一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法与流程

本发明属于生物疫苗领域，具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法。
背景技术：
：猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的一种急性、高度接触性的猪肠道传染病，以腹泻、呕吐和脱水为主要特征。各年龄阶段猪均易感，发病率100％，死亡率80％～100％。给世界养猪业造成了巨大的经济损失。pedv为冠状病毒科(coronviridae)冠状病毒属(coronavirus)成员。其基因组是单股正链rna病毒，全长27000～33000个核苷酸(nt)，分子量为6×106～8×106。pedv和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)同属于i群冠状病毒家族，具有典型的冠状病毒形态：多样性，倾向圆形，外有囊膜包裹，囊膜上有呈放射性排列的花瓣状纤突，病毒粒直径约为130nm，本病毒对乙醚、氯仿及其他脂溶剂敏感，在4℃ph5.0～9.0和37℃ph6.5～7.5稳定，抵抗力不强，一般的消毒液均可将其杀死。pedv的主要结构蛋白有s(spikeprotein)蛋白、m(membraneprotein)蛋白、e(envelopeprotein)蛋白和n(nucleocapsidprotein)蛋白。s蛋白由1383个氨基酸组成，分子量为180～220ku，构成病毒粒子表面呈皇冠状的纤突，也俗称“冠”。s蛋白在受体细胞结合吸附、膜融合等方面发挥着重要作用，是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白，s变异会改变pedv毒株的免疫原性，从而导致现有疫苗的失败。故pedv的纯化的好坏关在在于“冠”的保存程度纯化后“冠”越完整，其免疫活性就越好。该病1971年首次在英国被发现，随后，其它欧洲国家和部分亚洲国家相继报道了该病的发生与流行。我国是上世纪80年代初首次发生pedv；2010年冬季以来，流行性腹泻在我国10多个省市暴发并呈现新的流行特征：发病率和致死率高、流行广、损失大，而且以前接种过猪流行性腹泻疫苗的猪也未能幸免，提示该流行毒株毒力较强，而且可能与现有疫苗毒株存在较大的差异，导致现有疫苗难以提供免疫保护。预防ped的主要方式是疫苗免疫，由于该病没有特效治疗药物，早期血清学检测是预防和控制该病的关键。酶联免疫吸附法(elisa)是一种常用的检测血清抗体的方法，经济实用，特别适合大规模检测。然而，用细胞培养病毒作为抗原存在一定的非特异，这是因为用vero细胞培养的pedv免疫猪获得的猪血清可与elisa中细胞组分蛋白抗原反应，从而诱导高背景和特异性低。故去除高背景和提高反应特异性，迫切需要获得高质量的病毒抗原。目前病毒浓缩和纯化的方法主要有：蔗糖密度梯度超速离心法，尺寸排阻色谱法和硫酸铵沉淀。然而，pedv颗粒脆弱，无法承受超速离心或高浓度盐的高渗作用，故有必要开发新的工艺提纯pedv。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种回收率高，无外源蛋白，纯度和回收率高且不影响猪流行性腹泻病毒活性的细胞培养猪流行性腹泻病毒的纯化方法。为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，包括以下步骤：(1)采用复合模式介质captocore700，通过层析柱对所述猪流行性腹泻病毒的病毒培养液进行粗提得到病毒粗提液；(2)在所述病毒粗提液中加入终浓度体积比为5％-15％的peg8000进行浓缩处理。所述病毒培养液通过如下病毒培养方法获得：用vero细胞，dmem基本培养基对猪流行性腹泻病毒cv777疫苗株进行培养，当细胞出现70％以上的病变时，收集病毒液，-20℃冻融一次，得到病毒培养物。