一种使用微孔涂层体外诱导脂肪源性干细胞分化的方法与流程

本发明属于生物分子领域，涉及一种使用微孔涂层体外诱导脂肪源性干细胞分化的方法。

背景技术：

组织工程学作为一种替代器官移植来治疗某些疾病的重要学科在近几年发展迅猛，近年来，从人脂肪组织中分离出来的脂肪源性干细胞(humanadipose-derivedstemcells，hascs)被证实是一种具备自我更新能力与多向分化潜能的细胞，该细胞可以向成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞、神经细胞、肌细胞和血管细胞等不同胚层来源的细胞分化，并且具有易于自体取材、来源广泛、损伤较少、易大量获取、体外扩增能力强、不易衰老、抗原性低并且不涉及道德伦理问题等优势作为组织工程种子细胞十分理想，不论在器官修复、组织工程，还是基因治疗等方面都具有广阔的应用前景。

中国专利cn104383611a公开了一种利用聚电解质组装制备负载生物活性分子涂层的方法，主要包括以下步骤:(1)利用聚电解质层状组装方法制备涂层；(2)将涂层进行酸处理产生微孔结构；(3)将涂层冷冻干燥固定微孔结构；(4)将微孔结构涂层浸入药物溶液进行药物负载；(5)将负载生物活性分子涂层进行水蒸气处理，闭合涂层中的微孔，实现药物的包埋负载。该方法制备得到的聚电解质涂层具有微孔结构，可进行多种类型药物的同时负载，且负载过程简便，负载量可控。

中国专利cn104383611a虽然该制备方法得到的聚电解质涂层也具有微孔结构，可进行药物的负载，但是其中需要限定聚阳离子电解质水溶液为碱性，聚阴离子电解质水溶液为酸性，对条件要求比较严格，并未涉及到脂肪源性干细胞细胞分化培养，也未公开用于脂肪源性干细胞细胞分化培养的具体操作和条件，所以该制备方法应用在脂肪源性干细胞细胞分化培养属于空白阶段。中国专利cn104383611a中的载药涂层仅仅用于释放药物。而本发明中并未限定聚电解质溶液的酸碱性，相比于中国专利cn104383611a单独的释放药物，本发明的涂层表面可以生长细胞，并且多种生物活性分子按比例持续释放的时间可长达16天，这些都是中国专利cn104383611a所不具备的。

目前传统的脂肪源性干细胞细胞分化培养方法是通过聚苯乙烯细胞培养板(tcps)上贴壁培养，每1～2天更换含有细胞生物活性分子的细胞培养基。不同于一些周期较短的细胞培养，脂肪源性干细胞分化周期超过16天，频繁换液会对细胞造成不良的影响，增加了细菌感染的风险，且消耗过多的细胞培养基，造成了浪费。

技术实现要素：

本发明提供了一种使用微孔涂层体外诱导脂肪源性干细胞分化的方法，是将多种生物活性分子同时负载到涂层内，放入细胞培养液中进行细胞培养，涂层中的生物活性分子会有规律的释放出来，从而达到了培养细胞的目的。与传统的培养方法相比，这种方法可以降低细胞培养液更换的频率，减少了因为换液对细胞培养的影响，降低细胞培养成本；因为涂层结构具有可调节性，所以可以自由调节释放浓度。体外释放实验表明通过改变涂层层数，负载液浓度等因素可以调控多孔涂层的实际负载量，并且多种生物活性分子会根据实际负载的比例，按比例释放，并且释放时间超过了16天，尤其适合脂肪源性干细胞的细胞分化；细胞活性分子在正常生理条件下易发生变性，导致其活性丧失，用这种方法控释生物活性分子则可以在生理条件下保持其良好的生物活性；对于贴壁生长的细胞，在这种涂层表面涂抹一层胶原可以让细胞贴在涂层表面进行生长，易于细胞的转移，为细胞培养提供了新的思路。

本发明公开了一种使用微孔涂层体外诱导脂肪源性干细胞分化的方法，包含以下步骤：

(1)将聚阳离子电解质充分溶解在溶剂a中配成聚阳离子电解质溶液；将聚阴离子电解质充分溶解在溶液b中配成聚阴离子电解质溶液；

(2)将基底材料完全浸泡在聚阳离子电解质溶液中，浸泡8～60分钟后取出，用溶液c洗涤；

(3)将步骤(2)中得到的基底材料完全浸泡在聚阴离子电解质溶液中，浸泡8～60分钟后取出，用溶液d洗涤；

(4)重复步骤(2)～步骤(3)若干次后，将基底材料取出放入溶剂e中，并-80℃冷冻过夜，次日冷冻干燥后得到具有连通微孔结构的涂层；

(5)确定负载液浓度，将负载液中的多种生物活性分子通过毛细作用负载到涂层中，通过真空干燥涂层；

本发明中，通过对涂层厚度、负载液浓度的调节来调控涂层在细胞培养液中释放多种生物活性分子的浓度。使得涂层中释放的生物活性分子能够始终满足细胞的培养，即每次换液后经过涂层释放的生物活性分子在培养基中的浓度大于或等于细胞培养所需的浓度。

