一种基于II型内含子的基因编辑方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于ii型内含子的基因编辑方法。

背景技术：

ii型内含子（groupiiintron）是一类反转录转座子，主要存在于细菌以及部分高等生物的细胞器中。ii型内含子是由具有催化功能的内含子rna（即核酶）和具有反转录酶活性的内含子编码蛋白（iep）两部分组成，可通过“归巢”机制高频插入到特定dna靶位点。其中，内含子rna通过碱基互补配对原则识别并切割dna靶位点，内含子编码蛋白则通过稳定活性rna的结构而辅助内含子rna的剪接和整合。内含子编码蛋白还具有反转录酶活性，能够以插入的内含子rna为模板，反转录合成互补dna，从而将内含子rna整合到dna靶位点，其具体过程如图1所示，通过这种机制，ii型内含子可以高效插入到dna靶位点。

由于ii型内含子对dna靶位点的识别主要是通过内含子rna的碱基配对来实现的，而且ii型内含子在dna靶位点的插入具有高度专一性和高效性，因此可以利用ii型内含子的这些特性，设计基因打靶载体，通过修饰内含子rna的碱基序列实现靶向中断特定基因的表达。利用ii型内含子“归巢”的特性，目前已建立起高效基因打靶技术—targetron技术。该技术具有打靶精度高、易操作、成本低廉的特点，在革兰氏阴性菌（如：大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（如：金黄色葡萄球菌）的遗传改造中均获得广泛应用。而且，由于targetron的高效打靶效率，该技术尤其适用于难改造的革兰氏阳性厚壁梭菌，如：肉毒梭菌、艰难梭菌、丙酮丁醇梭菌，解纤维梭菌等，该技术在梭菌中也称为clostron技术。

然而，targetron技术只能实现了基因的“有疤”失活，不能实现“无痕”基因敲除和敲入。这是由于ii型内含子的iep蛋白具有反转录活性，在形成双链断裂的同时，以内含子rna为模板合成cdna，并插入到dna断裂处，从而以在dna靶位点插入一段内含子序列的方式实现靶基因的“有疤”失活。

基因组编辑的本质是在dna靶位点引入双链dna断裂，激发dna修复机制，然后利用宿主的损伤修复机制实现目的基因的敲除、敲入、突变等功能。因此，如何在靶位点引入双链dna断裂，造成dna损伤，是实现高效基因组编辑的前提。

野生型ii型内含子在识别、切割dna靶位点之后，利用iep蛋白的反转录酶活性将内含子rna插入到dna内部，实现内含子在染色体上的“归巢”，因此会在靶位点留下“疤痕”（图1）。要利用ii型内含子技术实现基因的定点“无痕”敲除、敲入、突变等多项功能，必须对ii型内含子的功能元件进行改造，在保留内含子识别切割dna特性的同时，阻断其“归巢”途径，在靶位点获得dna双链缺口，然后通过非同源末端连接或同源重组机制进行dna损伤修复，最终实现目标基因的“无痕”编辑。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种能实现任意基因编辑，具有无疤、高效、靶向精确的基于ii型内含子的基因编辑方法。

本发明的技术方案是：一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：

（1）脱水四环素诱导的ii型内含子表达载体psy11的构建及诱导表达；

（2）内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变；

（3）ii型内含子基因编辑载体的设计及构建。

上述的一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，其中脱水四环素诱导的ii型内含子表达载体psy11的构建及诱导表达方法为：

以来源于质粒pgusa2-2teto1的脱水四环素操纵子为模板，利用引物tetr-u（tcgacggatccccgggaactcgacatcttggttaccg）和tetr-d（gatagagtcctaggccaggtcgatcgattatattgataaaaataataatagtgg）及引物pcm-teto1-u（caatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatc）和pcm-teto1-d（gataattatctcgagcatatgaactaacctcctaaactagttacc），分别扩增阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子，然后利用重叠延伸pcr将阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子组装为脱水四环素操纵子。

