检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物Zonulin及其应用的制作方法

本发明涉及新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物，具体涉及炎性生物标记物zonulin及其应用。

背景技术：

肠道菌群定植、配方奶喂养以及其它因素协同导致早产儿未成熟的肠黏膜处于过度炎症反应状态，使肠上皮细胞损伤、甚至坏死是新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitisofnewborn，nec)的基本病理生理特征。因此，肠道炎症反应不但在调控上皮细胞增殖、分化和迁移过程中具有重要作用，在肠道上皮细胞损伤、凋亡、坏死过程中也具有重要作用。因此，炎症反应作为nec发生发展的重要环节，目前越来越多的研究去探寻与nec早期诊断及疾病进展相关的炎性生物标志物。

炎性生物标志物与发病机制、病情进展和严重程度密切相关，可用于评价病情、疗效，具有很好的临床指示作用。与nec相关的炎性生物标记物可以分为非特异性炎性生物标记物和特异性炎性生物标记物。前者研究较多的有c反应蛋白(c-reactionprotein,crp)、降钙素元(procalcitonin,pct)和血清淀粉样蛋白a(serumamyloida,saa)，上述生物标记物中由于临床诊断标准及样本量的差异，导致对nec的评价不完全一致。但总体上认为，crp在早期诊断中价值有限，但对病情的监测及预后判断有重要意义；而saa不但在病情的监测及预后判断有重要意义，而且在早期诊断中价值也较高；pct仅是急性炎症反应的标志，与病情严重程度无显著的相关性。

zonulin作为目前已知的唯一一种肠道通透性生理性调节蛋白，能够可逆、快速的调节肠道紧密连接，改变肠道通透性。在多种疾病的早期，发现其血液中的水平明显升高。但在nec病人的研究中，尚未见zonulin与nec的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物zonulin及其应用。

为实现上述目的，本发明提供一种检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物zonulin，所述炎性生物标记物zonulin包括具有如seqid:1所示氨基酸序列。

本发明还提供一种检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血的试剂盒，用于检测所述新生儿坏死性小肠结肠炎外周血中炎性生物标记物zonulin，所述炎性生物标记物zonulin包括具有如seqid:1所示氨基酸序列。

具体地，所述试剂盒包含特异性识别所述炎性生物标记物zonulin的试剂。

较佳地，所述特异性识别所述炎性生物标记物zonulin的试剂选自特异性结合所述炎性生物标记物zonulin的抗体或配体。

本发明还提供上述检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物zonulin在制备预测、诊断和筛选新生儿坏死性小肠结肠炎试剂中的应用。

本发明分析了炎性生物标记物zonulin在新生儿病例组(77例nec病人)和对照组(80例非nec新生儿)外周血样本中表达的差异性，结果表明，炎性生物标记物zonulin在病例组中的表达水平明显高于对照组，说明炎性生物标记物zonulin在外周血中的表达水平可反映新生儿坏死性小肠结肠炎的病理特点，进而确定zonulin可作为检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血的生物标记物。

进一步地，本发明采用spearman等级对zonulin与bell分期(参照《实用新生儿学》(第四版)nec修正的bell分期标准)做相关性分析，结果表明，zonulin与bell分期呈正相关，且关联度中等偏上。进一步结果证明，外周血中zonulin的表达水平与新生儿坏死性小肠结肠炎的严重程度有关，临床上可将zonulin作为新生儿坏死性小肠结肠炎bell分期的标记物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明确定zonulin与新生儿坏死性小肠结肠炎外周血样本的指标密切相关，与bell分期呈正相关，关联度中等偏上，能够作为标记物用于新生儿坏死性小肠结肠炎外周血检测，为新生儿坏死性小肠结肠炎的预测、诊断和筛选提供有效的证据；

(2)本发明中外周血样本取材方便，无创伤性，并可连续体外检测，因此检测外周血中的炎性生物标记物zonulin，可以将新生儿坏死性小肠结肠炎的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率；

(3)本发明提供检测新生儿外周血样本的试剂盒，包含特异性识别炎性生物标记物zonulin的试剂，该方法简便快速且经济实用；

(4)本发明提供的检测外周血的标记物，可与其他的标记物相结合，为新生儿坏死性小肠结肠炎的预测、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。