(6)将载入生物活性分子后的涂层利用物理方法f进行处理，使微孔闭合成为致密结构；

(7)在涂层表面涂抹一层胶原，加入第3代脂肪源性干细胞和完全培养基，进行细胞分化培养，定期更换溶剂h。

本发明中，所述的聚阳离子电解质为壳聚糖，聚乙烯亚胺，和聚赖氨酸的一种或多种混合物。

本发明中，所述的聚阴离子电解质为聚丙烯酸和海藻酸钠的一种或多种混合物。

本发明中，所述的溶剂a为0.5％～2％体积分数冰醋酸水溶液。

本发明中，所述的溶液b、溶液c和溶液d为同种溶液，为去离子水。

本发明中，所述的溶剂e为ph＝2.2～2.9的盐酸水溶液，浸泡时间为30～200分钟。

本发明中，所述的物理方法f为将微孔结构涂层置于100％相对湿度下2～48小时。

本发明中，所述的溶剂h为细胞完全培养液，更换间隔2～5天。

本发明中，所述的基底材料为pet膜或者玻璃片中一种。

本发明中重复步骤(2)～步骤(3)10～60次。

本发明中，负载液指的是生物活性分子溶解在特定的溶剂中所形成的的溶液，配置成负载液的作用是使生物活性分子溶解，并可以通过毛细作用进入膜内，然后通过真空除去溶剂。

本发明中，特定的溶剂为无水乙醇。

本发明中维持生物活性分子的浓度在适宜的水平是指使每次换液后，释放在培养液中的生物活性分子浓度均大于等于常规方法培养细胞所需要的生物活性分子浓度。

本发明具有下列效果和优点：

(1)本发明采用具有指数型增长模式的壳聚糖/聚丙烯酸，或者聚乙烯亚胺/聚丙烯酸作为制备涂层的组分，使得到的涂层材料具有一定的厚度和类似基体组织的粘弹性。

(2)本发明通过调控层层自组装的循环次数，可以调控聚电解质涂层的厚度以及质量等性质，随后可以通过涂层实际负载量调控每种生物活性分子的释放量。

(3)本发明使用具有微孔结构的涂层进行生物活性分子的释放可以降低细胞培养液更换的频率，减少了因为换液对细胞的影响，降低了细胞培养成本。

(4)细胞活性分子在正常生理条件下易发生变性，导致其活性丧失，用这种方法控释生物活性分子则可以在生理条件下保持其良好的生物活性。

(5)经过体外生物活性分子负载和释放研究表明，通过改变涂层层数，负载液浓度等因素可以调控多孔涂层的实际负载量，并且多种生物活性分子会根据实际负载的比例，按比例释放，即每种生物活性分子的释放量可以通过实际负载量进行调控。

(6)本发明释放细胞活性分子时间超过16天，所以适合脂肪源性干细胞的分化，在细胞培养等领域有潜在的应用价值。

(7)对于贴壁生长的细胞，在这种涂层表面涂抹一层胶原可以让细胞贴在涂层表面进行生长，易于细胞的转移，为细胞培养提供了新的思路。

附图说明

图1为经过两周脂肪细胞培养后，使用油红o进行染色，用本发明方法(a)和传统培养方法(b)对照图；

图2为经过两周脂肪细胞培养后，使用hoechst33342进行染色，用本发明方法(a)和传统培养方法(b)对照图。

具体实施方式

实施例1：

(1)将pet膜剪成10mm×30mm矩形形状，依次用乙醇，丙酮清洗，用去离子水冲净表面的残留液并用氮气吹干备用；

(2)配制浓度为1mg/ml的壳聚糖(cs)溶液和3mg/ml的聚丙烯酸(paa)溶液，搅拌至cs和paa充分溶解；

(3)将pet膜首先浸在cs溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗3次；接着再在paa溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗3次(步骤(3)构成一个双层的制备)；

(4)重复(3)过程15次，制备得到(cs/paa)15涂层；

(5)将(cs/paa)15涂层取出放入ph＝2.5的盐酸溶液中1小时，取出后在-80℃冷冻过夜，次日冷冻干燥后得到具有连通微孔结构的涂层；

(6)配制ibmx5mmol/l、地塞米松10μmol/l、吲哚美辛2mmol/l的负载液，溶剂为乙醇；

(7)将微孔涂层一端轻触负载液，使负载液通过毛细作用充满整个膜，通过真空干燥机除去溶剂乙醇；

(8)将负载生物活性分子后的涂层置于100％相对湿度下5h，涂层中的微孔结构会自发的愈合，已有的释放结果显示(cs/paa)15涂层释放生物活性分子的时间超过16天，所以(cs/paa)15可以进行脂肪源性干细胞的成脂分化；