上述的一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，其中内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变方法为：

a）利用xmai和xhoi双酶切，将脱水四环素操纵子与来源于psy6载体的乳酸乳球菌ii型内含子（ll.ltrb）的内含子rna与内含子编码蛋白（ltra,genbank:aku48235.1）连接，构建脱水四环素诱导的psy11基因编辑载体。（见附图3及序列文件）；

b）利用ncbi数据库及同源序列比对方法，以内含子编码蛋白（ltra,genbank:aku48235.1）为模板，对内含子编码蛋白进行序列分析及结构模拟，筛选影响ii型内含子编码蛋白反转录功能的关键氨基酸位点，筛选获得的活性位点包括：d160、i161、k162、g163、c164、f165、q213、g214、y306、d308、d309、l357、g358；

c）对筛选到的关键氨基酸位点分别进行定点突变，突变位点包括13个单突变：d160a、i161a、k162a、g163a、c164a、f165a、q213a、g214a、y306a、d308a、d309a、l357a、g358a，2个双突变：d308a’d309a、d308k’d309k。

上述的一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，其中ii型内含子基因编辑载体的设计及构建方法为：将上述突变型内含子编码蛋白分别取代psy11基因编辑载体上的野生型内含子编码蛋白，构建无反转录活性的基因编辑载体psy11-mx，mx代表含有上述不同突变位点的载体。例如：psy11-d160a，表示psy11载体的内含子编码蛋白含有一个d160a点突变。

上述的一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，其中：所述ii型内含子基因编辑载体，该载体主要应用于微生物细菌领域的基因工程改造。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明利用ii型内含子的“归巢”依赖于iep蛋白的反转录功能。iep蛋白是ii型内含子的关键功能元件，属于多功能酶，具有反转录酶、成熟酶（促进rna剪接及稳定rna结构）和核酸内切酶（协助内含子迁移）等多种活性，在ii型内含子“归巢”的各步中起到重要作用。从结构上看，iep蛋白包括四个相对独立的功能区域：反转录功能域、dna结合域、核酸内切酶区域和未知功能区域，其中反转录酶活性主要由反转录功能域行使，因此，iep蛋白反转录功能的失活在理论上不会影响其他结构域的活性，即：可以获得新型的iep蛋白，仅失去反转录酶活性，仍保留辅助rna折叠、成熟、靶位点识别、切割等其他功能。利用该新型iep蛋白就能阻断ii型内含子固有的“归巢”途径，在不留下插入序列“疤痕”的条件下获得dna双链断裂，最终实现基因的定点、“无痕”敲除或敲入（图2）。

本发明通过对乳酸乳球菌（lactococcuslactis）ii型内含子编码蛋白（ltra）的设计及改造，失活了内含子编码蛋白的反转录活性，阻断了其“归巢”功能，从而可以在靶位点引入dna损伤。然后利用宿主自身的修复机制，从而实现靶基因的任意编辑（原理见图2）。本发明基因编辑载体以内含子rna为指导，具有无疤、高效、靶向精确等特点，为生命科学研究增添了新的基因组编辑工具。

