一种海带中的M1PDH基因、其蛋白质及用途的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体属于基因工程领域，更具体涉及一种海带m1pdh基因、其蛋白质及用途。
背景技术：
：甘露醇(mannitol)是一种六元糖醇(c6h14o6)，与山梨醇、艾杜糖醇和塔里糖醇等互为同分异构体，化学性质稳定，无吸湿性。其广泛存在于细菌、真菌、原生动物、高等植物和藻类中，如海藻、杮饼表面的白粉即为甘露醇，海带中甘露醇的含量相当丰富。甘露醇是目前唯一从自然界植物中提取的具有工业价值的糖醇，用途广泛，多用于食品、医药和化工等领域。在食品领域，可作为营养型甜味剂等各种食品添加剂；在医药领域，具有脱水、利尿、降低颅内压、急性青光眼、自由基清除剂、药物填充剂和赋形剂等作用；在化工领域，可作为增塑剂、纺织辅助剂、油品分散剂、工业表面活性剂等。目前已知的甘露醇的生产方法共有四种：海带提取法、糖类异构氢化法、葡萄糖电解还原法、微生物发酵法。而现在已经能够实现大规模工业化生产的，有海带提取法和糖类异构氢化法。我国目前主要采用海带提取法，但该方法存在回收率低、能耗较大、工艺繁琐等问题。而且由于全球变暖以及环境污染等原因,生产含甘露醇海带的海域以及海带中甘露醇的含量有减少的趋势,采用海带提取法其原料来源受到一定限制。而微生物发酵法的优点就在于产物转化率高、避免了繁琐的工艺流程以及环境污染、又节约能源、不受海带原料来源的限制。随着基因工程的不断发展，利用基因工程培养微生物进行产品生产已在工业生产的方方面面成功实现。利用基因工程合成产品需要使用到该产物在生命体中进行生物合成的相关基因。甘露醇不是直接的基因产物，sylvierousvoal等(2011)提出褐藻中甘露醇的代谢通路，以果糖-6-磷酸为底物，经过甘露醇-1-磷酸脱氢酶(m1pdh)和甘露醇-1-磷酸酶(m1pase)的作用转化为甘露醇，参与分解的两步酶为甘露醇-2-脱氢酶(mannitol-2-dehydrogenase,m2dh)和己糖激酶(hexokinase,hk)。在藻类提取物中m1pdh的活性受到了nacl浓度调节。海带(sacchrinajaponica)在其厚成期能够大量积累甘露醇，甘露醇含量占海带干重的20％左右，然而海带中甘露醇代谢的基因和相关酶以及在细菌中的研究较少。本发明发现海带中具有sjam1pdh2基因(实验室命名)，该基因的编码蛋白质产物具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶(m1pdh)活性，该蛋白质产物极有可能是参与海带中甘露醇合成通路的关键酶。综上所述，提供以及深入研究分子甘露醇合成相关的m1pdh基因及其蛋白质产物甘露醇-1-磷酸脱氢酶对甘露醇的生物合成法具有重要实际应用意义以及理论研究意义。本发明意外地发现海带中的sjam1pdh2基因所编码的蛋白质产物具有的甘露醇-1-磷酸脱氢酶活性，因此其为一种m1pdh编码基因；且该基因所编码的m1pdh具有更宽的反应底物谱，同时更适合在较高温度和ph的环境中发挥作用，因此具有优异的生产应用价值，为甘露醇的生物合成提供了宝贵的基因和蛋白质资源。技术实现要素：针对现有技术中存在的不足和缺陷，本发明提供了一种海带(sacchrinajaponica)中的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(m1pdh)的编码基因，所述的m1pdh基因所编码的蛋白质产物具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶活性，即具有催化果糖-6-磷酸(f6p)转化为甘露醇-1-磷酸(m1p)的活性。一个方面，本发明提供了一种m1pdh的编码基因，所述的编码基因来源于海带，所述的m1pdh的编码基因在本发明中被命名为sjam1pdh2基因，所述的sjam1pdh2基因的核苷酸序列为seqidno：1所示的序列。另一个方面，本发明提供了一种由上述sjam1pdh2基因编码的蛋白质，所述的蛋白质的氨基酸序列为seqidno：2所示的序列；所述的蛋白质具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶的活性，能够催化果糖-6-磷酸转化为甘露醇-1-磷酸；所述的蛋白质命名为sjam1pdh2蛋白。再一个方面，本发明还提供了含有上述sjam1pdh2基因的载体或基因工程细胞。所述的载体可以为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。所述的真核细胞表达载体选自：酵母表达载体、昆虫细胞表达载体或哺乳动物细胞表达载体。所述的原核细胞表达载体可以为pet载体。所述的pet表达载体包括但不限于：pet-22载体、pet-28载体、pet-30载体、pet-32载体、pet-34载体、pet-40载体或pet-42载体等。所述的基因工程细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸菌细胞或毕赤酵母细胞等。再一个方面，本发明还提供了上述sjam1pdh2基因在制备甘露醇中的用途。所述的用途指将该sjam1pdh2基因导入基因工程细胞，从而使基因工程细胞能够产生甘露醇。另一个方面，本发明还提供了由上述sjam1pdh2基因所编码的蛋白质在制备甘露醇中的用途。和现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明不同于甘露醇的常规制备工艺，也就是海带提取法。本发明提供的sjam1pdh2基因编码的蛋白质具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶活性，是一种甘露醇生物合成中的重要酶，该基因或酶为甘露醇的生物制备提供了重要的生物资源。本发明中的sjam1pdh2基因所编码的蛋白质具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶的催化活性，其比活力为0.36μmolmgprotein-1min-1；且具有更宽的反应底物谱和更高的最适反应温度和ph，更适合在较高温度和ph的环境中发挥作用。本发明为甘露醇的生物制备提供了优异的基因资源和酶资源。