(9)将负载生物活性分子后的涂层圈在培养板四周，按照5×10³个/平方厘米向培养板中加入第3代脂肪源性干细胞和完全培养基；

(10)每4d换完全培养液，持续诱导培养14天；

(11)经过hoechst33342染色后在荧光下观察到细胞核的存在，经过油红o染色后脂肪呈现红色，说明脂肪源性干细胞成功分化为脂肪细胞。

所述的第3代脂肪源性干细胞是采用常规工艺，进行提取、分离培养得到。

所述的完全培养液的配置方法如下：

将5gdmem粉末、1.85g碳酸氢钠、1.75g葡萄糖、5ml青霉素-链霉素双抗液、50ml胎牛血清(fbs)、100μl碱性成纤维生物活性分子(bgfg)加入到瓶中定容至500ml，用灭菌后的过滤器过滤后，封口后于4℃冰箱保存。

实施例2：

(1)将直径20mm的圆形玻璃片使用浓硫酸和双氧水的混合溶液中(体积比为7∶3)浸泡40min后取出，用去离子水冲净表面的残留液并用氮气吹干备用；

(2)同实例施1步骤(2)；

(3)将圆形玻片首先浸在cs溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗4次；接着再在paa溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗4次(步骤(3)构成一个双层的制备)；

(4)重复(3)过程20次，制备得到(cs/paa)20涂层；

(5)将(cs/paa)20涂层取出放入ph＝2.5的盐酸溶液中1小时，取出后在-80℃冷冻过夜，次日冷冻干燥后得到具有连通微孔结构的涂层；

(6)配制ibmx3.75mmol/l、地塞米松7.5μmol/l、吲哚美辛1.5mmol/l的负载液，溶剂为乙醇；

(7)同实例施1步骤(7)；

(8)将负载生物活性分子后的涂层置于100％相对湿度下8h，涂层中的微孔结构会自发的愈合，已有的释放结果显示(cs/paa)20涂层的生物活性分子释放时间超过16天，所以(cs/paa)20适合进行脂肪源性干细胞的成脂分化；

(9)将负载生物活性分子后的涂层放置在培养板底部，表面涂抹一层胶原，向培养板中加入第3代脂肪源性干细胞和完全培养基；

(10)每5d换完全培养液，持续诱导培养17天；

(11)进过hoechst33342染色后在荧光下观察到细胞核的存在，经过油红o染色后脂肪呈现红色，说明脂肪源性干细胞成功分化为脂肪细胞，这种让细胞生长在(cs/paa)20涂层的细胞培养方法证明了(cs/paa)20涂层具有良好的生物相容性和低细胞毒性。

实施例3：

(1)同实例施1步骤(1)；

(2)配制浓度为1mg/ml的聚乙烯亚胺(pei)溶液和3mg/ml的聚丙烯酸(paa)溶液，搅拌至pei和paa充分溶解；

(3)将pet膜首先浸在pei溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗3次；接着再在paa溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗3次(步骤(3)构成一个双层的制备)；

(4)重复(3)过程15次，制备得到(pei/paa)15涂层；

(5)将(pei/paa)15涂层取出放入ph＝2.5的盐酸溶液中1小时，取出后在-80℃冷冻过夜，次日冷冻干燥后得到具有连通微孔结构的涂层；

(6)同实例施1步骤(6)；

(7)配制ibmx5mmol/l、地塞米松10μmol/l、吲哚美辛2mmol/l的负载液，溶剂为乙醇；

(8)将负载生物活性分子后的涂层置于100％相对湿度下12h，涂层中的微孔结构会自发的愈合，释放结果显示生物活性分子的释放时间超过16天，所以适合进行脂肪源性干细胞的成脂分化；

(9)同实例施1步骤(9)；

(10)每5d换完全培养液，持续诱导培养14天；

(11)经过hoechst33342染色后在荧光下观察到细胞核的存在，经过油红o染色后脂肪呈现红色，说明脂肪源性干细胞成功分化为脂肪细胞，与对照组生长情况差别不大，说明这种方法可用于细胞的长时间培养。

实施例4：

(1)同实例施2步骤(1)；

(2)同实例施3步骤(2)；

(3)将圆形玻片首先浸在pei溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗4次；接着再在paa溶液中浸泡10分钟，然后用去离子水清洗4次(步骤(3)构成一个双层的制备)；

(4)重复(3)过程25次，制备得到(pei/paa)25涂层；

(5)将(pei/paa)25涂层取出放入ph＝2.5的盐酸溶液中1小时，取出后在-80℃冷冻过夜，次日冷冻干燥后得到具有连通微孔结构的涂层；

(6)同实例施1步骤(6)；

(7)配制ibmx3mmol/l、地塞米松6μmol/l、吲哚美辛1.2mmol/l的负载液，溶剂为乙醇；

(8)将负载生物活性分子后的涂层置于100％相对湿度下24h，涂层中的微孔结构会自发的愈合，已有的释放结果显示生物活性分子的释放时间超过16天，所以适合进行脂肪源性干细胞的成脂分化；

(9)同实例施2步骤(9)；

(10)每4d换液，持续诱导培养17天；

(11)经过hoechst33342染色后在荧光下观察到细胞核的存在，经过油红o染色后脂肪呈现红色，说明脂肪源性干细胞成功分化为脂肪细胞，这种方法培养细胞可以使细胞在涂层上生长，染色后的玻片可以轻易取出，易于细胞的转移。

上述实施例只是为了让熟悉此项技术的认识能够了解本发明多的内容并据以实施，并不能够以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。