附图说明

图1为ii型内含子“归巢”原理示意图；

图2为构建的基于ii型内含子的基因组编辑方法原理示意图；

图3为脱水四环素诱导的ii型内含子表达载体psy11；

图4为重叠延伸pcr扩增retargetedintron序列示意图；

图5为预测的影响ii型内含子编码蛋白反转录功能的氨基酸位点；

图6为内含子编码蛋白反转录功能结构域关键氨基酸位点突变对ii型内含子“归巢”功能的影响；

图7为基于ii型内含子的新型基因组编辑方法在大肠杆菌pyrf79a位点引入dna突变情况；

图8为基于ii型内含子的新型基因组编辑方法在大肠杆菌lacz1063a位点引入dna突变情况。

具体实施方式

实施例1：

一种基于ii型内含子的基因组编辑方法，包括以下步骤：

（1）脱水四环素诱导的ii型内含子表达载体psy11的构建。

a）以质粒pgusa2-2teto1为模板，以tetr-u（tcgacggatccccgggaactcgacatcttggttaccg）和tetr-d（gatagagtcctaggccaggtcgatcgattatattgataaaaataataatagtgg）为引物进行pcr扩增，pcr扩增条件为：94℃预变性5min,进行以下循环：94℃变性30s;60℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环，72℃终延伸10min，最终获得约0.7kb的tetr阻遏蛋白；以质粒pgusa2-2teto1为模板，以pcm-teto1-u（caatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatc）和pcm-teto1-d（gataattatctcgagcatatgaactaacctcctaaactagttacc）为引物进行pcr扩增，pcr扩增条件为：94℃预变性5min,进行以下循环：94℃变性30s;60℃退火30s；72℃延伸0.5min；30个循环，72℃终延伸10min，最终获得约0.13kb的脱水四环素诱导型启动子pcm-teto1；然后，以上述扩增获得的两个pcr产物为模板，以pcm-teto1-u（caatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatc）和tetr-d（gatagagtcctaggccaggtcgatcgattatattgataaaaataataatagtgg）为引物，利用重叠延伸pcr方法，重叠延伸pcr条件为：96℃预变性5min，进行以下循环：96℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸1min；30个循环，72℃终延伸10min。pcr扩增结束后琼脂糖凝胶电泳，回收0.83kb脱水四环素诱导型操纵子。

b）以psy6质粒为骨架，其上包含来源于乳酸乳球菌ii型内含子（ll.ltrb）的内含子rna与内含子编码蛋白（ltra,genbank:aku48235.1），利用xmai和xhoi限制性内切酶分别双酶切脱水四环素操纵子和psy6质粒，t4dna连接酶连接后获得脱水四环素诱导的psy11质粒。psy11质粒的tetr阻遏蛋白位于组成型的硫激酶启动子（pthl）控制之下，内含子rna位于脱水四环素诱导型启动子（pcm-teto1）控制之下。其中，内含子rna的retargetedintron区域为内含子rna的可置换区域，该区域包含识别靶位点的核心序列，根据不同的识别位点更换不同的识别序列，从而实现任意基因的打靶，psy11图谱见图3及序列文件。

（2）内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选及突变载体构建。

a）利用ncbi数据库及同源序列比对方法，以内含子编码蛋白（ltra,genbank:aku48235.1）为模板，对内含子编码蛋白进行序列及结构分析，筛选影响ii型内含子编码蛋白反转录功能的关键氨基酸位点。图5为预测的影响ii型内含子编码蛋白反转录功能的氨基酸位点（亮黄色背景序列），最终筛选获得的活性位点包括：d160、i161、k162、g163、c164、f165、q213、g214、y306、d308、d309、l357、g358。

b）对筛选到的关键氨基酸位点进行定点突变，突变位点包括13个单突变：d160a、i161a、k162a、g163a、c164a、f165a、q213a、g214a、y306a、d308a、d309a、l357a、g358a，2个双突变：d308a’d309a、d308k’d309k。

c）以质粒psy11质粒为模板，iep-f（atcgaggctagcgctatatgcgttgatg）和iep-r（cgttccagatctccttactcgta）为引物，利用taqdna聚合酶进行pcr扩增（扩增条件为：预变性：95℃3min；变性：95℃30s；退火：55℃30s；延伸：72℃，1.5min；终延伸：72℃，5min；共30个循环），获得1.2kbiep蛋白部分序列（包含拟突变核苷酸位点），将获得pcr产物与pmd19t载体连接获得pmd19t-iep载体。

d）以pmd19t-iep为模板，以定点突变引物为引物，扩增整个质粒。扩增条件为：95℃3min；95℃30s，55℃1min，72℃4min；共15个循环。反应结束后，pcr产物用dpni消化除去甲基化的质粒模板；然后，转化e.colidh5α，测序获得突变型pmd19t-m-iep质粒。

e）用nhei和bglii双酶切pmd19t-m-iep质粒，回收1.2kb目的片段（含有突变位点的iep蛋白部分序列）与经同样双酶切的psy11载体连接，获得内含子编码蛋白反转录催化位点突变的基因编辑载体psy11-mx。