附图说明图1为实施例3中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2为实施例5中的最适反应温度曲线图。图3为实施例6中的最适反应ph曲线图。图4为实施例7中的最适反应nacl浓度柱状图。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同意义。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。实施例1：海带中sjam1pdh2基因的获取根据seqidno：1所示的sjam1pdh2基因序列，可采用全序列合成或常规pcr的方式获得sjam1pdh2基因，同时在其两端加上连接载体所用酶切位点。实施例2：sjam1pdh2基因的表达和分离纯化将得到的sjam1pdh2基因连接至pet32a载体(购自novagen公司)的ecori和noti位点之间，获得pet32a-sjam1pdh2重组载体；将获得的pet32a-sjam1pdh2重组载体转化大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞(购自takara公司)中，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基中，37℃培养至菌液od600为0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg，37℃下诱导4h；诱导结束后取2ml菌液于4℃、12000rpm离心5min，弃上清，将管倒置于吸水纸上；沉淀加入1/2体积提前预冷好的50mmpbs缓冲液(ph＝7.8)中(即2ml离心后的沉淀中加入1mlpbs)，充分混匀；超声法破碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45μm的滤膜过滤。4℃下利用ni柱(购自ge公司)纯化重组蛋白(纯化时所用溶液体系中加入200μmnad以保证纯化的重组蛋白具有活性)。将过滤后液体加入his-tag柱，自然流速流下，过柱2-3次，使目的蛋白与柱子充分结合；依次将约20ml的配置好的10、20、50、200和500mm咪唑的破菌缓冲液(25ml1mtris-hcl和62.5ml的4mnacl，混匀后加双蒸水定容至500ml)加入柱中，自然流速流下洗去杂蛋白，获得重组蛋白，得率为4mg/l，该重组蛋白为sjam1pdh2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：2所示，命名为sjam1pdh2蛋白，功能为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。实施例3sjam1pdh2重组蛋白的鉴定对实施例2获得的sjam1pdh2蛋白进行sds聚丙烯酰胺胶电泳，电泳图如图1所示，1：待纯化样品；2：流穿液；3：10mm咪唑洗脱；4：20mm咪唑洗脱；5：50mm咪唑洗脱；6：200mm咪唑洗脱；7：500mm咪唑洗脱；8：maker。sjam1pdh2蛋白的分子量约为72kda，符合预期大小。实施例4甘露醇-1-磷酸脱氢酶的活性检测在200μl的反应体系中，含有50mmtris-acetate(ph6.3)，0.2mmnadh，2.5mmedta，3mmf6p(终浓度)，加入约20-30μg的重组蛋白，30℃进行反应。将不含底物的各反应组分，加入1.5mlep管中，利用金属浴精确保温1.5min，通过向反应体系中添加终浓度为3mm的潜在底物起始反应，用酶标仪在340nm处检测酶活的变化。结果见表1：由表1可知，实施例2获得的sjam1pdh2蛋白具有甘露醇-1-磷酸脱氢酶活性。其底物和产物分别是果糖-6-磷酸(f6p)和甘露醇-1-磷酸(m1p)。表1：不同底物浓度下m1pdh的活性底物浓度mm0.10.20.30.512活性(μmolmin-1mgprotein-1)0.0170.0290.0650.0870.0970.129实施例5最适反应温度的测定根据实施例4中的酶活测定方法，分别在不同温度下(5℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)测定重组蛋白(即实施例2中的sjam1pdh2蛋白)的活性，绘制最适反应温度曲线，最适反应温度曲线如图2所示，根据图2显示：sjam1pdh2蛋白的最适反应温度为40℃。实施例6最适反应ph值的测定根据实施例4中的酶活测定方法，分别在不同ph值下(ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph8.0、ph9.0)测定重组蛋白(即实施例2中的sjam1pdh2蛋白)的活性，绘制最适反应ph曲线，最适反应ph曲线如图3所示，根据图3显示：sjam1pdh2蛋白的最适反应ph为8.0。实施例7最适反应nacl浓度的测定根据实施例4中的酶活测定方法，分别在不同浓度的nacl下(0mm、200mm、400mm、600mm、800mm、1000mm)测定重组蛋白(即实施例2中的sjam1pdh2蛋白)的活性，绘制最适反应nacl浓度柱状图，最适反应nacl浓度如图4所示，根据图4显示：sjam1pdh2蛋白的最适反应nacl浓度为200mm。实施例8海带中m1pdh生化特性与其他藻类的比较根据实施例4中的酶活测定方法，测定sjam1pdh2基因所编码的m1pdh的酶学参数。将底物分别由葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-p)和葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-p)代替实施例4中的f6p，测定最大酶活。