一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒与流程

本发明涉及一种用于检测动物寄生虫的试剂盒及使用方法，特别是一种牛泰勒虫病的检测试剂盒，及其非疾病检测目的的使用方法。

背景技术：

牛泰勒虫病(bovinetheileriosis)是一种蜱传性的血液原虫病，由顶复门、梨形虫纲、泰勒属的多种泰勒虫引起，该病流行范围广，在全世界均有分布，给养牛业造成了巨大的经济损失，严重制约了养牛业的健康持续发展(sageretal.1998；gebrekidanetal.2016)。在我国，引起牛泰勒虫病的病原主要有三种：环形泰勒虫(theileriaannulata)、中华泰勒虫(theileriasinensis)和东方泰勒虫(theileriaorientalis)(yangetal.1965)。环形泰勒虫毒力较强，致死率高达40％，是引起地中海泰勒虫病/热带泰勒虫病的主要病原。中华泰勒虫最早于1995年由中国农业科学院兰州兽医研究所虫媒传播疫病病原研究组从甘肃黄牛体内分离而来(baietal.2002；lietal.2009)。东方泰勒虫属于毒力较弱的泰勒虫群，包括瑟氏泰勒虫、水牛泰勒虫和东方泰勒虫(gubbelsetal.2000；gubbelsetal.2002；stewartetal.1996；uilenbergetal.1985)。

我国关于牛泰勒虫病报道的最早源于贵州，随后该病在多个省份均有零星的报道，包括辽宁、吉林、甘肃、四川、广西、湖南、江苏、河北等(luoetal.1997)。流行病学调查结果显示，环形泰勒虫在我国主要流行于西北的荒漠和半荒漠草原地带，东北的大兴安岭及长白山和华北地区，其感染率为1.6-90％，死亡率为4-46.4％(黄国顺，1994；luoandlu1997；yinetal.2008；李亚琼等，2015；海尼木古丽等，2017)。东方泰勒虫在我国的分布范围更为广泛，感染牛多数呈带虫隐形感染状态，在某些地区的感染率高达97.5％(luoetal.1997)。中华泰勒虫仅

目前，牛泰勒虫检测方法有血涂片和淋巴组织活检法、血清学方法、分子生物学方法。利用传统血涂片和淋巴组织活检涂片是进行泰勒虫急性感染检测最可靠的方法。但是在染虫率很低或感染早期，该方法很难发现虫体，也难以鉴定到种，也存在一定的局限性。国内外学者利用半套式pcr、实时荧光定量pcr(real-timepcr)、酶联免疫吸附试验等对泰勒虫进行检测。分子生物学方法和酶联免疫吸附试验具有高敏感性和特异性的特点，但每次只能鉴定出一种病原体，无法同时实现多种病原的鉴别检测。

技术实现要素：

本发明提供了一种可克服现有技术不足的用于国内现存的牛泰勒虫病原鉴别检测的试剂盒，以及用这种试剂盒进行疾病与非疾病检测的方法。

本发明的检测牛泰勒虫试剂盒包括两条扩增引物seqidno.1和seqidno.2。

本发明的检测牛泰勒虫试剂盒种还含有evagreen荧光染料的qpcrmastermix预混液。为了便于虫种的鉴别检测，本发明的试剂盒中还有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

本发明的试剂盒可同时鉴别检测环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫。

本发明的非疾病检测目的的使用方法为：提取待检样品基因组dna，将所得到的待检dna和标准质粒dna用试剂盒中的扩增引物进行扩增，对扩增得到的产物进行高分辨率熔解曲线分析，依据待检样品形成的熔解曲线与标准泰勒虫对应的熔解曲线的重合情况，判定样品感染的泰勒虫种。

本发明利用环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫18srna基因序列的保守性特征(基因序列相似性为95.3-99.9％)，基于基因序列比对分析结果，在保守区域设计扩增引物，扩增的靶序列在不同的虫种间存在个别碱基的差异，使其扩增产物的熔解温度存在一定的差异，可以形成不重合的熔解曲线，从而可以进行不同虫种的鉴别检测。靶序列具有如下特征：(1)在同一虫种不同地方分离株间高度保守(核苷酸序列相似性为100％)；(2)不同虫种间至少有一个碱基的变异；利用高分辨率溶解曲线方法(hrm)对扩增产物进行熔解曲线分析，由于扩增的基因序列存在一个或数个碱基的差异，导致不同的基因序列熔解温度有细微的差别，形成不同的熔解曲线，进行研制出可同时鉴别检测三种牛泰勒虫(环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫)的试剂盒。

