一种膨大弯颈孢菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一种膨大弯颈孢菌株及其应用。

背景技术：

自发明化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业作为增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3r”问题(即抗药性resistance，农药残留residence，再猖獗resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨等多发性害虫对菊酯类、有机磷类、杀螨剂等化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。

随着绿色农产品需求的日益增长和市场的良性发展，应用微生物杀虫剂防治害虫的需求越来越迫切，因此亟需研究开发新型微生物杀虫剂及其产业化关键技术。由于虫生真菌对人类具有经济和生态意义，因而早就受到人们的关注，尤其是近几十年，全国对其研究的广度和深度都有所加强。虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以安全有效，显著的流行潜力，容易大量生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。世界上许多国家的科学工作者已对它们进行了广泛深入的研究，到目前为止，世界各国已有50多种真菌杀虫剂登记注册，其中以球孢白僵菌的种类最多。

申请号为201710143949.0的专利公开了一种真菌杀虫剂，由以下重量份的原料制成：白僵菌20-30份、绿僵菌10-20份、玫烟色棒束孢12-16份、苦参碱3-7份、柠檬酸二丁基萘磺酸钙8-12份、胺菊酯2-6份、成液剂4-8份、乳油1-5份。具有杀虫谱广、对环境安全的优点。

膨大弯颈孢tolypocladiuminflatumw.gams，为弯颈霉属tolypocladiumw.gams的模式种，由gams于1971年首次从土壤中分离。目前全世界共发现弯颈霉属真菌达15种，从对该属真菌的研究发现，其可寄生于线虫、轮虫、螨虫、蚊幼虫、萤火虫、蝉和虫草蝠蛾等，是一种重要的昆虫病原真菌。

目前尚无膨大弯颈孢用于杀虫的专利公开。

目前国内外关于膨大弯颈孢t.inflatum的研究主要集中在次级代谢产物的抗菌活性及环孢菌素的生产和稳定性研究等方面，对其杀虫活性及杀虫机理方面的研究尚无报道。

技术实现要素：

本发明的研究人员从蝙蝠蛾幼虫虫尸上分离、鉴定得到的一株膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)菌株sckdc10，其rdna-its序列和tolypocladiuminflatumisolate的序列同源性高达99％。本发明获得的菌株具有生产性状好、对杀虫杀螨具有高毒力的特点。

本发明技术方案是经过采集罹病蝙蝠蛾幼虫→分离纯化菌株→鉴定菌株的分类地位→确定菌株的培养条件→平板和固体发酵→干孢子粉收集→杀虫效果测定等步骤，反复筛选出的一株具有高杀虫活性、生产性状好的膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)菌株sckdc10。

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种膨大弯颈孢的特异性基因片段，具体为its序列，其与tolypocladiuminflatumisolate的序列同源性高达99％，可用于本发明的菌株的鉴定。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种膨大弯颈孢的特异性基因片段，其特征在于，所述特异性基因片段为its序列，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明的目的之二在于提供一种膨大弯颈孢菌株，其生产性状好、杀虫杀螨具有高毒力。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种膨大弯颈孢菌株，其特征在于，所述膨大弯颈孢菌的基因组包含上述目的一的特异性基因片段。

本发明提供的膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)菌株，生物保藏号为cctccm2018701，保藏于中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection，简称cctcc)，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏日期为2018年10月22日。

本发明的目的还在于提供一种上述膨大弯颈孢菌的培养方法，包括以下步骤：

1)将本发明的膨大弯颈孢菌的分生孢子制备为悬浮液；

2)将步骤1)的悬浮液接种于ph为5-7的sday培养基或pda培养基上，于20-30℃培养。

作为优选的方案，用于产孢子时，步骤2)所述培养基为pda培养基。

作为优选的方案，培养温度为25-28℃。

为了进一步提高本发明菌株的生长势及其产孢性状、以便更适于孢子批量生产，对本发明菌株发酵培养基优选为pda-糖-甘氨酸培养基(ph7.0)。121℃高压湿热灭菌30min；自然冷却后按1：10(菌液：pda，v/w)比例接种膨大弯颈孢菌株sckdc10菌液28℃发酵罐培养3天后与大米培养基(比如为了降低成本、可以采用低值陈米培养基)中混匀，置于28℃的发酵室中静止发酵14天收集孢子粉，产孢量达5×10¹⁰/g。本领域均明确pda-糖培养基，发酵过程中在pda培养基中加入糖成分在大批量生产中发酵更完全。

