一个控制水稻稻瘟菌产孢量与侵染能力的蛋白的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白及其编码基因。
背景技术：
：稻瘟菌(magnaportheoryzae)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦等多种禾本科植物，导致瘟病。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，甚至可导致水稻绝收。稻瘟病是我国水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害。稻瘟菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。稻瘟菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。在适宜的条件下，吸附在叶片的分生孢子萌发形成附着胞，成熟的附着胞产生侵染钉直接穿透植物表皮细胞，侵染钉在植物细胞内形成侵染性菌丝，侵染性菌丝在植物细胞内和细胞间扩展和定植，最终叶片上形成直径2-3毫米灰色或灰褐色的病斑，病斑中的侵染性菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的作用下释放和附着，重新引起植物的再侵染。稻瘟病的严重度与分生孢子的产生量呈正相关。如果能降低稻瘟菌分生孢子的产生量以及降低稻瘟菌侵染性菌丝的侵染及蔓延能力，就可以控制稻瘟病等的发生或者减小稻瘟病的危害程度。因此，研究分生孢子产生量及稻瘟菌的侵染能力中的分子遗传机制，对揭示稻瘟菌分生孢子产生和侵染能力的分子机理以及对稻瘟病的预防与治理具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白，来源于稻瘟菌(magnaportheoryzae)，名称为mgg-01427，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白质。序列表中的序列1由613个氨基酸残基组成。为了便于序列1编码的mgg-01427纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述mgg-01427可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述mgg-01427的编码基因可通过将序列表中序列3所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白(mgg-01427)的编码基因也属于本发明的保护范围。所述控制稻瘟菌产孢量是指mgg-01427缺失可以使稻瘟菌的产孢量降低，所述控制侵染能力是指mgg-01427缺失可以导致稻瘟菌菌丝延展能力下降，进一步的，是指mgg-01427缺失可以导致稻瘟菌在大麦叶片细胞中侵染性菌丝侵染延伸能力较野生型相比下降。所述编码控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白(mgg-01427)的基因组dna核苷酸序列如下1)、2)或3)所示：1)序列表中seqid№：2的核苷酸序列；2)在严格条件下可与1)所述的dna序列杂交的核苷酸序列；3)与序列表中seqid№：2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白具有控制稻瘟菌产孢量和侵染能力功能的核苷酸序列。上述编码基因，自序列2的5’端第1490-2014位核苷酸为第1外显子，5’端第2132-3428位核苷酸为第2外显子，自序列2的5’端第2105-2131位核苷酸为内含子。所述编码控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白(mgg-01427)的cdna为如下1)或2)或3)的dna分子：1)序列表中序列3所示的dna分子；2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码所述橡胶树抗病相关蛋白的dna分子；3)与序列表中序列3的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白对具有橡胶树抗病相关功能的核苷酸序列。序列表中序列3全长为1842个核苷酸，编码一个长度为613个氨基酸(序列表中序列1)，即为控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白(mgg-01427)。上述严格条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。含有所述控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白(mgg-01427)的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明克隆了一个稻瘟菌中控制孢子产生量与侵染能力的新基因mgg-01427，并对该基因的分子功能进行了初步研究。