所述病毒培养方法还包括：将所述病毒培养物4℃低速3000rpm离心30min，收集上清，经0.45um滤器过滤得到所述病毒培养液。离心目的是去掉细胞碎片，过滤目的是去掉病毒上清中的分子量大于该病毒的杂质。步骤(1)中的所述粗提指：将所述复合模式介质captocore700搅拌均匀加入所述层析柱内，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3个柱体积；再用病毒纯化缓冲液以0.8ml/min的流速对柱子平衡2个柱体积，将所述适量病毒培养液加到层析柱中，收集得到的流穿液即所述病毒粗提液。上述各流速均为优化后的流速，目的在于使最终的纯化效果达到最优。所述层析柱为xk16/20，gehealthcare层析柱。步骤(2)中的所述浓缩处理指：在流穿液中加入终浓度为体积比10％的peg8000，4℃冰箱冷藏过夜，使病毒充分沉淀浓缩；将peg沉淀处理的样品在10000g离心30分钟，弃上清，加入适量病毒纯化缓冲液重悬；将沉淀后的病毒加入缓冲液重悬有利于后续的病毒保存。离心的目的在于将经peg析出的病毒分子进一步通过离心处理进行沉淀、分离。peg8000为水溶性非离子型聚合物，用于病毒沉淀的分子量主要为2000～6000的peg。我们在这里选用peg8000，主要在于：peg的沉淀效果主要与本身的分子量有关，同时还受离子强度、溶液、ph值和温度等因素的影响。在一定条件下，peg浓度越高，浓缩效果越好，但是peg浓度高会使较小的非病毒蛋白也会浓缩沉淀，故应该选择合适的peg浓度。在一定ph值下，盐浓度越高，所需peg的浓度越低，溶液的ph值越接近目的物的等电点，沉淀所需peg浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的peg沉淀的效率高。peg8000为液体中不同分子的分布和分离提供良好的媒介环境，在这种环境中有利于病毒这类大分子从溶液中沉淀析出，而液体中的其它分子量较小的物质则仍以溶解态存在于液体中。采用体积比5％-15％的peg8000能使这种沉淀析出效果一个优异的效果程度。故，在保持病毒本身最优特性的条件下，针对猪流行性腹泻病毒本身的特点，经过多次试验，筛选出一个最优peg浓缩病毒的浓度范围为体积比5％-15％的peg8000。一种用于纯化猪流行性腹泻病毒的试剂盒，包括挂载有复合模式介质captocore700的层析柱和peg8000；所述载有复合模式介质captocore700的层析柱用于粗提所述纯化猪流行性腹泻病毒的病毒培养液；所述peg8000用于对所述粗提所得产物进行浓缩处理。所述浓缩处理指在所述粗提所得产物中加入一定比例的peg8000。所述试剂盒还包括病毒培养领域和/或，病毒纯化领域的常规试剂；例如，vero细胞、emem基本培养基、病毒纯化缓冲液、双蒸水等。所述的纯化方法，和/或所述的试剂盒在病毒纯化领域的应用。在本发明最具体的实施例中，所述纯化方法包括如下步骤：1)病毒培养：用vero细胞，emem基本培养基对猪流行性腹泻病毒cv777疫苗株进行培养，当细胞出现70％以上的病变时，收集病毒液，-20℃冻融一次。2)细胞培养的猪流行性腹泻病毒培养物4℃低速3000rpm离心30min，收集上清，经0.45um滤器过滤，4℃保存备用。3)抗原粗提(1)层析柱固定，将captocore700介质搅拌均匀加入柱内(xk16/20，gehealthcare)，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3个柱体积。(2)上样前用病毒纯化缓冲液以0.8ml/min的流速(3)平衡2个柱体积，再将100ml步骤2)获得的病毒液加到层析柱中。收集流串液。pedv纯化色谱分析见图1。4)抗原精提用peg8000对步骤3)中的流穿液进行浓缩处理：在流穿液中加入终浓度为10％的peg8000，4℃冰箱冷藏过夜。