（3）靶基因识别序列设计及打靶载体构建

a）利用在线设计软件（www.clostron.com）设计靶基因识别引物，每一打靶位点获得四种引物，分别为ibs引物，ebsu引物，ebs2引物，ebs1d引物，其中ibs、ebs2和ebs1d引物含有不同的识别序列，ebsu引物为通用引物。ibs引物和ebs1d引物两段各加入xhoi和bsrgi酶切位点。

b）以psy11质粒上的内含子rna所在序列为模板，分别以上述设计的靶基因识别引物为引物，利用重叠延伸pcr方法扩增获得0.35kb指导rna序列，所用引物及pcr扩增示意图如图4所示。

c）用xhoi和bsrgi分别双酶切pcr产物和psy11-mx载体，将上述酶切获得的0.35kbpcr产物取代psy11-mx载体上的retargetedintron序列（图3），即可以得到在靶位点切割的ii型内含子基因编辑载体。

d）转化大肠杆菌bl21（de3），涂布含有诱导剂脱水四环素（或四环素）的筛选培养基（诱导剂浓度为0.1ug/ml-2.0ug/ml，氨苄青霉素浓度为100ug/ml），挑取单菌落进行菌落pcr检测及序列分析，分析靶基因突变状况。

e）当进行基因取代或基因插入时，在psy11-mx载体的xmal位点上构建同源序列，利用同源重组即可在靶位点实现基因取代或基因插入。

实施例2：

一种大肠杆菌的基于ii型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：

（1）以大肠杆菌基因为靶基因，选择不同位点为靶位点，用在线设计软件（www.clostron.com）设计靶基因识别引物；

（2）以psy11的内含子rna所在区域序列为模板，分别以上述设计靶基因识别引物为引物，利用重叠延伸pcr方法（图4）扩增获得0.35kb指导rna序列；

（3）用xhoi和bsrgi分别双酶切pcr产物和psy11-mx载体，将上述酶切获得的0.35kbpcr产物取代psy11-mx载体上的retargetedintron序列，即可以得到在靶位点切割的ii型内含子基因编辑载体；retargetredintron区是指导rna区域，更换不同的retargetredintron序列，可以实现不同靶位点的识别和切割；

（4）转化大肠杆菌bl21（de3），涂布含有诱导剂脱水四环素（或四环素）的筛选培养基（诱导剂浓度为0.1ug/ml-2.0ug/ml，氨苄青霉素浓度为100ug/ml），挑取单菌落进行菌落pcr检测及序列分析，分析靶基因突变状况；

（5）当进行基因取代或基因插入时，在psy11-mx载体的xmal位点上构建同源序列，利用同源重组即可在靶位点实现基因取代或基因插入。

试验例1：iep蛋白反转录结构域关键氨基酸位点突变对ii型内含子“归巢”效率的影响。

以大肠杆菌pyrf79a位点为例，利用在线软件（www.clostron.com）设计大肠杆菌pyrf79a位点的打靶引物，引物序列如下：（ebsu：cgaaattagaaacttgcgttcagtaaac；pyrf-79a-ibs:gggcataactcgagataattatccttacagcgcgtcatcgtgcgcccagatagggtg；pyrf-79a-ebs1d:ggcagattgtacaaatgtggtgataacagataagtcgtcatcactaacttacctttctttgt；pyrf-79a-ebs2:tgaacgcaagtttctaatttcggttcgctgtcgatagaggaaagtgtct）。利用图4所示的重叠延伸pcr方法，扩增获得0.35kb的retargetedintron序列。然后，用xhoi和bsrgi分别双酶切pcr产物和psy11载体，连接得到pyrf79a位点的ii型内含子打靶载体。