本发明所提供的mgg-01427的一个重要用途是，该基因的表达和转录物的剪切及其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要候选靶标位点用于抗真菌药剂的筛选和设计中。进一步，解析该基因参与的真菌孢子产生量与侵染力的分子机理及信号途径，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂的筛选和设计，也可以以该基因核苷酸序列的某一区段作为探针或作为pcr引物设计的基础用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。mgg-01427基因的敲除导致稻瘟菌产孢量的降低以及侵染性菌丝的侵染能力下降。敲除体1427ko2的产孢量下降至野生型p131的34％左右。本发明将有助于解析稻瘟菌产孢量和侵染性菌丝侵染能力的分子机制，并有可能从中发现可以作为杀菌剂靶标的基因及其编码蛋白，从而为有效的控制稻瘟病奠定理论基础和技术基础。附图说明图1.mgg-01427与其它植物病原真菌中同源蛋白的聚类分析。图示说明：蛋白聚类分析用到的蛋白：mgg-01427(magnaportheoryzae)、ejt74718.1(gaeumannomycestritici)、kui69080.1(valsamali)、kxh66273.1(coletotrichumsalicis)、egy19911.1(verticiliumdahliae)、enh73886.1(fusariumoxysporum)蛋白聚类分析是使用clustalx1.83软件完成的。图2.基因mgg-01427敲除载体构建策略示意图。利用潮霉素hyb基因置换mgg-01427基因。引物p1，p2，p3，p4位置如图所示。图3.基因mgg-01427敲除体的验证。图为mgg-01427敲除体的southernblot验证。p131、1427ko1、1427ko2和1427ko3的基因组dna用psti酶切，酶切位置如图2所示，杂交探针为图2所示的probe。图4.基因mgg-01427影响稻瘟菌的产孢量。使用6cm的培养皿按照涂菌产孢的方法进行产孢，洗菌、产孢48小时后，计数。上图为p131与1427ko菌株产孢量计数统计表格，下图为两种菌株产孢量平均值柱状图。图5.基因mgg-01427互补体菌株产孢量恢复到野生型水平。使用6cm的培养皿按照涂菌产孢的方法进行产孢，洗菌、产孢48小时后，计数。图为野生型菌株、敲除体菌株与互补体菌株产孢量柱状对比图。图6.基因mgg-01427影响稻瘟菌侵染能力。上图为野生型p131孢子接种大麦叶片后光学显微镜下菌丝侵染状态；下图为敲除体菌株1427ko2接种大麦叶片后菌丝侵染状态。图7.基因mgg-01427敲除体菌株1427ko2的致病力与野生型p131无明显区别。左图野生型p131菌株的分生孢子喷雾接种水稻叶片后叶片发病照片；右图为敲除体菌株1427ko2的分生孢子喷雾接种水稻叶片后叶片发病照片。图8.基因mgg-01427敲除体菌株1427ko2的菌落生长速度与野生型p131无明显区别。上图为野生型菌株p131和敲除体菌株1427ko2在oma培养基上菌落生长状态；下图为两种菌株菌落大小柱状图。图9.基因mgg-01427在整个侵染过程中均有表达。图为侵染各个阶段的照片在相差视野(dic)和荧光视野(gfp)下取景拍照。该基因在菌丝、分生孢子、附着胞、侵染性菌丝中均有表达。具体实施方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白及其编码基因的获得本发明的发明人通过筛选随机插入突变体，发现一个控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白，来源于稻瘟菌菌株p131，可按照下述方法获得：1、cdna片段克隆(序列表中序列3)特异性引物设计如下：f(5’端)：gccatatggcgaccaacggcgaaacgcccar(3’端)：gcgaattcatgtcctcttgcatccgatctgct以稻瘟菌p131随机引物反转录获得的第一链cdna为模板，以f和r为引物，其终浓度为10μmol/l，在25μl反应体系中进行pcr扩增。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃最后延伸10min，4℃forever。获得一段1842bp左右的核苷酸片段，为控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白的基因全长片段，测序表明，该片段具有序列表中序列3的核苷酸序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。2、控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白基因全长的克隆(序列表中序列2)基因组序列扩增引物：正向引物:caacctgtggctctgggagca；反向引物:ccattggagtagtattatgc。