将peg沉淀处理的样品在10000g离心30分钟，弃上清，加入适量病毒纯化缓冲液重悬，冻存于-20℃备用。5)纯化病毒抗原鉴定(1)sds-page鉴定：取步骤4)获得病毒液样品30ul，加入10ul5×上样buffer，混匀。水浴煮沸5min，12000rpm离心5min。取20ul离心上清缓慢加入到sds-page凝胶上样孔内，设置电压80v运行20min，调整电压至120v运行到溴酚蓝指示剂跑至蛋白胶下沿。取出凝胶经染色脱色后观察蛋白条带及其分布情况。结果显示，获得了较纯的病毒抗原(见图2)。(2)电子显微镜观察：用步骤4)获得的病毒纯化抗原经负染色后进行电子显微镜观察，检查病毒粒子完整情况。结果显示，pedv粒子较完整，可见完整的“冠”(见图2)。(3)半数组织细胞感染量(tcid50)：通过vero细胞的终点稀释法测定病毒的tcid50。用纯化的pedv病毒抗原、pedv粗纯液(captocore700流穿)和pedv细胞培养毒用无血清dmem做倍比稀释(10-4、10-5、10-6和10-7)，同时设空白细胞对照。结果见表1。纯化的病毒tcid50为1×104.38，captocore700流穿病毒液的tcid50为1×104.38，说明病毒经过captocore700粗纯病毒毒力得到100％的恢复；经过peg纯化的病毒悬液的tcid50为106.33，回收率为91.2％。(4)抗原反应活性鉴定：用间接elisa方法对纯化的抗原进行鉴定。用pedv阳性血清、阴性血清进行反应。结果显示，纯化的pedv抗原和pedv阳性血清反应，和阴性血清不反应。(5)特异性鉴定：用间接elisa方法对纯化的pedv抗原进行鉴定，猪瘟阳性血清、猪蓝耳病毒阳性血清、猪圆环病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清作为一抗。结果显示，纯化的pedv抗原均不和这些阳性血清有反应，具有很好的特异性。本发明提供一种猪流行性腹泻病毒的纯化方法，该技术方案主要通过复合模式介质captocore700对pedv细胞培养毒进行粗纯，以便去除培养液中的残余细胞宿主蛋白和dna；再用peg8000沉降病毒，同时间接去除粗纯中部分杂蛋白。结果显示，病毒回收率高达91.2％，杂蛋白去除率在95％以上，且回收得到的病毒毒力能获得100％的恢复。本发明纯化的pedv各抗原组分保持完好，纯化后的病毒粒子具有完整的“冠”，抗原活性较好。而现有技术披露的使用锚定融合蛋白-gem颗粒形成的复合物结合法纯化病毒，虽然也能获得较纯的病毒，免疫活性和反应活性尚可，但得到的病毒是一种复合物，不是单一病毒抗原，且该方法回收得到的病毒粒子得不到完整的“冠”以及完好的抗原活性，病毒毒力也得不到完全恢复，因此这种方法回收得到的病毒不适用于进行攻毒实验。相比之下，本发明的纯化方法，不仅得到了单一的完整的病毒粒子，纯化后的病毒依然保持100％的病毒毒力，且保留了完好的抗原活性，能够很好地用来进行攻毒实验。本发明提供了一种组合方法对pedv进行分级纯化，最大程度去除细胞杂质蛋白，获得高纯度的病毒颗粒。弥补了pedv纯化抗原的不足：细胞组分引起的非特异或病毒粒子不完整等因素，为开发pedv疫苗和检测用抗原奠定基础。本发明所用方法，操作简单、工艺温和、重复性好、回收率高、抗原好、且成本较低，去除杂蛋白相对比较彻底。此纯化病毒抗原可用于检测、疫苗等领域，为pedv的防控奠定基础。附图说明图1为pedv色谱纯化分析。图2为纯化病毒抗原sds-pagesds-page鉴定，泳道1：sepharose4fastflow介质纯化pedv抗原；泳道2：本发明方法纯化pedv抗原；m为低分子量蛋白marker。图3纯化pedv病毒粒子的电镜观察结果，其中，a：未纯化pedv；b:sepharose4fastflow纯化pedv；c：本发明的方法纯化的pedv。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。