检测样本中PRCC-TFE3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒与流程

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光pcr技术，检测人类xp11.2易位/tfe3融合基因相关性肾癌患者体内prcc-tfe3融合基因的表达水平。

背景技术：

xp11.2易位/tfe3基因融合相关性肾癌(简称xp11.2易位性肾癌)是2004年who新分类出的一种肾癌独立亚型，其特征为xp11.2位点上tfe3基因发生断裂，并与prcc、aspl、psf、cltc、nono等相关基因发生平衡易位形成新的融合基因。据统计，xp11.2易位性肾癌的发病率在儿童肾癌患者中约占1/3，占45岁以下肾癌的15％，对儿童及青少年患者有极大影响。

tfe3基因的断裂主要发生在启动子与主要功能域之间，发生易位的是包含了tfe3功能域的断裂点端粒侧的全部基因，而新的融合基因的启动子来源于与tfe3基因发生融合的启动子。在基因组内，与tfe3形成融合的aspl、prcc等均属于管家基因，由于其启动子的转录活性明显高于原tfe3基因启动子，使得融合后的tfe3基因表达量升高，因而肿瘤组织高表达tfe3蛋白，这种高表达的tfe3蛋白影响细胞对转录调节的干扰作用，促进肿瘤形成。研究发现prcc-tfe3融合蛋白的转录活性大约是野生型tfe3蛋白的3倍，有可能改变转录因子的转录能力。此外，在与有丝分裂调控点蛋白mad2b相互作用时，prcc-tfe3融合蛋白可能还干扰黏合与有丝分裂调控点的功能，导致基因的异常调控，最终形成肿瘤。

xp11.2易位性肾癌具有特征性的基因改变，其诊断、治疗以及预后亦有特殊之处，而其组织形态与肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌较为相似，常规诊断极易误诊和漏诊。因此，检测prcc-tfe3融合基因对xp11.2易位性肾癌的分类诊断及个体化治疗均有重要意义。

prcc-tfe3融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(fish)、实时定量pcr技术(rq-pcr)等方法。fish检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量pcr中常见的方法有sybrgreeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在taqman技术中，rq-pcr采用taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在pcr反应管封闭状态下进行，解决了pcr产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对pcr产物的准确定量，易于统一标准，与定性pcr技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。

技术实现要素：

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量pcr技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和目的基因prcc-tfe3的定量标准曲线，检测目的基因prcc-tfe3相对于内参基因β-actin的表达水平。通过调整目的基因和内参基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳，从而能够满足prcc-tfe3融合基因的检测，用于评价治疗效果、预测预后。

本发明中的“prcc-tfe3cdna序列”指的是prcc-tfe3融合基因经转录后产生的mrna经逆转录后产生的cdna序列，或者根据这种cdna序列通过化学合成手段直接合成出。将不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的prcc-tfe3cdna序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。

本发明提供用于检测样本中prcc-tfe3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13。

本发明还提供一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的rna；

(2)将(1)提取出的rna逆转录为cdna；

(3)加入(2)中所述的cdna到反应管中，利用针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的1型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；利用针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的2型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；利用针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的3型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；利用针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的4型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13；

(4)根据(3)中的1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3或4型prcc-tfe3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3或4型prcc-tfe3的相对表达量。

本发明还提供一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr反应液，所述检测体系pcr反应液包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

进一步地，所述引物和探针还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有prcc-tfe3cdna序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述阳性质粒包括含有1型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒、含有2型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒、含有3型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒和含有4型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒。

进一步地，所述试剂盒还包括样本rna提取试剂，所述样本rna提取试剂包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。

进一步地，所述样本rna提取试剂还包括红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钠和12.5μmol/ledta-na2。

本发明的有益效果：将实时荧光pcr技术结合采用taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因β-actin和aspl-tfe3目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内aspl-tfe3的表达。相比于以往的fish和△△ct法等检测手段，该方法具有精确度高，结果便于判读等优点。加之该方法将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该方法经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，可为人类xp11.2易位/tfe3融合基因相关性肾癌患者的治疗提供参考和依据，有助于个体化医疗方案的制定。此外，根据tfe3基因的断裂位点的不同，prcc-tfe3融合基因可分为4种不同的类型：1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3和4型prcc-tfe3，本发明根据不同类型的prcc-tfe3融合基因的序列特征，让1型prcc-tfe3和2型prcc-tfe3共用上游引物和探针，这样就可减少引物和探针的使用数量，从而降低检测成本。

附图说明

图1为阳性质粒扩增曲线图：(a)pmd18-t/prcc-tfe3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)pmd18-t/prcc-tfe3-2阳性质粒扩增曲线图；(c)pmd18-t/prcc-tfe3-3阳性质粒扩增曲线图；(d)pmd18-t/prcc-tfe3-4阳性质粒扩增曲线图。