从野生型菌株p131中提取基因组dna后，使用正向和反向引物，使用如下扩增程序进行pcr扩增出mgg-01427基因组序列。95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸6min，共35个循环；72℃最后延伸10min，4℃forever。最终扩增出5609bp的基因组序列，经测序表明其具有序列表中序列2的核苷酸序列，其编码序列表中序列1的蛋白质序列。3、控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的蛋白mgg-01427与其它真菌中同源蛋白的聚类分析将稻瘟菌蛋白mgg-01427的氨基酸序列在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上比对，找出其在不同物种间的同源类似物：mgg-01427(magnaportheoryzae)、ejt74718.1(gaeumannomycestritici)、kui69080.1(valsamali)、kxh66273.1(colletotrichumsalicis)、egy19911.1(verticilliumdahliae)、enh73886.1(fusariumoxysporum)。用clustalx1.83软件对上述氨基酸序列进行比对分析之后，构建蛋白mgg-01427及其同源类似物间的进化树。通过比对发现，蛋白mgg-01427及其类似物都具有一个spry_ash2结构域，此结构域参与调节组蛋白h3k4甲基转移酶，与染色质修饰与表观遗传转录激活有关。在真菌表观遗传方面有着重要作用，影响真菌生长发育。因此可以推断mgg-01427类蛋白是真菌中普遍存在的一个保守蛋白，如附图1所示。实施例2、本发明控制稻瘟病菌产孢量与侵染能力的基因mgg-01427在稻瘟菌产孢量方面作用的证明本发明采用基因敲除实验和基因互补实验来证明mgg-01427在稻瘟菌产孢量方面作用。这部分内容包括敲除载体和互补载体的构建、稻瘟菌原生质体转化，相应的转化体的获得，产孢量的测定。1.敲除载体的构建敲除载体的构建是指将位于基因编码区两侧的一段dna序列连入一个载体中，两者之间用潮霉素基因隔开。通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点基因组基因序列与潮霉素基因置换。构建基因mgg-01427的敲除载体时，设计pcr引物，分别扩增左臂片段(自序列表中序列2的第515-1606位核苷酸序列)和右臂片段(自序列表中序列2的第3456-4551位核苷酸序列)，左臂正向引物5'-catggtaccgccacctggcaaag-3'，其5’带有kpni酶切位点，反向引物为5'-catgtcgacgccggttgtatgctc-3'，其5’端带有酶切位点；右臂正向引物5'-catgaattcggaagatgcgggaggtg-3’其5’带有ecori酶切位点，反向引物为5'-catactagtggctggcttggtctctg-3'，其5’带有spei酶切位点。左臂用kpni和sali酶切，右臂ecori和spei酶切后得到左臂和右臂两个片段。左臂先连接到同样用kpni和sali双酶切后pkov21载体潮霉素抗性基因的左侧，然后再把右臂连接到上一步获得的pkov21-左臂这个中间载体，用ecori和spei酶切后连接到潮霉素抗性基因的右侧，就获得了基因敲除载体pko-01427(如图2)。构建过程中涉及的限制性内切酶，连接酶由neb(北京)有限公司生产，参照产品说明书使用；taq酶由takara(大连)有限公司生产，参照产品说明书使用。2.稻瘟菌基因mgg-01427敲除转化在本发明中，稻瘟菌的转化使用的是cacl2/peg介导的原生质体转化的方法，原生质体的制备和转化方法如下：a.原生质体的制备500毫升锥形瓶瓶装入200毫升液体cm培养基(酵母提取物0.6％，酶水解干酪素0.03％，酸水解干酪素0.03％，蔗糖1％)，接入野生型p131适量菌丝孢子混和体，在26-28℃、100rpm条件下摇培30-36小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7m氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20mg/ml崩溃酶，用0.7m氯化钠配制)，26-28℃、100rpm条件下酶解3-4小时后，用0.7m氯化钠洗涤菌丝体，用三层灭菌擦镜纸过滤后，4,000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀先用25mlstc(1.2m山梨醇，10mmtris-ph7.5.50mm氯化钙)洗涤原生质两次。沉淀用stc溶解，将原生质体浓度调至0.5-1×108个/ml后备用。b.