以筛选到c164、g214、d308、d309位点为例，设计突变引物，构建iep蛋白突变型打靶载体。突变引物设计如下：c164k突变引物（c164k-f：gccttttatatctccctccac；c164k-r：aaattcgataatatagaccacgttac）；c164d突变引物（c164d-f：gccttttatatctccctccac；c164d-rgacttcgataatatagaccacgttac）；g214w突变引物（g214w-f：tggggaattctatctcctcttttgg；g214w-r：ttgaggtgttccgctgtaag）；d308k突变引物（d308k-f：cgcataccggacgtatttc；d308k-r：aaagacttcattatctctgttaaagg）；d308a突变引物（d308a-f：cgcataccggacgtatttc；d308a-r：gctgacttcattatctctgttaaagg）；d309k突变引物（d309k-f：aaattcattatctctgttaaagg；d309k-r：gtccgcataccggacgtatttc）；d309a突变引物（d309a-faaattcattatctctgttaaagg；d309a-r：gctttcattatctctgttaaagg）；d308k`d309k双突变引物（d308k`d309k-f：cgcataccggacgtatttc；d308k`d309k-r：aaaaaattcattatctctgttaaagg）；d308a`d309a双突变引物（d308a`d309a-f：cgcataccggacgtatttc；d308a`d309a-r：gctgctttcattatctctgttaaagg）。

利用上述突变引物，构建psy11-c164k、psy11-c164d、psy11-g214w、psy11-d308k、psy11-d308a、psy11-d309k、psy11-d309a、psy11-d308k`d309k、psy11-d308a`d309a突变载体。将上述突变载体转化e.colibl21(de3)，脱水四环素（0.5ug/ml）诱导，涂布氨苄青霉素平板（100ug/ml）；利用菌落pcr方法验证并进行测序分析。菌落pcr及测序结果表明，构建所有突变载体均不能在靶位点实现内含子的插入，插入效率为0，证明iep蛋白反转录结构域关键氨基酸位点突变失活了ii型内含子的“归巢”功能。图6表示内含子编码蛋白部分氨基酸位点突变后，内含子在靶位点“归巢”的pcr电泳图。归巢位点是pyrf79a，其中，ct表示野生型对照，条带大小为1.4kb；c164k、c164d、g214w、d308k、d308a、d309k、d309a、d308k`d309k、d308a`d309a分别表示不同的氨基酸突变位点，内含子编码蛋白突变后，影响了其反转录功能，ii型内含子不能在靶位点“归巢”，因此条带大小为0.4kb左右。

试验例2：以大肠杆菌pyrf79a位点为例，验证基于ii型内含子的基因编辑方法在靶位点引入dna突变的效率。

以上述构建的psy11-d308a’d309a突变载体为例，检测其在大肠杆菌pyrf79a位点引入dna突变的效率。将psy11-d308a’d309a质粒转化e.colibl21(de3)，涂布含5-foa（1.2mg/ml）和不含5-foa的平板，分别用脱水四环素（0.5ug/ml）诱导，筛选在5-foa平板上长出的菌落进行菌落pcr验证和测序分析。结果表明，利用d308a’d309a双突变构建的突变型ii型内含子，在pyrf79a位点引入dna突变的效率为2.2±0.3%。图7中dna序列是在含有5-foa平板上随机挑取的单菌落进行dna测序得到的序列结果。此结果代表d308a’d309a双突变型ii型内含子在大肠杆菌bl21（de3）的pyrf79a位点随机引入的dna序列的改变。