图2为灵敏度检测结果图：(a)100copies/μlpmd18-t/prcc-tfe3-1阳性质粒扩增曲线图；(b)100copies/μlpmd18-t/prcc-tfe3-2阳性质粒扩增曲线图；(c)100copies/μlpmd18-t/prcc-tfe3-3阳性质粒扩增曲线图；(d)100copies/μlpmd18-t/prcc-tfe3-4阳性质粒扩增曲线图。

图3为外周血样本(样本3)的荧光pcr检测结果图：(a)3号血液样本的prcc-tfe3-1扩增曲线图；(b)3号血液样本的prcc-tfe3-2扩增曲线图；(c)3号血液样本的prcc-tfe3-3扩增曲线图；(d)3号血液样本的prcc-tfe3-4扩增曲线图。

图4为肾组织样本(样本2)的荧光pcr检测结果图：(a)2号肾组织样本的prcc-tfe3-1扩增曲线图；(b)2号肾组织样本的prcc-tfe3-2扩增曲线图；(c)2号肾组织样本的prcc-tfe3-3扩增曲线图；(d)2号肾组织样本的prcc-tfe3-4扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

用于检测样本中prcc-tfe3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13。

用于检测样本中prcc-tfe3融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括(1)～(4)：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13。

一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本中的rna；

(2)将(1)提取出的rna逆转录为cdna；

(3)加入(2)中所述的cdna到反应管中，利用针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的1型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；利用针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的2型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；利用针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的3型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；利用针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针检测样本中的4型prcc-tfe3的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10；利用针对β-actin内参基因的上下游引物和探针检测样本中的β-actin内参基因的荧光信号，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13；

(4)根据(3)中的1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3或4型prcc-tfe3的荧光信号和β-actin内参基因的荧光信号，确定样本中的1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3或4型prcc-tfe3的相对表达量。

一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr反应液，所述检测体系pcr反应液包括(1)～(4)中的至少一种：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

一种检测样本中prcc-tfe3融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr反应液，所述检测体系pcr反应液包括(1)～(4)：(1)针对1型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、2和4；(2)针对2型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:1、3和4；(3)针对3型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:5、6和7；(4)针对4型prcc-tfe3的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:8、9和10。

进一步地，所述寡核苷酸还包括针对β-actin内参基因的上下游引物和探针，其碱基序列分别为seqidno:11、12和13。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有prcc-tfe3cdna序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。

进一步地，所述阳性质粒包括含有1型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒、含有2型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒、含有3型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒和含有4型prcc-tfe3cdna序列的阳性质粒。

所述试剂盒的检测体系pcr反应液还包括thnderbirdprobeqpcrmix(2×)(toyobo公司)。

所述试剂盒还包括样本提取试剂，所述样本提取试剂可选自组织rna抽提试剂或血液rna抽提试剂。组织rna抽提试剂可购买自toyobo和qiagen等公司的商业化试剂盒，当然也可自行配制；血液rna抽提试剂包括红细胞裂解液、trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水，其中红细胞裂解液包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钠和12.5μmol/ledta-na2。当然，血液rna抽提试剂也购买自toyobo和qiagen等公司的商业化试剂盒。

所述试剂盒还包括rna逆转录试剂，所述rna逆转录试剂可自行配制，也可购买自toyobo等公司的商业化试剂盒，如toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒。

最后本发明所使用的引物和探针seqidno:1～13的碱基序列如表1所示。

表1.引物和探针的序列

实施例2

本发明方法的操作流程：

(1)抽提血液样本中的组织rna：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml实施例1中的红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀，室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml实施例1中的红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中(不要吸取白色中间层)；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10～15min，加入20ulrnase-free水溶解沉淀。采用nanodrop2000(购自thermoscientific公司)检测制备出的rna浓度及纯度，-30℃保存备用。