稻瘟菌转化将野生型p131原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管300微升，加入约2微克的线性化的敲除载体(用限制性内切酶noti线性化敲除载体pko-01427)，冰上放置20分钟，逐滴加入2毫升/管ptc溶液(60％聚已二醇3350，10mmtris-ph7，5.50mm氯化钙)，冰上静置20分钟，加入25毫升/管预冷的stc，混匀后，4,000rpm、4℃离心15分钟，弃上清，每管加入3毫升的lr培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1m蔗糖)，26-28℃培养12-18小时，转入培养皿，加入15毫升冷却至50℃左右的sr(lr+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固后，上面铺15毫升的0.7％琼脂，里面含400微克/毫升的潮霉素(美国millipore公司)，28℃培养4-6天，将出现的转化体转至固体cm培养基，里面含400微克/毫升的新霉素(美国sigma公司)，将不抗新霉素的转化体转至燕麦西红柿琼脂培养基上。3.基因mgg-01427敲除体的验证随机挑选三个敲除转化子1427ko1、1427ko2和1427ko3，为了验证1427ko1、1427ko2和1427ko3是否为真正的敲除体，我们做了southernblot实验，用限制性内切酶psti完全消解野生型p131、敲除体1427ko1、1427ko2和1427ko3的基因组dna，使用右臂作为探针，探针位置如图2所示。利用带有同位素标记的引物pr1427f：accgttgacaatctggaa和pr1427r：tctgcgttaagagtgagc进行验证试验。野生型p131和敲除转化体1427ko1泳道出现5078bp的目的条带；敲除转化体1427ko2出现6239bp的目的条带；敲除转化体1427ko3出现两条条带。由此表明敲除转化体1427ko2为基因mgg-01427真正的敲除体，如图3所示。4.基因mgg-01427敲除体产孢量测定基因mgg-01427敲除体1427ko2的产孢量下降，约为野生菌p131的34％。本发明中提及到的所有收集分生孢子的方法均为涂菌产孢法。a.稻瘟菌涂菌产孢法将所需的稻瘟菌菌株在燕麦西红柿培养基(每升含150ml西红柿汁、50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上于28℃光照培养5天后，用涂菌环将其菌丝充分打断，均匀地涂布到新的西红柿汁燕麦片培养基上，28℃光照培养。当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于28℃光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的稻瘟菌孢子。用灭菌蒸馏水将孢子洗下，擦镜纸过滤分生孢子孢子菌丝混合液，收集分生孢子液。b.基因mgg-01427的敲除体1427ko2的产孢量下降按照涂菌产孢法，对野生菌p131和基因mgg-01427的敲除体1427ko2进行产孢，使用6cm的培养皿。用蒸馏水分别将野生菌p131和基因mgg-01427的敲除体1427ko2的分生孢子洗脱下来，定容到50毫升，用血球计数板在光学显微镜下进行计数，数据表明基因mgg-01427的敲除体1427ko2的产孢量下降，其产孢量约为野生菌p131的34％，如表2和图4所示。每皿菌洗脱的孢子液计数3次，每个菌株重复3次，产孢量实验独立的重复3次。表2.野生型和敲除突变体的产孢量比较5.互补载体的构建互补载体是指将包含mgg-01427的全长功能性序列的dna片断连接到一个带有新霉素抗性基因的载体。在这里新霉素抗性基因并不是对本发明的限制，其他能导致抗生素抗性的基因，即新霉素抗性基因之外的导致真菌抗性的基因都可以达到同样的效果。首先设计引物，扩增包含完整mgg-01427的片段，使用的正向引物为5’-ctggatccgaccttgacgttaatac-3’，其5’带有bamhi酶切位点；反向引物为5’-gcgaattcacggcgataatgatg-3’，其5’带有ecori酶切位点。从野生型p131的基因组dna中扩增出包含编码mgg-01427的核苷酸序列的片段3485bp(自序列表中序列2的5’端第327-3811位核苷酸序列)，其中包含1163bp的自身启动子，将利用限制性内切酶bamhi和ecori酶切目的片段，和用限制性内切酶bamhi和ecori酶切的pgtn载体连接，最终得到包含有融合基因mgg-01427-gfp和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的质粒载体pkntg-01427。这个载体不仅可以用来互补基因mgg-01427的敲除体1427ko2，而且可以用来获得该基因的亚细胞定位转化体。其中，pgtn载体的构建方法为：使用pbluescriptiiks(-)载体为出发载体，在多克隆位点xbai和noti间插入gfp序列(genebank号：nc_011521.1)；noti和sacii酶切位点间插入trpc启动子(序列4)；sacii和saci酶切位点间插入neo(新霉素抗性基因，序列5)，由此构建出了pgtn载体。