试验例3：以大肠杆菌lacz1063a位点为例，验证基于ii型内含子的基因编辑方法在靶位点引入dna突变的效率。

利用图4所示的重叠延伸pcr方法，根据打靶载体构建方法，以下面四种引物：（ebsu：cgaaattagaaacttgcgttcagtaaac；lacz-1063a-ibs：gcaaaactcgagataattatccttacgtgacggttaagtgcgcccagatagggtg；lacz-1063a-ebs1d：ccagattgtacaaatgtggtgataacagataagtcggttaacgtaacttacctttctttgt；lacz-1063a-ebs2：tgaacgcaagtttctaatttcggtttcacgtcgatagaggaaagtgtct）为引物，扩增获得0.35kb的lacz1063a位点打靶引物。然后，用xhoi和bsrgi分别双酶切pcr产物和psy11-d309a、psy11-d308a’d309a载体，连接得到lacz1063a位点的ii型内含子基因编辑载体。转化e.colibl21(de3)，涂布含有脱水四环素（0.5ug/ml）和氨苄青霉素（100ug/ml）的平板，利用蓝白斑筛选和测序方法筛选并计算ii型内含子在靶位点引物突变的。结果表明，利用psy11-d309a单突变、d308a’d309a双突变构建的突变型ii型内含子，在lacz1063a位点引入dna突变的效率为9.0±1.9%。图8中dna序列是在平板上随机挑取的白色菌落进行dna测序得到的序列结果。突变1和2代表d309a单突变型ii型内含子在大肠杆菌bl21（de3）的lacz1063a位点随机引入的dna序列的改变，突变3代表d308a’d309a双突变型ii型内含子在大肠杆菌bl21（de3）的lacz1063a位点随机引入的dna序列的改变。

试验例4：以大肠杆菌lacz635s位点为例，验证基于ii型内含子的新型基因编辑方法在靶位点引入dna突变的效率。

利用图4所示的重叠延伸pcr方法，根据打靶载体构建方法，以下面四种引物：（ebsu：cgaaattagaaacttgcgttcagtaaac；lacz-635s-ibs：gcaaaactcgagataattatccttacatttcccgtgagtgcgcccagatagggtg；lacz-635s-ebs1d：ccagattgtacaaatgtggtgataacagataagtcccgtgacgtaacttacctttctttgt；lacz-635s-ebs2：tgaacgcaagtttctaatttcggttaaatgtcgatagaggaaagtgtct）为引物，扩增获得0.35kb的lacz635s位点打靶引物。然后，用xhoi和bsrgi分别双酶切pcr产物和psy11-d308a’d309a载体，连接得到lacz635s位点的ii型内含子基因编辑载体。转化e.colibl21(de3)，涂布含有脱水四环素（0.5ug/ml）和氨苄青霉素（100ug/ml）的平板，利用蓝白斑筛选和测序方法筛选并计算ii型内含子在靶位点引入突变的效率。结果表明，利用d308a’d309a双突变构建的突变型ii型内含子，在lacz635s位点引入dna突变的效率为2.0±0.9%。