本发明的检测方法具有重复性好、灵敏度高、反应速度快和全封闭反应等优点，使其能更好地用于牛泰勒虫的鉴别检测。目前，还没有关于利用高分辨率熔解曲线进行牛泰勒虫种鉴别检测方法的报道。

本方法囊括了国内现存的牛泰勒虫病原，检测范围广，可用于牛泰勒虫种的鉴别检测和流行病学调查。

附图说明

图1实时荧光定量pcr扩增敏感性。其中1为pcr扩增质粒浓度为1×10⁷拷贝/μl，2为pcr扩增质粒浓度为1×10⁶拷贝/μl，3为pcr扩增质粒浓度为1×10⁵拷贝/μl，4为pcr扩增质粒浓度为1×10⁴拷贝/μl，5为pcr扩增质粒浓度为1×10³拷贝/μl，6为pcr扩增质粒浓度为1×10²拷贝/μl，7为pcr扩增质粒浓度为1×10¹拷贝/μl。

图2熔解曲线敏感性。1为环形泰勒虫18srna质粒1×10⁷拷贝/μl、1×10⁴拷贝/μl和1×10¹拷贝/μl扩增产物的溶解曲线，2为东方泰勒虫18srna质粒1×10⁷拷贝/μl、1×10⁴拷贝/μl和1×10¹拷贝/μl扩增产物的溶解曲线，3为中华泰勒虫18srna质粒1×10⁷拷贝/μl、1×10⁴拷贝/μl和1×10¹拷贝/μl扩增产物的溶解曲线。

图3已知背景野外样品检测结果。1：环形泰勒虫(1-3号样品)熔解曲线；2：大巴贝斯虫(13号样品)熔解曲线；3：东方泰勒虫(7-9号样品)熔解曲线；4：卵形巴贝斯虫(12号样品)熔解曲线；5：双芽巴贝斯虫(11号样品)熔解曲线；6：中华泰勒虫(4-6号样品)熔解曲线；7:东方巴贝斯虫熔解曲线(7-9号样品)；8：牛巴贝斯虫(10号样品)熔解曲线。

图4为应用本发明的方法对样本进行分析后的结果。

具体实施方式

下面提供具体实施方案对本发明做更详细阐述。下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及基因测序均由南京金斯瑞股份有限公司完成。

本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：

(1)pcr扩增引物

seqidno.1上游引物：bovist-4f5'-ggcgtttattagacctaaaacc-3'

seqidno.2下游引物：bovist-4r5'-ggtcagaaacttgaatgatacatcg-3'

扩增产物长度为110bp

(2)标准环形泰勒虫18srna重组质粒(theileriaannulata，10⁵拷贝/μl)；

重组质粒序列seqidno.3为：

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgaggccatttggcggcgtttattagacctaaaaccaaaccgcttgcggtgtccggtgattcataataaatatgcgaatcgtactctgtacgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtattggcctaccggggcaacgacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgacacagggaggtagtgacaagaaataacaatacggggcttaaagtcttgtaattggaatgatgggaatttaaacctcttccagagtatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaaattgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctgctgcattgcttgtgtccctctggggtctgtgcatgtggcttttttcggacggagtttctttgtctgaatgtttactttgagaaaattagagtgctcaaagcaggctttcgccttgaatagtttagcatggaataataaagtaggactttggttctattttgttggttttaggtaccaaagtaatggttaataggaacagttgggggcattcgtatttaactgtcagaggtgaaattcttagatttgttaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagacctaaccataaactatgccgactagagattggaggtcgtcagtttttacgactccttcagcaccttgagagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaggaaggattgacagattgatagctctttcttgattctttgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacgagaccttaacctgctaaatagggtacgggaataagtttctactgtcccgttatcgcttcttagagggactttgcggttataaatcgcaaggaagtttaaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtcc

