一种鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物及方法与流程

本发明涉及生物技术领域。具体地说是一种鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物及方法。

背景技术

长柄扁桃(prunuspedunculatapall)、蒙古扁桃(prunusmongolicamaxim)和榆叶梅(prunustrilobalindl)是我国特有的经济林树种，自然分布于内蒙古、辽宁、河北、山西、陕西、甘肃等地区，具有极强的抗寒、抗旱特性，是我国半干旱荒漠化区生态建设的优选树种。经研究发现，长柄扁桃种子含油率约56％，含油率高于蒙古扁桃和榆叶梅，其油中富含不饱和脂肪酸(96％～98％)，居所有植物油榜首，其中油酸含量高于70％，属于高油酸植物油，与素有“食用植物油皇后”美称的橄榄油相当，是可直接食用的功能保健油。2013年国家卫生计生委将长柄扁桃纳入我国木本粮油树种，可见，长柄扁桃在保障我国粮油安全和生态安全中的重要地位。扁桃属植物中，长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅同为多年生灌木，分布广泛，种质资源极为丰富，由于蒙古扁桃、榆叶梅与长柄扁桃生长环境相似，且三者全具有相似的形态特征等原因，生产及市场上常有以蒙古扁桃、榆叶梅冒充长柄扁桃的现象。伪品蒙古扁桃、榆叶梅与长柄扁桃的含油率及脂肪酸组分不一样，不能代替长柄扁桃的经济效益，因此，在市场流通时需要准确相互辨别。

目前，对长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的鉴定主要通过形态性状和显微鉴别等传统鉴定方法，而传统鉴定方法需要3-5年的生长周期且依赖的熟练的专业知识，不利于推广。

近年来，随着分子生物学及生物信息学的飞速发展，dna条形码鉴别技术因不受环境及形态特征的影响，操作简单易行，且重复性和稳定性高等优点，已成为动植物鉴定的有效工具。植物dna条形码中，可用的基因组dna有核基因组dna(nrdna)、叶绿体基因组dna(cpdna)和线粒体基因组dna(mtdna)，其中，nrdna的进化速率最快，是细胞核内全自主的遗传系统，其结构与组成极为复杂，各基因家族形成功能调控网络，并且很多基因出现多拷贝现象，存在直系同源和旁系同源等问题。而mtdna易发生基因重排、重复和丢失，并且植物mtdna拷贝数较低，提取和纯化较难，因此，在植物鉴定中nrdna和mtdna的应用范围有限。相比于nrdna和mtdna，cpdna既不存在较多的重复序列，也不出现频繁的重排事件，它不受遗传重组的影响，对鉴别复杂的物种具有特殊意义。同时，叶绿体基因组绝大数属于母系遗传，具有相对独立的演化路线，其进化速率适中，较适用于属及种等低分类阶元的鉴定分析。植物叶绿体基因trnk-uuu在光合作用中具有重要作用，由于其功能的限制，trnk-uuu基因进化速度较慢，在属及种的水平上遗传变异较小，具有通用性强、易扩增等特点，在植物鉴别研究中常选取作为分子鉴定的dna条形码。可以结合dna快速提取检测技术，寻找和建立3种扁桃属植物便捷的鉴定方法。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子鉴别引物及方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物，分子标记引物为叶绿体基因组。

上述的鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；

所述正向引物tkf的序列(如seqidno:1所示)：actcgaacccggaactag，

所述反向引物tkr的序列(如seqidno:2所示)：cgaccgatttctgcgtat。

一种鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的方法，包括如下步骤：

(1)叶片样本的采集；

在步骤(1)中，采集各地区鲜嫩、健康和无病虫害的长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的叶片样本，组成长柄扁桃叶片样本群、蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群。

(2)叶片样本总基因组dna的提取；

在步骤(2)中，通过植物dna快速提取试剂盒，提取长柄扁桃叶片样本、蒙古扁桃叶片样本和榆叶梅叶片样本的总基因组dna。

(3)利用鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组dna中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；