附图说明

图1为zonulin标准品的工作曲线图；

图2为zonulin在病例组和对照组外周血样本中的表达水平图；

图3为zonulin与bell分期相关性分析图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

实施例1标本收集及处理

病例组：选取2016年3月至2017年9月在中山大学附属第六医院新生儿科、广东省妇幼保健院新生儿科(包括新生儿外科)、东莞市第五人民医院新生儿科、佛山市幼保健院新生儿科病房住院治疗的77例nec病人，参照《实用新生儿学》(第四版)nec修正的bell分期标准，根据最后诊断结果分为3组：疑似nec(neci期28例)、确诊nec(necii期30例)、进展nec(neciii期19例)，其中疑似nec均出现了喂养不耐受症状(腹胀、胃潴留)，所有病例均经过影像学检查。

对照组：以同期住院的与病例同胎龄、性别、出生体重、分娩方式、出生5minapgar评分和采血日龄相匹配的80例非nec新生儿(排除全身炎症反应综合征、脓毒症、消化道畸形及遗传代谢病患儿)为对照组。本研究已通过中山大学附属第六医院伦理委员会审查符合中华伦理委员会制定的伦理学标准，同时获得研究对象监护人的知情同意。

病例组样本收集均在临床诊断nec后4h内，应用无菌、肝素抗凝管采集1ml外周静脉血，充分混匀后经3000r/min，4℃，离心10min，取上层血浆于无菌ep管中，然后置于-80℃冰箱保存，集中用酶联免疫吸附测定试剂盒(elisa)对相关的急性期反应蛋白和肠屏障功能蛋白检测。对照组选择采血选择与病例组一致的采血时间点采血。

实施例2elisa检测血浆炎性生物标记物

血浆zonulin急性期及肠屏障功能蛋白的浓度应用酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，按照说明书操作要求进行检测，具体如下：

1)试剂盒基本参数：

zonulinelisa检测试剂盒(检测范围：0.625ng/ml-40ng/ml；灵敏度：0.156ng/ml；精密度：批内差cv％<8％，批间差cv％<10％；特异性：本试剂盒特异性检测人zonulin，且与其他相关蛋白无交叉反应)。

2)炎性生物标记物检测原理：采用双抗体夹心elisa(sandwichelisa)，该方法适用于血清、脑脊液、胸腹水等各种液相中的可溶性抗原的检查。简单来说，先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检样本，充分作用后，样本中相应抗原与固相上已知抗体相结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加底物后，酶分解底物产生呈色反应，根据颜色深浅判定待检样本中抗原含量。包被抗体和酶标抗体一般是针对抗原分子中不同表位的抗体。

3)样本及试剂的准备：

a.试剂、样本的复温：将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡30～40min。

b.标准品的稀释：取恢复至室温的标准品，10000rpm离心30s，使其全部沉于瓶底。然后轻轻开启瓶盖并加入1ml样本稀释液，用加样枪反复吹打5～8次，充分溶解并混匀后即可得到标准品的稀释母液s7。

采用梯度稀释法对标准品母液进行稀释。取7个1.5mlep管按照依次编号s0～s6，每管分别加入250μl样本稀释液。从编号s7内吸取250μl标准品到s6，混匀。然后从s6中吸取250μl到s5中，混匀。然后以此类推，即可完成标准品的倍比稀释。样本稀释液作为空白对照(s0)。获得zonulin(表1)不同浓度的标准品。标准品需在临用前15min内配制。

表1zonulin标准品浓度

c.浓缩洗涤缓冲液稀释流程：对浓缩洗涤缓冲液进行25倍的稀释，具体如下：量取480ml的去离子水于烧杯中，再量取20ml浓洗涤缓冲液，并缓慢加入去离子水中，待混合均匀后即可使用，一般在临用前配制。低温保存时，浓洗涤缓冲液会有盐析出，稀释前可在温水浴中加热帮助其溶解。

d.配制生物素标记抗体工作液：将复温的生物素标记抗体瓶10000rpm离心30s，使瓶内抗体全部集中到管低，然后应用抗体稀释液对其进行100倍的稀释。稀释后轻轻混匀后即可使用，一般在临用前配制。

e.配制辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：将复温的辣根过氧化物酶标记亲和素瓶10000rpm离心30s，使瓶内容物全部集中到管低，然后应用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液对其进行100倍的稀释。稀释后轻轻混匀后即可使用，一般在临用前配制。