本发明的目的还在于提供一种杀虫剂，其包含生防真菌，使用更安全，可减少化学农药的使用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种杀虫剂，其包含本发明的膨大弯颈孢菌和/或其分生孢子以及赋予它的药学上可接受的载体。

本发明的膨大弯颈孢菌对多种害虫的杀虫活性强、杀虫效果好，利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，安全有效地控制了多种害虫种群数量。

作为优选的方案，所述杀虫剂还包含甲氰菊酯或/和丁氟螨酯或/和螺螨酯或/和四螨嗪或/和噻螨酮。

本发明的目的还在于提供一种本发明的膨大弯颈孢菌在用于制备杀虫剂的应用。

作为优选的方案，具体为：所述膨大弯颈孢菌的菌体、所述膨大弯颈孢菌的孢子、所述膨大弯颈孢菌的培养液、所述膨大弯颈孢菌的提取物或所述膨大弯颈孢菌的代谢产物的一种或多种在用于制备杀虫剂的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供的膨大弯颈孢菌株，

1)其生产性状好、生长迅速，培育14天时产孢量达5×10¹⁰/g；

2)对多种害虫的杀虫活性强、杀虫效果好；

3)利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，减少化学农药的用量，安全、有效地减轻虫害。

附图说明

图1：膨大弯颈孢菌株sckdc10感染的家蚕幼虫、蚕蛹及柑桔全爪螨，其中：a为家蚕幼虫，b为蚕蛹，c为柑桔全爪螨；

图2：膨大弯颈孢菌株sckdc10菌落正面及sckdc10菌株分生孢子形态，其中：a为菌落正面，b为分生孢子形态；

图3：不同碳源对膨大弯颈孢菌株sckdc10菌丝生长和产孢的影响；

图4：不同氮源对膨大弯颈孢菌株sckdc10菌丝生长和产孢的影响；

图5：不同温度对膨大弯颈孢菌株sckdc10菌丝生长和产孢的影响；

图6：不同ph对膨大弯颈孢菌株sckdc10菌丝生长和产孢的影响；

图7：紫外线对膨大弯颈孢菌株sckdc10菌丝生长和产孢的影响；

图8：膨大弯颈孢菌株sckdc10生长最适培养基的筛选。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1菌株的分离

将采集到的自然感染的蝙蝠蛾幼虫用70％酒精表面消毒，放入25℃培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取微量新鲜孢子在含有100μg/ml氨苄青霉素的pda培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于25℃恒温箱中培养；3-4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，25℃恒温培养10天。

实施例2菌株的鉴定

(1)形态鉴定

将分离到的(sckdc10)菌株接种在pda平板上，25℃培养观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小。参见图2，本发明膨大弯颈孢菌株sckdc10接种在pda平板上，显示在pda培养基平板上，25℃恒温培养，菌株培养5d，菌落呈圆形白色，绒毛状，直径2-4cm；培养7d左右中间绒毛状蓬松，边缘绒毛状呈辐射状，直径5-8cm；14d后，菌落直径10-12cm，菌落仍为白色，边缘整齐，菌丝均匀隆起，绒毛变稀少，背面淡黄色，菌落背面由初期黄白相间色渐渐变深黄色，外缘呈辐射状，无渗出液。分生孢子长椭圆形，棒状，链生或簇生，透明，光滑，长3-5μm，宽0.5-1μm。

(2)sckdc10菌株的its序列扩增、序列测定及分子鉴定

以its1和its4为引物(参见表1)，从该菌株基因组dna中扩增出1条约600bp的序列，pcr产物经测序后所得序列通过blast与genbank中已有的核酸序列进行对比，结果表明，该菌株的rdna-its序列测序结果如seqidno：1所示，和tolypocladiuminflatumisolate的序列同源性高达99％。

本发明提供的膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)菌株，命名为sckdc10菌株，生物保藏号为cctccm2018701，保藏于中国典型培养物保藏中心(chinacenterfortypeculturecollection，简称cctcc)，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏日期为2018年10月22日。