在步骤(3)中，鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物，包括正向引物和反向引物；

所述正向引物tkf的序列(如seqidno:1所示)：actcgaacccggaactag，

所述反向引物tkr的序列(如seqidno:2所示)：cgaccgatttctgcgtat；

所述目标片段序列为：trnk-uuu。

在步骤(3)中，

pcr扩增反应体系为：为20ul的混合体系，包括由0.2μl的2×taqplusmastermix，1μl的叶片样本总基因组dna，2μl的10×buffer，0.5μl的正向引物,0.5μl反向引物，0.5μl的dntp，0.5μl的dmso和14.8μl的无菌去离子水ddh2o；所述叶片样本总基因组dna的浓度为10～20ng·μl^-1,整箱引物和反向引物的浓度均为0.8μmol·l^-1，dntpcr的浓度为0.25mol·l^-1，dmso的质量含量为10％；

pcr反应程序为：

(p-1)95℃预变性5min，

(p-2)95℃变性30s，

(p-3)52℃的退火30s，

(p-4)72℃延伸30s，

(p-5)步骤(p-1)到步骤(p-4)循环30次，

(p-6)72℃终延伸5min。

(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；

在步骤(4)中，用dna分析仪对步骤(3)中得到pcr扩增产物，进行检测。

(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。

在步骤(5)中，用genedoc和dnaman软件进行序列比对，获得长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的碱基差异，进行物种间的鉴别。

在步骤(5)中，将长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的碱基差异作为鉴别种质的分子标记，长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的碱基差异如下：

(1)在第75个碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群有碱基a的插入，而蒙古扁桃在此处有碱基a的缺失；

(2)在第246碱基位置处长柄扁桃叶片样本群有碱基atagaaataaatgcaaatttttt的插入，而蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群在此处有碱基atagaaataaatgcaaatttttt的缺失；

(3)在第292碱基位置处长柄扁桃叶片样本群的碱基为g，而蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群在此处的碱基为t；

(4)在第358碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的碱基为t，而蒙古扁桃叶片样本群在此处的碱基为c；

(5)在第429碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的碱基为a，而蒙古扁桃叶片样本群在此处的碱基为g。

有益效果

1.利用正向引物tkf和反向引物tkr对长柄扁桃叶片、蒙古扁桃叶片和榆叶梅叶片样本的总基因组dna扩增，对扩增得到的叶绿体dnatrnk-uuu基因间隔短片段序列比对结果，可看出长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅序列间存在5个碱基变异位点，分别为3个转换，2个插入/缺失。长柄扁桃群体个体间扩增结果一致，蒙古扁桃群体个体间扩增结果一致，榆叶梅群体个体间扩增结果亦一致，均表现出高度的一致性。该方法的结果稳定，可重复性强，保证了极高的准确性，因此，正向引物tkf和反向引物tkr基于trnk-uuu基因间隔区的碱基差异可以作为鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的种质区分的分子标记引物，且鉴别方法简单，易操作。

2.由于叶绿体基因拷贝数比核基因多，较核基因，叶绿体基因不易受dna降解的影响，因此，叶绿体dna的条形码更适于各种植物的分子鉴别。

3.传统的形态特征检测方法，需植物叶、花、果实等的长时间(3-5年)观察和鉴定才能完成，且易受环境及人为的影响，本发明只需一片叶即可对样品进行快速识别，大大提高了检测速度和效率，为本发明借鉴该方法建立了快速简便的检测体系。

附图说明

图1利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取长柄扁桃叶片样本、蒙古扁桃叶片样本和榆叶梅叶片样本的dna质量图的电泳检测图，(1-5为长柄扁桃叶片样本，6-10为蒙古扁桃叶片样本，11-15为榆叶梅叶片样本)；

图2利用琼脂糖凝胶电泳检测长柄扁桃叶片样本、蒙古扁桃叶片样本和榆叶梅叶片样本的trnk-uuu基因特异pcr扩增产物的电泳检测图，(1-5为长柄扁桃叶片样本，6-10为蒙古扁桃叶片样本，11-15为榆叶梅叶片样本)；