4)elisa操作步骤：

a.加样：设置标准品孔、待测样本孔，均设置1个复孔，每孔加样100μl。

b.孵育：样品加完后，轻轻晃动混匀，盖上板贴，37℃孵育2h。

c.洗板：小心去掉板贴，弃去液体、甩干，重复洗涤。

d.加生物素标记抗体工作液，100μl/孔。

f.盖上新板贴，37℃温育1h。

g.小心去掉板贴，弃去液体、甩干，在全自动洗板机上洗板3次，每孔加稀释缓冲液200μl，浸泡2min。

h.添加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl/孔。

i.37℃孵育1h。

j.弃去液体并甩干，在全自动洗板机上洗板3次，每孔加稀释缓冲液200μl，浸泡2min。

k.加入tmb，90μl/孔。

l.37℃避光孵育15min至30min。

m.终止反应：加入终止液50μl/孔。

n.读取数据：用酶标仪在450nm波长处依次读取各孔光密度，时间控制在终止反应5min内。

以所读取的标准品的光密度为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，绘制工作曲线。所得标准品的工作曲线如图1所示。记录样本孔的光密度值，根据绘制的标准品的工作曲线计算所测样本的浓度值。

实施例3nec的bell分期与肠屏障功能蛋白zonulin关联性研究

对肠屏障功能相关蛋白血浆水平检测，统计均采用mann-whitneyu检验，与bell分期相关性分析采用spearman等级相关检验。发现zonulin在病例组中的表达说明显著高于对照组，如图2所示，ctrl为对照组；nec为病例组。

对zonulin与bell分期(i期、ii期、iii期)做相关性分析发现，zonulin与bell分期呈正相关，关联度中等偏上(图3)。

本发明提供检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血的试剂盒，包括特异结合zonulin的试剂，具体包含特异性结合zonulin的抗体。按照实施例1中方式采集患者的外周血样本，与试剂盒中含有的抗体进行反应，检测患者外周血样本中zonulin的表达水平，这对检测、诊断患者是否存在新生儿坏死性小肠结肠炎具有重要意义。

本发明分析了炎性生物标记物zonulin在新生儿病例组(77例nec病人)和对照组(80例非nec新生儿)外周血样本中表达的差异性，结果表明，炎性生物标记物zonulin在病例组中的表达水平明显高于对照组，说明炎性生物标记物zonulin在外周血中的表达水平可反映新生儿坏死性小肠结肠炎的病理特点，进而确定zonulin可作为检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血的生物标记物。

进一步地，本发明采用spearman等级对zonulin与bell分期做相关性分析，结果表明，zonulin与bell分期呈正相关，且关联度中等偏上。进一步结果证明，外周血中zonulin的表达水平与新生儿坏死性小肠结肠炎的严重程度有关，临床上可将zonulin作为新生儿坏死性小肠结肠炎bell分期的标记物。

综上所述，本发明具有如下优点：

(1)本发明确定zonulin与新生儿坏死性小肠结肠炎外周血样本的指标密切相关，与bell分期呈正相关，关联度中等偏上，能够作为标记物用于新生儿坏死性小肠结肠炎外周血检测，为新生儿坏死性小肠结肠炎的预测、诊断和筛选提供有效的证据；

(2)本发明中外周血样本取材方便，无创伤性，并可连续体外检测，因此检测外周血中的炎性生物标记物zonulin，可以将新生儿坏死性小肠结肠炎的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率；

(3)本发明提供检测新生儿外周血样本的试剂盒，包含特异性识别炎性生物标记物zonulin的试剂，该方法简便快速且经济实用；

(4)本发明提供的检测外周血的标记物，可与其他的标记物相结合，为新生儿坏死性小肠结肠炎的预测、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>东莞市第五人民医院(东莞市太平人民医院)

<120>检测新生儿坏死性小肠结肠炎外周血炎性生物标记物zonulin及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

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