psy11基因编辑载体序列：

aaagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaactcgacatcttggttaccgtgaagttaccatcacggaaaaaggttatgctgcttttaagacccactttcacatttaagttgtttttctaatccgcatatgatcaattcaaggccgaataagaaggctggctctgcaccttggtgatcaaataattcgatagcttgtcgtaataatggcggcatactatcagtagtaggtgtttccctttcttctttagcgacttgatgctcttgatcttccaatacgcaacctaaagtaaaatgccccacagcgctgagtgcatataatgcattctctagtgaaaaaccttgttggcataaaaaggctaattgattttcgagagtttcatactgtttttctgtaggccgtgtacctaaatgtacttttgctccatcgcgatgacttagtaaagcacatctaaaacttttagcgttattacgtaaaaaatcttgccagctttccccttctaaagggcagaagtgagtatggtgcctatctaacatctcaatggctaaggcgtcgagcaaagcccgcttattttttacatgccaatacaatgtaggctgctctacacctagcttctgggcgagtttacgggttgttaaaccttcgattccgacctcattaagcagctctaatgcgctgttaatcactttacttttatctaatctagacattctaactaacctcctaacaacttaattatacccactattattatttttatcaatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatcattgatagagtataatatctttgttcattagagcgataaacttgaatttgagagggaacttagatggtaactagtttaggaggttagttcatatgctcgagataattatccttaccagcccatagggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagtagtttaaggtactactctgtaagataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaagctgatacgggaacagagcacggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggtacgactgagtcgcaatgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagtttctaatttcggttgctggtcgatagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggtaagttaagcctatggacttatctgttatcaccacatttgtacaatctgtaggagaacctatgggaacgaaacgaaagcgatgccgagaatctgaatttaccaagacttaacactaactggggataccctaaacaagaatgcctaatagaaaggaggaaaaaggctatagcactagagcttgaaaatcttgcaagggtacggagtactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtactaaaattaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcgacgcgttgggaaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacgaacaataacagagccgtatactccgagaggggtacgtacggttcccgaagagggtggtgcaaaccagtcacagtaatgtgaacaaggcggtacctccctacttcaccatatcattttctgcagccccctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatatggctagatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcactcgtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtactaaaattaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtccagatatttattacgtggcgtatcaaaatttatattccaataaaggagcttccacaaaaggaatattagatgatacagcggatggctttagtgaagaaaaaataaaaaagattattcaatctttaaaagacggaacttactatcctcaacctgtacgaagaatgtatattgcaaaaaagaattctaaaaagatgagacctttaggaattccaactttcacagataaattgatccaagaagctgtgagaataattcttgaatctatctatgaaccggtattcgaagatgtgtctcacggttttagacctcaacgaagctgtcacacagctttgaaaacaatcaaaagagagtttggcggcgcaagatggtttgtggagggagatataaaaggctgcttcgataatatagaccacgttacactcattggactcatcaatcttaaaatcaaagatatgaaaatgagccaattgatttataaatttctaaaagcaggttatctggaaaactggcagtatcacaaaacttacagcggaacacctcaaggtggaattctatctcctcttttggccaacatctatcttcatgaattggataagtttgttttacaactcaaaatgaagtttgaccgagaaagtccagaaagaataacacctgaatatcgggagctccacaatgagataaaaagaatttctcaccgtctcaagaagttggagggtgaagaaaaagctaaagttcttttagaatatcaagaaaaacgtaaaagattacccacactcccctgtacctcacagacaaataaagtattgaaatacgtccggtatgcggacgacttcattatctctgttaaaggaagcaaagaggactgtcaatggataaaagaacaattaaaactttttattcataacaagctaaaaatggaattgagtgaagaaaaaacactcatcacacatagcagtcaacccgctcgttttctgggatatgatatacgagtaaggagatctggaacgataaaacgatctggtaaagtcaaaaagagaacactcaatgggagtgtagaactccttattcctcttcaagacaaaattcgtcaatttatttttgacaagaaaatagctatccaaaagaaagatagctcatggtttccagttcacaggaaatatcttattcgttcaacagacttagaaatcatcacaatttataattctgaactccgcgggatttgtaattactacggtctagcaagtaattttaaccagctcaattattttgcttatcttatggaatacagctgtctaaaaacgatagcctccaaacataagggaacactttcaaaaaccatttccatgtttaaagatggaagtggttcgtgggggatcccgtatgagataaagcaaggtaagcagcgccgttattttgcaaattttagtgaatgtaaatccccttatcaatttacggatgagataagtcaagctcctgtattgtatggctatgcccggaatactcttgaaaacaggttaaaagctaaatgttgtgaattatgtgggacgtctgatgaaaatacttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtcaaaaatcttaaaggcaaagaaaaatgggaaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaagccgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttcctgtcgtcatatctacaagcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccg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