另外，与molecularandbiochemicalcharacterizationofmannitol-1-phosphatedehydrogenasefromthemodelbrownalgaectocarpussp.phytochemistry117,509–520(对比例1)、enzymesinvolvedinthelaststepsofthebiosynthesisofmannitolinbrownalgae.plantandcellphysiology13,1017–1029(对比例2)、d-mannitoldehydrogenaseandd-mannitol-1-phosphatedehydrogenaseinplatymonassubcordiformis:somecharacteristicsandtheirroleinosmoticadaptation.planta170,528–534(对比例3)、characterizationofsalt-regulatedmannitol-1-phosphatedehydrogenaseintheredalgacaloglossacontinua.plantphysiology133,893–900(对比例4)、characterizationofmannitolmetabolisminthemangroveredalgacaloglossaleprieurii(montagne).jagardhplanta201,173–178(对比例5)和biochemicalcharacterizationofmannitolmetabolismintheunicellularredalgadixoniellagrisea(rhodellophyceae).europeanjournalofphycology41,405–413(对比例6)中的结果做对比。结果见表2和表3：由表2可知，sjam1pdh2基因所编码的m1pdh的催化效率较高，最适温度和ph更高，更适合在较高温度和ph的环境中发挥作用。由表3可知，当底物分别为果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-1-磷酸时，sjam1pdh2基因所编码的m1pdh催化活性均达到96％以上，说明该m1pdh具有更宽的反应底物谱，产生甘露醇的来源更加广泛。表2：褐藻和红藻中m1pdh的生化特性的比较表3：不同底物中褐藻和红藻中m1pdh活性的比较以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国海洋大学<120>一种海带中的m1pdh基因、其蛋白质及用途<130>2018<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1068<212>dna<213>sacchrinajaponica<400>1atggtcgtcgtcggagatcgccccaccttgctccaactcgtcagaaaggcgacaagcttc60agctgctctctaggcgcggcgatgacgattgcgatgatcccgctcctctctgagctggag120gacaagccgttcgaagagcgtccggtgctctatgcctgtgaaaacgaccacgacgccgtg180agaagagtgggcgagatggtgacctccaaagtcaccacggtgccttgcatggtcgaccgg240atctgcaccggcaggcaaataggcgagtacgaagtgaacgtggaggcggaacctaacttt300gggggctcgctggtgcttctcgaccccccgtccgaccctagcctcgtccccttcgctggg360accaccgtcctcatcccctctacgcgagaggaggcgagctacttctacaagcgaaagttc420agcgtggtcaacggcatgcacaccgtgctgggtttcatgaccctgcgcgagaaggctcca480ggggcaaaggagctgagggagcacgacctgctggcgtacgacaccgcctcgcccgagatt540cgagcggagctgtgggcgtgggtggtggtgcgctgcctggccctgctggacgagtttggc600gtggacatgctcaagagtgctcacgacctggagacggaggaggaggtcttcgacgtcctt660ctcgactacggggggcaggcgctcgaccgcttttcgagcgtcgtcgactctaccagcagg720gttcttggtgggggccttggaaaccggttgaccacccgccttcagcctatggtggtgttt780atgaagaacaacaccatgaaaggcagcgggctacccggagaacgtttcttagagcgcgcc840ggggtggaggaggtgttcgccagggaggcgattaagtctctggctcgaagtagcgtctcg900ttctgcactcaggacttcatggcggcgaagaaggccagggtcgaagcgagggcactcaag960gccgccaaagtggaggagaacaaggccaccagggtggtaccggacgccaaggcgcaaagc1020ggtaaggccagctctggaaaacaggagccgagcgttgctcaaggttaa1068<210>2<211>355<212>prt<213>sacchrinajaponica<400>2metvalvalvalglyaspargprothrleuleuglnleuvalarglys151015alathrserphesercysserleuglyalaalametthrilealamet202530ileproleuleusergluleugluasplyspropheglugluargpro354045valleutyralacysgluasnasphisaspalavalargargvalgly505560glumetvalthrserlysvalthrthrvalprocysmetvalasparg65707580ilecysthrglyargglnileglyglutyrgluvalasnvalgluala859095gluproasnpheglyglyserleuvalleuleuaspproproserasp100105110proserleuvalprophealaglythrthrvalleuileproserthr115120125arggluglualasertyrphetyrlysarglyspheservalvalasn130135140glyme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