(3)标准中华泰勒虫18srna重组质粒(theileriasinensis，10⁵拷贝/μl)；

重组质粒序列seqidno.4为：

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgagaccttcgggtggcgtttattagacctaaaaccaaaccgcttgcggtgcccggtgattcataataaacttgcgaatcgcggctttgctgcgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtattggcctaccggggcagcgacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgacacagggaggtagtgacaagaaataacaatacggggcttaatgtcttgtaattggaatgatgggaatttaaacctcttccagagtatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaaattgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctgctgcatcgtcgcatctcttgctgagtgcttcgtttcggcttatttcggattgattttttctttccggatgattactttgagaaaattagagtgctcaaagcaggcttttgccttgaatagtttagcatggaataataaagtaggactttggttctattttgttggttttaggtaccaaagtaatggttaataggaacagttgggggcattcgtatttaactgtcagaggtgaaattcttagatttgttaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcctaaccataaactatgccgactagagattggaggtcgtcagtttttacgactccttcagcaccttgagagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaggaaggattgacagattgatagctctttcttgattctttgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacgagaccttaacctgctaaataggatgcgggaataggcttttgctgtcccgttatcgcttcttagagggactttgcggttataaatcgcaaggaagtttaaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtcc

(4)标准东方泰勒虫18srna重组质粒(theileriaorientalis，10⁵拷贝/μl)；

重组质粒序列seqidno.5为：

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgagaccttcgggtggcgtttattagacctaaaaccaatccgtgccaaacacggttcccggtgattcataataaacttgcgaatcgctttacttagcgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtattggcctaccggggcaacgacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatctaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgacacagggaggtagtgacaagaaataacaatacggggcttaatgtcttgtaattggaatgatgggaatttaaacctcttccagagtatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaatttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctgctgcattacatttctcttgtttgagtttgttattgtggcttatttcggattgatttttatcattccggatgattactttgagaaaattagagtgctcaaagcaggcttttgccttgaatagtttagcatggaataatagagtaggactttggttctattttgttggttttaggtaccaaagtaatggttaataggaacagttgggggcattcgtatttaactgtcagaggtgaaattcttagatttgttaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcctaaccataaactatgccgactagagattggaggtcgtcagtttttacgactccttcagcaccttgagagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacaaaggaaggattgacagattaatagctctttcttgattctttgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacgagaccttaacctgctaaataggatgcgggaataaactttggttgtcccgttatcgcttcttagagggactttgcggttataaatcgcaaggaagtttaaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgtcc

(6)标准泰勒虫阴性牛基因组dna(50ng/μl)；

(8)预混qpcrmastermix

具体操作方法如下：

首先制备所需的质粒标准品。本发明包括环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫，共3个虫种的18srna基因重组质粒。

在具体应用时还需要有：预混qpcrmastermix(含evagreen荧光染料)、标准阳性质粒模板、阴性标准品、扩增引物。反应体系包括荧光定量pcr反应液qpcrmastermix10μl，正向引物和反向引物(10pmol)各0.5μl，荧光校正液roxreferencedye(50×)0.4μl，标准品质粒模版1.0μl，灭菌蒸馏水7.6μl。1、标准品的制备

环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18srna重组标准质粒的制备。

(1)根据三种泰勒虫18srrna基因序列，使用primerpremier5.0设计引物，预期获得的目的片段约为1240bp，由南京金斯瑞有限公司合成。引物对序列为：

piro-f140：5'-ccatggataaccgtgctaattg-3'

piro-r1380：5'-catctaagggcatcacagacc-3'

(2)以实验室保存的环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫基因组dna为模板进行扩增，pcr反应体系为：

反应条件为94℃预变性5min，然后94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环，72℃延伸7min。取5μl扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的pcr产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回收的dna片段与pclone007-t载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

(3)pclone007-t连接产物的转化以及pcr鉴定

(a)-80℃的超低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的lb液体培养基1ml，37℃150转，培养90min。

(e)取100μl涂布于氨苄青霉素抗性的lb平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄青霉素抗性的lb液体培养基的1.5mlep管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μl作为模板进行菌液pcr鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的lb液体培养基中进行扩摇。

(4)鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用nanodrop2000/2000c(thermoscientific，america)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μl，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μl，以便进行敏感性测试。

2、高分辨率溶解曲线方法的反应性和灵敏度测试

(1)hrm-pcr扩增时所用反应体系和反应条件

pcr反应体系为20μl：

pcr的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。hrm分析：95℃60s；40℃60sec；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