6.互补体的获得和互补体产孢量测定基因mgg-01427互补体的产孢量恢复到野生型p131的产孢水平。将构建的互补载体pkntg-01427用限制性内切酶notⅰ线性化后，加入到敲除体1427ko2的原生质体中，按照敲除实验的原生质体转化方法进行cacl2/peg介导的转化实验，上层抗生素培养基使用的是400微克/毫升的新霉素。接下来按照敲除体产孢量测定的方法，测定互补体产孢量。数据表明，基因mgg-01427互补体的产孢量恢复到野生型p131的产孢水平，如图5所示。实施例3、基因mgg-01427的敲除体1427ko2影响稻瘟菌侵染能力1.菌丝块接种离体大麦叶片用手术刀片分别切取野生型p131和敲除体1427ko2的新生菌丝块，菌丝块大小约为2mm×2mm，菌丝面朝下，分别接种划伤的大麦叶片，黑暗保湿24小时后，明暗交替培养5天后观察。2.基因mgg-01427的敲除体1427ko2稻瘟菌侵染能力下降分别取野生型p131和敲除体1427ko2侵染后的大麦叶片，用光学显微镜观察菌丝侵染状态。发现敲除体1427ko2在大麦叶片细胞中侵染性菌丝侵染延伸能力较野生型p131相比有所下降，如图6所示。实施例4、基因mgg-01427的敲除体1427ko2的致病力无明显变化将野生型p131和敲除体1427ko2按照涂菌产孢法产孢，用0.25％的geltin溶液分别将分生孢子洗下，用擦镜纸过滤分生孢子孢子菌丝混合液，收集分生孢子液。用血球计数板将分生孢子的浓度调到5×104个孢子/毫升，喷雾接种到生长28天的丽江新团黑谷水稻叶片上。28℃黑暗保湿培养24小时后，明暗交替保湿培养5天，野生型p131和敲除体1427ko2均大量出现典型的稻瘟菌病斑，如图7所示。表明，基因mgg-01427对稻瘟菌致病力无明显影响。实施例5、基因mgg-01427的敲除体1427ko2的菌落生长速度无明显变化用手术刀片分别切取野生型p131和敲除体1427ko2的新生菌丝块，菌丝块大小约为3mm×3mm。将菌丝块菌面朝下，转接到同一批配制的oma培养基中心位置。将转接好的野生型p131和敲除体1427ko2在相同条件下(28℃光照)培养5天后观察测量菌落大小。结果表明，野生型p131和敲除体1427ko2的菌落大小基本一致，生长速度无明显变化，如附图8所示。实施例6、基因mgg-01427表达动态分析将1427hb1菌株含有新生菌丝顶端的菌丝块置于载玻片上，菌丝面朝下，保湿培养48小时后，nikoneclipse800观察和拍摄菌丝中gfp的表达。用灭菌蒸馏水洗脱1427hb1的分生孢子，擦镜纸过滤后，点接到载玻片上，制备简易玻片，nikoneclipse800观察和拍摄分生孢子中gfp的表达。将分生孢子的悬浮液点接到盖玻片上，黑暗保湿培养24小时后，显微镜下观察和拍摄附着胞中gfp的表达。选用60天左右的水稻植株，沿着其自然的纹理依次把叶鞘拨开，使用第二个叶鞘进行接种(最里面的叶心为第一个，从里往外依次为第二个叶鞘，第三个叶鞘)。用灭菌蒸馏水洗脱所需菌株的分生孢子，将浓度调到106个孢子/毫升，然后用移液器将孢子液灌进第二个叶鞘。用湿润的吸水纸将水稻植株的根部保湿，25℃黑暗培养48小时后，nikoneclipse800观察和拍摄侵染性菌丝中gfp的表达。mgg-01427-gfp融合载体的转化子1427hb1在分生孢子形态和侵染性菌丝等表型上与野生菌p131没有明显的差异，说明mgg-01427-gfp能行驶基因mgg-01427的功能。在1427hb1的分生孢子，附着胞和侵染菌丝中均能观测到gfp的表达，说明基因mgg-01427在整个侵染过程中均有表达，如图9所示。<110>北京农学院<120>一个控制水稻稻瘟菌产孢量与侵染能力的蛋白<130>whoi180066<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>613<212>prt<213>稻瘟菌(magnaportheoryzae)<400>1metalathrasnglygluthrprolysarggluleuthrproalaala151015alathrserthralaproalaalathrargserthrserproargala202530glythrproproalaserserleuproglnlysargvalleumetglu354045aspasphisalaproalavalargserproleuasnproaspalaarg505560seralaproalaargalaglnserglnalaargaspgluglnglnpro65707580serglyvalalaalaargglulysargthrlyslysgluserleulys859095lysarggluserlysglyvalvalglyglyalaglyglyseralathr100105110valgluserserargalathrproaspproargglnlysaspglnser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