材料来源vero细胞:为本实验室保存；pedv疫苗株cv777毒株为本实验室从吉林正业生物制品股份有限公司的猪三联活疫苗(猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)中分离并保存。血清：pedv阳性血清和阴性血清为本实验室制备并保存，猪伪狂犬阳性血清、猪蓝耳病毒阳性血清、猪口蹄疫阳性血清、猪圆环病毒阳性血清为申请人实验室收集保存。申请人承诺自本申请申请日起20年内可向公众发放用于验证本发明的效果。仪器与试剂仪器：高速离心机(beckmancoulter)；低压层析柱(2.6x100cm)和geaktapure蛋白层析纯化系统(gehealthcare))；ph酸度计(；梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；紫外分光光度仪；(英国柏点)。耗材：15ml100kdmwco超滤浓缩管为millipore产品；peg8000为sigma产品；dmem基本培养基为gibco产品；captocore700层析填料为gehealthcare产品。实施例1、本发明所述pedv纯化抗原的获得1.病毒培养及收集选取生长至单层的vero细胞，按照2％的比例接种pedv种毒，37℃吸附1小时后，补入含2％犊牛血清的dmem维持液培养，37℃5％co2培养箱静置培养，当细胞病变(cpe)达到70％以上时(接种后48h左右)，停止培养，并将培养瓶放置-20℃冻融一次，收集病毒培养液。病毒液4℃3000r离心30min，收集上清液，存放在4℃进一步纯化。2.病毒纯化1)抗原粗提①装柱准备：首先将层析柱固定，将captocore700介质搅拌均匀加入柱内(xk16/20，gehealthcare)，让填料自然沉降，待填料完全沉降后，将装填好的层析柱连接到纯化设备上(上海琪特分析仪器有限公司)，用双蒸水以1ml/min的流速冲洗3-5个柱体积。②平衡：调节流速为0.8ml/min，用超纯水继续冲洗3个柱体积，然后用病毒缓冲液平衡5个柱体积备用。③上样：先用病毒纯化缓冲液(该“病毒纯化缓冲液”为病毒纯化领域常规的用来纯化病毒的缓冲液，例如，可以是ste缓冲液，pbs缓冲液或其它缓冲液)冲洗2个柱体积，流速为0.8ml/min。再将100ml步骤1获得的病毒液加到层析柱中，收集流串液。pedv纯化色谱分析见图1。色谱纯化分析结果显示，经captocore700纯化的pedv只出现单一峰，得到了较纯的目的病毒抗原。2)抗原精提①向上步流串液中加入60％的peg8000，peg终浓度为10％，置于4℃冰箱放置过夜。②将peg沉淀的样品10000g离心30分钟，弃上清，每100毫升流穿液处理得到的沉淀用500ul病毒纯化缓冲液重悬，即得到纯化的pedv抗原，冻存于-70℃备用。创新之处：病毒培养液通过粗提层析(captocore700介质)，去除培养液中大部分残余细胞宿主蛋白和dna；再经精提浓缩(peg8000沉降)，去除部分粗纯中残余的杂蛋白，最终获得了较纯的病毒抗原。实施例2、本发明所述pedv抗原的质量检测1.蛋白浓度测定用紫外光分光光度计测定纯化的pedv在260nm和280nm波长的光吸收值，按照以下公式计划样品中的蛋白浓度：抗原浓度(mg/ml)＝(1.45×a280-0.74×a260)×稀释倍数。测定结果显示纯化的pedv抗原浓度为0.426mg/ml。2.sds-page鉴定取实施例1获得的pedv纯化抗原样品40ul，加入10ul5×上样buffer，混匀。水浴煮沸5min，12000rpm离心5min。按照表1中的配方配制分离胶和积层胶。取20ul离心上清缓慢加入到sds-page凝胶上样孔内，设置电压80v运行，待溴酚蓝指示剂压至一条线并进入分离胶(20min左右)，调整电压至120v运行到溴酚蓝指示剂跑至蛋白胶下沿。取出凝胶经染色脱色后观察蛋白条带及其分布情况。