图3长柄扁桃叶片样本、蒙古扁桃叶片样本和榆叶梅叶片样本鉴别方法示意图的左半部分(1-5为长柄扁桃叶片样本，6-10为蒙古扁桃叶片样本，11-15为榆叶梅叶片样本)；

图4长柄扁桃叶片样本、蒙古扁桃叶片样本和榆叶梅叶片样本鉴别方法示意图的右半部分(1-5为长柄扁桃叶片样本，6-10为蒙古扁桃叶片样本，11-15为榆叶梅叶片样本)。

具体实施方式

仪器与材料

pcr仪(eppendorf，型号5332)，低温冷冻离心机(eppendorf，型号5810r),微量移液器(eppendorf)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号dyy—12)，凝胶成像分析仪(bio-radchemidocxrs)，abi3500xl(appliedbiosystems，usa)dna分析仪。

植物dna快速提取试剂盒(北京天根公司)，tae缓冲液，琼脂糖(promega公司)，goldview(北京索莱宝科技有限公司)，dnataq聚合酶(takara公司)，三氯甲烷、无水乙醇为国产分析纯。

实施例1

1.叶片样本的采集

样品是由内蒙古林木良种繁育中心鉴定并收集，采自不同产地的长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的鲜嫩、健康、无病虫害的叶片样本各5份。如表1所述。

表1长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的叶片样本及来源

2.叶片样本总基因组dna的提取

通过植物dna快速提取试剂盒，对叶片样品总基因组dna进行提取，并基于1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，结果显示如图1所述，电泳条带的亮度、均匀度及点样口光点等均显示良好，表明样品纯度高，无污染，可直接用于后续分子生物学实验。

3.pcr扩增供叶片样本总基因组dna中的目标基因序列

利用特异引物正向引物tkf和反向引物tkr扩增目标片段序列trnk-uuu序列；

所述正向引物tkf的序列(如seqidno:1所示)：actcgaacccggaactag，

所述反向引物tkr的序列(如seqidno:2所示)：cgaccgatttctgcgtat。

pcr扩增反应体系为：为20ul的混合体系，包括由0.2μl的2×taqplusmastermix，1μl的叶片样本总基因组dna，2μl的10×buffer，0.5μl的正向引物,0.5μl反向引物，0.5μl的dntp，0.5μl的dmso和14.8μl的无菌去离子水ddh2o；所述叶片样本总基因组dna的浓度为10～20ng·μl^-1,整箱引物和反向引物的浓度均为0.8μmol·l^-1，dntpcr的浓度为0.25mol·l^-1，dmso的质量含量为10％；

pcr反应程序为：

(p-1)95℃预变性5min，

(p-2)95℃变性30s，

(p-3)52℃的退火30s，

(p-4)72℃延伸30s，

(p-5)步骤(p-1)到步骤(p-4)循环30次，

(p-6)72℃终延伸5min。

4.对扩增产物进行纯化和测序

采用abi3500xl(appliedbiosystems，usa)dna分析仪对15个叶片样品的pcr扩增产物进行检测。

5.对测序结果进行比对分析

对测序所得的15个叶片样本的trnk-uuu基因间隔片段序列，用genedoc和dnaman软件进行序列比对，获得长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的特异indel和snp，进行物种间的鉴别。

实施例2结果分析

对pcr产物进行纯化后，进行双向测序，并对长柄扁桃叶片样本群、蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的序列进行比对，长柄扁桃叶片样本群、蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群在叶绿体基因trnk-uuu片段序列的比对结果为：

长柄扁桃：

actcgaacccggaactagtcggatggagtagataatttccttgattagaaaattttaaataaaatagggaaaaa(a)⁺cccctccccaaaccgtgcttgcatttttcattgcacacggctttccctatgtatacatctaaaattcagtcccttccctatacacgactctaagaaagttgaatactcagttgatcgaccctcaatcttactgtatgaacatttcataatagaaataaatgcaaatttttt(atagaaataaatgcaaatttttt)⁺gttatctcttcattatttaaagagaattccatttctacgatcgcataaccaattattcataattgattagatcattgatgcaaaaaatatccaaataccaaatccgacctctataaaatttcttaaaagtaaaagtataagaagctcttgggaagaccaaagaaagaatctgttcttcttccgtaaagaattcttccaataatttagaacctaatcttttcaaaaaagttcgtacagtacttttgtgtttacgagccaaagttttaagacaagaaagtcgaagtatatattttattcgatacaaactcttttttcttgaggatccgctgtaataatgagaaagatttctgcatatacgcagaaatcggtcg