表1膨大弯颈孢(t.inflatum)的扩增条件及体系

实施例3sckdc10菌株对鳞翅目模式昆虫家蚕3龄幼虫及蛹的室内杀虫活性的测定

取在pda培养基上生长7d的sckdc10菌株，无菌条件下刮取分生孢子，用0.02％吐温80无菌水悬浮后，过滤并收集分生孢子，配置成1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸个分生孢子/ml等5个不同浓度。

取4龄起蚕家蚕60头，每个菌株设置3个重复，每个重复20头，浸于事先备好的分生孢子悬浮液25s后取出，滤纸吸干体表水分并放入150mm培养皿中，饲喂叶片背面涂抹孢子悬浮液的新鲜桑叶，置于28℃恒温培养箱保湿培养，以含0.02％吐温-80的灭菌水处理家蚕和桑叶作对照，24h开始换用新鲜桑叶常规饲养，每隔12h更换新鲜桑叶，清除蚕沙，逐日观察统计幼虫死亡数(以镊子接触虫体，5s内不动为死亡)。及时清理病死家蚕，避免二次感染，将死亡个体挑出保湿培养，根据死虫上长出的产孢结构判断是否为菌株侵染致死，连续观察8d。取化蛹3天的蚕蛹45头，每个菌株设置3个重复，每个重复15头，处理方法同家蚕幼虫，连续观察至对照羽化，未与对照同期羽化视为死亡。挑取死蛹保湿培养，蛹尸上长出sckdc10菌株菌丝为有效处理。

感染后的家蚕幼虫、蚕蛹及柑桔全爪螨见图1。

对家蚕幼虫毒力测定试验结果显示：当孢子浓度为2.0×10⁸个孢子/ml时，第8天的累积死亡率达78.33％；其lc50为1.47×10⁸个孢子/ml，毒力回归方程为y＝2.1838+0.3928x，相关系数(r)为0.9214；2.0×10⁸个孢子/ml处理下的lt50为6.15d，毒力回归方程为y＝4.7395+4.4910x，相关系数(r)为0.9937。对蚕蛹毒力测定试验结果显示：当孢子浓度为2.0×10⁸个孢子/ml时，第8天的累积死亡率为64.44％，校正死亡率为56.76％；其lc50为4.25×10⁸个孢子/ml，毒力回归方程为y＝2.3801+0.3036x，相关系数(r)为0.9989；2.0×10⁸个孢子/ml处理下的lt50为7.87d，毒力回归方程为y＝8.0039+5.7127x，相关系数(r)为0.9874。

实施例4sckdc10菌株对柑桔全爪螨室内杀虫活性的测定

刮取生长于pda平板上7d的sckdc10菌株菌丝溶于0.02％吐温的无菌水中，震荡过滤收集孢子悬浮液，分别配置成5个孢子浓度梯度2×10⁴个/ml、2×10⁵个/ml、2×10⁶个/ml、2×10⁷个/ml、2×10⁸个/ml。每个浓度的孢子悬液10ml均匀喷洒在5片叶上、每片叶子上接50头柑桔全爪螨，对照组喷洒10ml含0.02％吐温的无菌水，逐日统计死亡率。

试验结果显示，当孢子浓度为2×10⁸个孢子/ml时，第7天的累积死亡率为59.5％，校正死亡率为52.35％；处理雌成螨7天，其lc50为9.26×10⁷个孢子/ml，毒力回归方程为y＝2.9765+0.2540x，相关系数(r)为0.9522；同时分析了2.0×10⁸个孢子/ml处理雌成螨的逐日死亡率，其lt50为6.34d，毒力回归方程为y＝1.6712+1.5228x，相关系数(r)为0.9571。

实施例5sckdc10菌株产孢特性

(1)膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)生长最适碳源筛选

在去除碳源的察氏培养基中分别加入3％可溶性淀粉、甘露醇、肌醇、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油、蔗糖制成不同碳源的供试培养基。接种2μl孢子悬浮液于上述平板中央，每个处理5个重复，25℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。第7天采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌株日平均生长速率后，以5ml含0.02％吐温-80的无菌水洗脱分生孢子，用血球计数板镜检分生孢子数量。不同碳源对菌落生长的影响和产孢影响结果见图3。sckdc10菌株在测试的8种碳源上均能生长和产孢。其中葡萄糖为最佳生长和产孢碳源，平均生长速率为0.68cm/天，产孢量为1.43×10⁸孢子/cm²。

