，根据差分脉冲伏安法得到信号变化的定量结果。可以将结果拟合为-δi/i＝0.03252lgc+0.3121，其中，-δi/i表示信号变化，c表示mir-25的浓度，同时测定11次空白样本的结果，按照信噪比s/n＝3，计算得到最低检测限为0.3334fm。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120>基于y型dna结构的microrna快速检测方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggatccgcatgatctcggtctgactagttgatgaagctg40

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtcgaagtagttgatccattgcactttcatgcggatcca39

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcagaccgagacaagtgcaatg22

<210>4

<211>69

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtgtgcctattatgtctcctcctgtgtgcctattatgtctcctcctcagcttcatcaact60

agtcagacc69

<210>5

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gactagttgatgaagctggacataataggcacacgacataataggcacac50

<210>6

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aggaggagacataataggcacacccacaaactagttgatgaagctg46

<210>7

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cagcttcatcaactaggtgtgcctattatgtctc34

<210>8

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gtgcctattatgtcgtgtgcctattatgtccagctt36

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gcacacctagttgatgaagc20