扩增所用引物序列如下：

seqidno.1上游引物：bovist-4f5'-ggcgtttattagacctaaaacc-3'

seqidno.2下游引物：bovist-4r5'-ggtcagaaacttgaatgatacatcg-3'

(2)灵敏度实验

利用上述所建立的实时荧光定量pcr方法，每个样品三个重复分别检测环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18srna重组质粒。取不同稀释浓度1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μl的质粒标准品进行灵敏度试验。

pcr扩增时的反应体系为：

pcr扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。

hrm分析的条件为：95℃60s；40℃60s；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

结果参照图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μl至1.0×10¹拷贝/μl，均能够很好地扩增，表明该方法具有很好的扩增反应性。

分别对环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18srna重组质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μl、1.0×10⁴拷贝/μl和1.0×10¹拷贝/μl扩增产物进行溶解曲线分析，标准质粒溶解曲线(图2)结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的溶解曲线具有良好的拟合性，该方法能同时进行三种泰勒虫种的鉴别检测。

(3)hrm重复性

环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18srna质粒浓度为1.0×10⁷、1.0×10⁴和1.0×10¹拷贝/μl的标准品进行pcr扩增和溶解曲线分析。对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复三次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准品进行溶解曲线分析，反复重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的溶解曲线均能够很好地重合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。

(4)hrm方法对已知样本的检测

利用建立的hrm方法对经过测序鉴定为泰勒虫阳性的基因组dna样本进行hrm分析，与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的泰勒虫种。

数据显示14例(表1)样本中环形泰勒虫3例、中华泰勒虫3例、东方泰勒虫3例；牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、东方巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫各1例，测序结果与本发明方法检测的结果完全一致(图3)。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(上游引物：bovist-4f)

<400>1

ggcgtttattagacctaaaacc22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(下游引物：bovist-4r)

<400>2

ggtcagaaacttgaatgatacatcg25

<210>3

<211>1268

<212>dna

<213>标准环形泰勒虫18srna重组质粒序列(环形泰勒虫theileriaannulata)

<400>3

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgaggccatttggcggcgtttatta60

gacctaaaaccaaaccgcttgcggtgtccggtgattcataataaatatgcgaatcgtact120

ctgtacgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtattggcct180

accggggcaacgacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaa240

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ggtagtgacaagaaataacaatacggggcttaaagtcttgtaattggaatgatgggaatt360

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cagctccaatagcgtatattaaaattgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctgc480

tgcattgcttgtgtccctctggggtctgtgcatgtggcttttttcggacggagtttcttt540

gtctgaatgtttactttgagaaaattagagtgctcaaagcaggctttcgccttgaatagt600

ttagcatggaataataaagtaggactttggttctattttgttggttttaggtaccaaagt660

aatggttaataggaacagttgggggcattcgtatttaactgtcagaggtgaaattcttag720

atttgttaaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaa780

cgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagacctaaccataaactatgcc840

gactagagattggaggtcgtcagtttttacgactccttcagcaccttgagagaaatcaaa900

gtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaag960

ggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccagg1020

tccagacaaaggaaggattgacagattgatagctctttcttgattctttgggtggtggtg1080

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ttaacctgctaaatagggtacgggaataagtttctactgtcccgttatcgcttcttagag1200

ggactttgcggttataaatcgcaaggaagtttaaggcaataacaggtctgtgatgccctt1260

agatgtcc1268

<210>4

<211>1270

<212>dna

<213>标准中华泰勒虫18srna重组质粒序列(中华泰勒虫theileriasinensis)

<400>4

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgagaccttcgggtggcgtttatta60

gacctaaaaccaaaccgcttgcggtgcccggtgattcataataaacttgcgaatcgcggc120

tttgctgcgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtattggc180

ctaccggggcagcgacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgag240

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ttagatgtcc1270

<210>5

<211>1275

<212>dna

<213>标准东方泰勒虫18srna重组质粒(东方泰勒虫theileriaorientalis)

<400>5

ggataaccgtgctaattgtagggctaatacatgttcgagaccttcgggtggcgtttatta60

gacctaaaaccaatccgtgccaaacacggttcccggtgattcataataaacttgcgaatc120

gctttacttagcgatgtatcattcaagtttctgacctatcagctttggacggtagggtat180

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