(2)膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)生长最适氮源筛选

在去除氮源的察氏培养基中分别加入3％硝酸钾、尿素、蛋白胨、硝酸铵、甘氨酸、赖氨酸、氯化铵制成不同氮源的供试培养基。接种2μl孢子悬浮液于上述平板中央，每个处理5次重复，25℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。第7天采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌株日平均生长速率后，以5ml含0.02％吐温-80的无菌水洗脱分生孢子，用血球计数板镜检分生孢子数量。不同氮源对sckdc10菌丝生长和产孢的影响见图4。在氮源方面，硝态氮、铵态氮、有机氮均可使膨大弯颈孢生长。其中，以甘氨酸为氮源时，平均生长速率为0.57cm/天，产孢量为0.95×10⁸孢子cm²，为最佳生长与产孢氮源；以nh4cl为氮源时生长最慢，平均生长速率为0.33cm/天，产孢量仅为0.41×10⁸孢子/cm²。

(3)膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)生长最适温度筛选

接种2μl孢子悬浮液于新的pda培养基中央，分别置于10、15、20、25、28、30、35℃的光照培养箱中(l/d＝12/12，rh95％)，每个处理5次重复7天时采用十字交叉法测量菌落的直径。用spss12.0软件分析数据，得到最佳生长温度。接种10μl孢子悬浮液于新pda培养基上，每个处理5次重复，涂布器均匀推开后，分别置于10、15、20、25、28、30、35℃的光照培养箱中培养(l/d＝12/12，rh95％)，12h后取样在显微镜下观察分生孢子的萌发状况。

实验结果表明，除40℃不能生长和产孢及孢子萌发外，在10-35℃范围内，sckdc10均能生长。随着温度上升，菌丝生长速率、产孢量及孢子萌发率逐渐上升，28℃时平均生长速率(0.37cm/天)、产孢量(6.80×10⁸孢子/cm²)、孢子萌发率(97％)均达到最大值。超过28℃后，菌丝生长速率和产孢量及孢子萌发率逐渐下降。见图5。

(4)膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)最佳生长ph值筛选

用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调节pda培养基的ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接种2μl孢子悬浮液于不同ph的pda培养基中央，每个处理5次重复，28℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。7天之后，采用十字交叉法测量菌落的直径。用spss12.0软件分析数据，得到生长最佳生长ph；见图6。接种10μl孢子悬浮液于不同ph的pda培养基上，每个处理5次重复，涂布器均匀推开后，28℃培养(l/d＝12/12，rh95％)，12h后取样在显微镜下观察分生孢子的萌发状况。孢子萌发率(％)＝萌发孢子数/孢子总数×100。

从图6可以看出，ph对sckdc10菌株生长、产孢和孢子萌发都有影响。ph为5.0时菌株生长速率最快，达0.43cm/天，在ph为6.0-10.0之间时，菌株的生长速率在0.38-0.40cm/天之间，无显著差异；ph为7.0时，菌株产孢均达到最大值为8.20×10⁸孢子/cm²；ph为5.0时的孢子萌发率最高，达到82％左右，且随着ph值的升高，孢子萌发率逐渐减小，结果表明ph为5.0-7.0条件较适合菌株的生长和产孢及孢子萌发。

实施例6膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)抗紫外线照射能力

于pda平板中央接种孢子悬浮液2μl，然后置于紫外灯(30w，120lx)40cm下分别照射0、20、40、60、80、100、120min后，25℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。每个处理5次重复，以不经紫外线照射作为对照。接种10μl孢子悬浮液于新pda培养基上，每个处理5次重复，涂布器均匀推开后，置于紫外灯(30w，120lx)40cm下分别照射0、20、40、60、80、100、120min后，25℃培养(l/d＝12/12，rh95％)，处理12h后取样在显微镜下计测分生孢子的萌发状况。见图7。