结果显示，与用sepharose4ff纯化的pedv相比，本发明纯化病毒抗原看到明显完整s蛋白(180～200kda)、n(55～58kda)、m(27～32kda)和e(8.8kda)，获得了较纯且完整的病毒抗原(见图2)。表1sds-page电泳胶的配方3.电子显微镜观察将实施例1获得的病毒纯化抗原悬浮液滴在干燥的载玻片上(同时作pedv培养上清和sepharose4ff纯化抗原对照)，把带有支持膜的铜网放在悬浮液滴上漂浮以获取样品，用滤纸吸干铜网上的多余悬液；再将染色液滴在干燥的载玻片上，把铜网放在染色液滴上漂浮1～2min，最后用滤纸吸干铜网上的多余染液。1.0％磷钨酸负染法制备铜网后电子显微镜观察。结果显示，和纯化前病毒抗原相比，用本发明纯化方法(图3c)具有完整的病毒棘突(冠)，无明显其他颗粒，而sepharose4ff纯化病毒(图3b)棘突丢失严重，说明本发明方法比较温和，对包膜蛋白没有大的破坏，且去除了绝大部分的杂蛋白，比较适合冠状病毒纯化。4.半数组织细胞感染量(tcid50)通过终点稀释法测定病毒的tcid50。将纯化的pedv病毒抗原、pedv粗纯液(captocore700流穿)和pedv细胞培养毒用无血清dmem做倍比稀释(10-4、10-5、10-6和10-7)，同时设空白细胞对照。结果见表2。纯化的病毒tcid50为1×104.38，captocore700流穿病毒液的tcid50为1×104.38，说明病毒经过captocore700粗纯病毒毒力得到100％的恢复；经过peg纯化的病毒悬液的tcid50为106.34，回收率为91.2％。本组合方法纯化的pedv抗原，经过三个步骤，杂蛋白去除率为95.28％，获得了较纯的病毒抗原。pedv纯化回收率和蛋白去除率的计算公式如下：表2pedv纯化抗原的tcid50及回收率按照上述同样的步骤依次试验了下表中不同体积比的peg8000的纯化效果，如下表3所示：表3不同体积比peg处理后的病毒回收率和杂蛋白去除率peg8000体积比病毒回收率(％)杂蛋白去除率(％)5％82.0120.17％84.5219.258％85.3118.8610％89.1217.1912％89.1315.0314％89.5614.5215％90.0114.315.抗原特异性鉴定用间接elisa方法对纯化的抗原进行鉴定。具体方法如下：包被：用纯化的pedv抗原样品作为包被抗原，将其用碳酸盐缓冲液(0.05mol/l，ph9.6)稀释成0.025μg/ml、0.05μg/ml及0.1μg/ml.向96孔酶联反应板孔加100μl，在2～8℃下包被18-24h，取出，弃孔中抗原包被液。封闭：加封闭液(100gtris，50g酪蛋白，500g蔗糖，加水至30l，ph7.5)至包被的酶联反应板各孔中，330μl/孔，室温下封闭1h，弃去封闭液，洗板5次。加样：将pedv阳性血清、阴性血清进行反应、猪瘟阳性血清、猪蓝耳病毒阳性血清、猪圆环病毒阳性血清和猪伪狂犬病毒阳性血清用样品稀释液(含10％马血清的pbs缓冲液)稀释10倍，加入酶联反应板反应，100μl/孔，37℃孵育60min，弃去反应液，洗板5次。加酶标记物：每孔加入100μlhrpo标记spa(1：10000稀释)，37℃孵育30min。弃去反应液，洗板5次。显色：每孔加入100μltmb底物液，37℃孵育15min。每孔加入终止液100μl，并且轻轻震荡混匀。od值测定：在450nm波长下测定各孔od值。结果显示，pedv阳性血清与0.025μg/ml、0.05μg/ml及0.1μg/mlpedv纯化抗原均呈阳性反应，pedv阴性血清、猪瘟(csf)阳性血清、猪蓝耳病(prrs)阳性血清、猪圆环病毒病(pcvd)阳性血清和猪伪狂犬病(pr)阳性血清均呈阴性反应，od450值均小于0.2.结果见表4。本试验说明纯化的pedv抗原可与pedv阳性血清反应，而与pedv阴性血清以及其他病毒的阳性血清没有反应，这说明该方法纯化的抗原具有很好的特异性。表4pedv抗原elisa特异性检测结果当前第1页12