此外，也可提取肾组织样本的rna，其制备方法为：切取组织或者刮取石蜡玻片样本于1.5ml离心管中，加入1ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入500ml组织透明液(杭州西奈山生物科技有限公司)，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，加入1ml无水乙醇，振荡混匀后13000rpm离心1min。去除上清，置于37℃金属浴至干燥(开盖)。加入150ulpkdbuffer(来自rneasyffpekit，qiagen公司)，振荡混匀。加入10ulpk(来自rneasyffpekit，qiagen公司)，上下颠倒混匀。在56℃金属浴15min，后80℃金属浴15min。冰上放置3min后，13200rpm离心15min，吸取上清至新的1.5mlep管，加入dnaseboosterbuffer(来自rneasyffpekit，qiagen公司)16ul和dnase1(来自rneasyffpekit，qiagen)10ul振荡混匀后低速离心，室温静置15min。加入320ulrbcbuffer(来自rneasyffpekit，qiagen公司)混匀后加入720ul无水乙醇混匀。向层析柱(来自rneasyffpekit，qiagen公司)内加入700ul前一步液体，10000rpm15s，弃去管中液体，向层析柱内加入剩下液体，10000rpm15s，弃去管中液体。向层析柱内加入500ulrpebuffer(来自rneasyffpekit，qiagen公司)，10000rpm15s，弃去废液。向层析柱内加入500ulrpebuffer，10000rpm2min，弃去废液，打开盖子，全速离心5min。将层析柱置于新的1.5mlep管，向层析柱中加入30uldepc水，静置2min后，全速离心1min。采用nanodrop2000(购自thermoscientific公司)检测rna浓度及纯度，-30℃保存备用。

(2)cdna制备：参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将(1)中制备出的rna反转为cdna。

(3)试剂配制：按检测人份数配制检测体系pcr反应液各xμl，每人份23μl分装，如表2所示：

x＝23μl反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

表2prcc-tfe3反应体系

其中forwardprimer、reverseprimer和taqmanprobe分别选自prcc-tfe3-1/2-f、prcc-tfe3-1-r和prcc-tfe3-1/2-probe，或者prcc-tfe3-1/2-f、prcc-tfe3-2-r和prcc-tfe3-1/2-probe，或者prcc-tfe3-3-f、prcc-tfe3-3-r和prcc-tfe3-3-probe，或者prcc-tfe3-4-f、prcc-tfe3-4-r和prcc-tfe3-4-probe，或者β-actin-f、β-actin-r和β-actinprobe。

(4)加样：将(3)中配制的检测体系pcr反应液和步骤(2)中制备出的cdna2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次

验证；ct＞38，为阴性。

实施例3阳性质粒检测和灵敏度检测

在制备阳性质粒时，可先直接合成出1型prcc-tfe3cdna、2型prcc-tfe3cdna、3型prcc-tfe3cdna和4型prcc-tfe3cdna，再分别插入到事先选择的质粒(这里以pmd18-t质粒为例进行说明)中，这样就可制备出pmd18-t/prcc-tfe3-1阳性质粒、pmd18-t/prcc-tfe3-2阳性质粒、pmd18-t/prcc-tfe3-3阳性质粒和pmd18-t/prcc-tfe3-4阳性质粒。

分别以10⁶copies/μl浓度的阳性质粒pmd18-t/prcc-tfe3-1、pmd18-t/prcc-tfe3-2、pmd18-t/prcc-tfe3-3和pmd18-t/prcc-tfe3-4作为模板，结果如图1所示，prcc-tfe3(1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3和4型prcc-tfe3)和β-actin均起线，本发明的引物和探针可用来检测阳性质粒，说明本发明可以检测这4种类型的阳性质粒。以质粒浓度为10³、10²、10copies/μl作为模板进行实验，每个浓度重复10次，结果如图2所示。由图2可知，100copies/μl的质粒都能全部出现扩增，而10copies/μl的质粒未能全部出现扩增，因此本发明对这4种类型的阳性质粒的检测下限均为100copies。

实施例4检测健康体检人群外周血样本

取待检的健康体检外周血样本10例，按实施例2所述方提取rna、法制备cdna、配制试剂并检测。

每份样本加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性及空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但所有类型的prcc-tfe3(1型prcc-tfe3、2型prcc-tfe3、3型prcc-tfe3和4型prcc-tfe3)未有样本出现起线。结果如表3所示。3号样本的检测结果如图3所示。

表310例外周血样本prcc-tfe3mrna表达水平

实施例5检测肾组织临床样本

取待检的临床样本10例，按实施例2所述方法提取rna并制备cdna、配制试剂并检测。

每份样本加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性及空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测10份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。10例筛查样本中所有样本的β-actin均起线，但prcc-tfe3未有样本出现起线。实验结果如下表4所示。2号样本的检测结果图4所示。

表410例临床样本prcc-tfe3mrna表达水平

序列表

<110>福州艾迪康医学检验所有限公司

<120>检测样本中prcc-tfe3融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccgagtgtggtggacaggta20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gccccagatgcctccttc18

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caggattattacagtggtggctac24

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgttgggttctccagatgggtct23

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agtcctgtggtgcctccg18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aggaaagagcccgtgaagat20

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agctgagcatttcatcattgtaactggac29

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tgccacgccttgactactgt20

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgaggaagatgaacccacaaag22

<210>10

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

acacatcaagcagattccctgacaca26

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tgagcgaggctacagctt18

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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<210>13

<211>18

<212>dna

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<400>13

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