紫外照射对sckdc10菌株生长和产孢及孢子萌发有一定的抑制作用见表5，随着照射时间延长，菌株生长速率、产孢量以及孢子萌发率逐渐降低，紫外线照射20min，其生长速率比对照降低19.44％，产孢量降低41.09％，孢子萌发率降低47.42％，当紫外线照射时间延长至60min时，其生长速率比对照降低25％，产孢量降低64.38％，孢子萌发率降低86.59％；紫外照射100min后，孢子萌发受到完全抑制。

实施例7膨大弯颈孢(tolypocladiuminflatum)相容性杀菌剂、杀虫剂筛选

分别选取5种田间常用的杀菌剂及5种杀虫(螨)剂作为供试药剂：40％多菌灵wp、10％戊唑醇sc、450g/l咪鲜胺ec、60％唑醚·代森联ew、250g/l吡唑嘧菌酯wp、240g/l螺螨酯sc、20％甲氰菊酯ec、20％丁氟螨酯sc、20％四螨嗪sc和5％噻螨酮ec。根据杀虫(螨)剂的性质，每种杀螨剂设定6个供试浓度。

分别制成所设定的农药浓度的培养基，并利用生长速率法测定杀菌剂和杀虫剂的毒力。根据所有杀菌剂和杀虫剂的性质，分别设定供试浓度，配制成不同浓度梯度的培养基，接种2μl孢子悬浮液，每个处理5次重复，25℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。

培养基配置：取1g(1ml)原农药用无菌水配制成100ml的农药母液，取对应浓度所需体积的农药母液(无菌水作为对照)与100ml已融化好的pda培养基混合均匀制成不同浓度的培养基，平均倒入3个(即3次重复)直径为9cm且无菌的培养皿中。用直径为5mm的打孔器在膨大弯颈孢的菌落上打取带菌培养基柱(菌饼)，并用无菌或消毒的接种针或金属镊子将菌饼接入冷凝后培养平板中央。接种培养皿置于28℃恒温培养箱中培养，7天后用十字交叉法测量菌落直径。运用dps软件对各药剂试验结果进行统计分析，获得各药剂对菌株的毒力回归方程、抑制中浓度(ec50)和相关系数(r)。

从表4看出，在测试的5种杀虫剂中，甲氰菊酯与sckdc10菌株的相容性最好，ec50值为17929.421mg/l，其次为丁氟螨酯(7671.4204mg/l)和螺螨酯(7235.415mg/l)，说明sckdc10菌株可以在田间与这几个杀虫剂混配使用。5种杀菌剂与sckdc10菌株的相容性均较差，其中250g/l吡唑嘧菌酯的ec50值仅为0.0167mg/l，表明sckdc10菌株对杀菌剂非常敏感，在田间使用过程中应注意错开使用。

表4常用杀虫剂及杀菌剂对sckdc10菌株生长的影响

wp：可湿性粉剂为；ew：水乳剂；sc：悬浮剂；ec：乳油。

实施例8sckdc10菌株生长最佳培养基筛选

按照配方制备pda培养基、psa培养基，spa培养基、sya培养基、czapek’s培养基、sday培养基、高氏一号培养基、lb培养基。用0.02％吐温80无菌水配制浓度为1×10⁷个分生孢子/ml的悬浮液，接种2μl孢子悬浮液于上述平板中央，5次重复，28℃培养(l/d＝12/12，rh95％)。第7天采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌株日平均生长速率后，以5ml含0.02％吐温-80的无菌水洗脱分生孢子，用血球计数板镜检分生孢子数量。实验结果见图8。

结果表明不同培养基对sckdc10菌株的生长和产孢具有显著影响，在sday培养基上sckdc10菌株生长最快，日平均生长速率为0.96cm/天，为最适生长培养基，在psa培养基上生长最慢，日平均生长速率仅为0.46cm/天；最佳产孢培养基为pda培养基，产孢量为5.04×10⁸个孢子/cm²，在高氏一号培养基上产孢量最少，为1.10×10⁸个孢子/cm²。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆太极医药研究院有限公司，西南大学

<120>一种膨大弯颈孢菌株及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>膨大弯颈孢（tolypocladiuminflatum）菌株sckdc10

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