2蒙古扁桃：

actcgaacccggaactagtcggatggagtagataatttccttgattagaaaattttaaataaaatagggaaaaa-cccctccccaaaccgtgcttgcatttttcattgcacacggctttccctatgtatacatctaaaattcagtcccttccctatacacgactctaagaaagttgaatactcagttgatcgaccctcaatcttactgtatgaacatttcataatagaaataaatgcaaatttttt-----------------------gttatctcttcattatttaaagataattccatttctacgatcgcataaccaattattcataattgattagatcattgatgcaaaaaatacccaaataccaaatccgacctctataaaatttcttaaaagtaaaagtataagaagctcttgggaagaccaaggaaagaatctgttcttcttccgtaaagaattcttccaataatttagaacctaatcttttcaaaaaagttcgtacagtacttttgtgtttacgagccaaagttttaagacaagaaagtcgaagtatatattttattcgatacaaactcttttttcttgaggatccgctgtaataatgagaaagatttctgcatatacgcagaaatcggtcg

3榆叶梅：

actcgaacccggaactagtcggatggagtagataatttccttgattagaaaattttaaataaaatagggaaaaaacccctccccaaaccgtgcttgcatttttcattgcacacggctttccctatgtatacatctaaaattcagtcccttccctatacacgactctaagaaagttgaatactcagttgatcgaccctcaatcttactgtatgaacatttcataatagaaataaatgcaaatttttt-----------------------gttatctcttcattatttaaagataattccatttctacgatcgcataaccaattattcataattgattagatcattgatgcaaaaaatatccaaataccaaatccgacctctataaaatttcttaaaagtaaaagtataagaagctcttgggaagaccaaagaaagaatctgttcttcttccgtaaagaattcttccaataatttagaacctaatcttttcaaaaaagttcgtacagtacttttgtgtttacgagccaaagttttaagacaagaaagtcgaagtatatattttattcgatacaaactcttttttcttgaggatccgctgtaataatgagaaagatttctgcatatacgcagaaatcggtcg

其中，“()⁺”表示碱基序列插入；“-”表示碱基序列缺失；有下划线“_”的碱基与对应的碱基为转换特异变异。

由长柄扁桃叶片样本群、蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的trnk-uuu基因片段序列排序结果，可看出其间存在5个变异位点，分别为3个转换，2个插入/缺失，可将三个种有效鉴别：

(1)在第75个碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群有碱基a的插入，而蒙古扁桃在此处有碱基a的缺失；

(2)在第246碱基位置处长柄扁桃叶片样本群有碱基atagaaataaatgcaaatttttt的插入，而蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群在此处有碱基atagaaataaatgcaaatttttt的缺失；

(3)在第292碱基位置处长柄扁桃叶片样本群的碱基为g，而蒙古扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群在此处的碱基为t；

(4)在第358碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的碱基为t，而蒙古扁桃叶片样本群在此处的碱基为c；

(5)在第429碱基位置处长柄扁桃叶片样本群和榆叶梅叶片样本群的碱基为a，而蒙古扁桃叶片样本群在此处的碱基为g。

测序结果表明，长柄扁桃叶片样本群5个个体扩增结果一致，蒙古扁桃叶片样本群5个个体扩增结果一致，榆叶梅叶片样本群5个个体扩增结果亦一致，均表现出高度的一致性，结果稳定且可重复性强，保证了极高的准确性，因此，基于trnk-uuu基因间隔区的碱基差异可作为鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的种质区分的分子标记引物，且鉴别方法简单，易操作。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>内蒙古农业大学

<120>一种鉴别长柄扁桃、蒙古扁桃和榆叶梅的分子标记引物及方法

<150>2018105050166

<151>2018-05-24

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

actcgaacccggaactag18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgaccgatttctgcgtat18