一株链格孢菌及其在拮抗马铃薯环腐病致病菌中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株链格孢菌及其在拮抗马铃薯环腐病致病菌中的应用。

背景技术：

在植物栽培生长的过程中，有害生物会改变其生长环境，影响植物的正常代谢，阻碍植物生长，最终导致植物在外部形态上出现病变，如枯萎病、腐烂病、霉粉病等。病害以侵染性病害为主，易流行，防治难度大，且种类多。(一)真菌性病害：由真菌侵染至植物体内，多发于高温高湿的环境中，病菌多寄生在树体、种子、土壤中；病菌孢子依靠自然力传播；在一定的温度、湿度下萌芽生长并侵入植物体内影响植物生长。(二)细菌性病害：由细菌侵染所致，多由杆状菌引起，通过植物的气孔、皮孔或伤口等机内植物体内，通过自然力传播，寄生于树体、种子、土壤中，在高温高湿的环境下会发病；植物会出现穿孔、腐蚀等现象，在潮湿天气内会出现黏液。

化学防治是控制植物病害的有效方法，但化学杀菌剂的长期大量使用会造成土壤、大气等环境污染、破坏生态平衡。随着近年来人们对食品安全及环境污染问题的关注，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已被严格限制使用。人们开始寻找一种对人类和环境无害并具有良好防治效果的新的植物病害防治策略。生物防治高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性，不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业的可持续发展提供了保障，因此，植物病害生物防治的研究越来越受到重视。有许多生物防治植物病害的生物防治剂，包括拮抗微生物、抗生素和植物诱导剂。

马铃薯环腐病(potatoringrot)是由环腐病菌(clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus)引起的一种危害输导系统的细菌性病害，病害严重时可造成大幅度减产，病害较轻时也影响马铃薯品质，以带病种薯为主要传播途径。马铃薯环腐病属于低温型细菌性病害，主要发生在我国北方地区，尤其在黑龙江省病害较重，而黑龙江省又是全国重要的马铃薯种薯基地。

野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)，可引起一些十字科抗物病害。细菌性角斑病主要危害叶片和瓜条，其病原菌为丁香假单胞杆菌黄瓜角斑病致病变种pseudomonassyringaepv.lachrymans(smithetbryan)young,dye&wilkie，属薄壁菌门假单胞菌属。目前，生产上对此类病害的防治主要依靠抗病品种和化学农药。化学农药主要包括农用硫酸链霉素、新植霉索、多菌灵、加瑞农、百菌通等。化学农药防治具有防效好、见效快、成本低等优点，但长期过量并不当地施用引起的“3r”(残留、再猖獗、抗性)问题已经成为食品质量安全和生态安全关注的焦点。因此，寻找新的生防微生物或其代谢产物并开发为生态安全、环境友好的生物农药将是今后病害绿色防治的发展方向。

链格孢在分类上属于半知菌丝孢纲(hyphomycetes)，丝孢目，暗色菌科，链格孢属(alternariaalternata)。主要鉴别特征，非常容易产孢，分生孢子形态多样。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株链格孢菌及其在拮抗马铃薯环腐病致病菌中的应用。

本发明提供了链格孢shm-1，全称为链格孢(alternariasp.)shm-1，已于2018年6月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.15984。

本发明还保护链格孢shm-1的提取物。所述提取物为有机相提取物。

本发明还保护一种提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养链格孢shm-1；

(2)完成步骤(1)后，收集滤液，然后进行浓缩，得到浓缩液；

(3)取步骤(2)得到的浓缩液，采用有机相进行萃取，收集有机相；

(4)取步骤(3)得到的有机相，进行减压蒸馏以除去溶剂，得到提取物。

本发明还保护一种提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养链格孢shm-1；

(2)完成步骤(1)后，收集滤液；

(3)取步骤(2)得到的滤液，采用有机相进行萃取，收集有机相；

(4)取步骤(3)得到的有机相，进行减压蒸馏以除去溶剂，得到提取物。

以上任一所述有机相为乙酸乙酯或正丁醇。

以上任一所述步骤(1)具体可为：挑取链格孢shm-1单菌落于改良马丁固体培养基上，28℃培养5d，然后用直径为6mm的打孔器打取菌丝块；将2块菌丝块转接到150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养14d。

以上任一所述步骤(2)具体可为：完成步骤(1)后，取培养体系，用4层纱布过滤，收集滤液。

以上任一所述步骤(2)具体可为：完成步骤(1)后，取培养体系，用4层纱布过滤，收集滤液；取滤液，减压(0.07mpa)浓缩至原体积的1/10，即为浓缩液。

以上任一所述步骤(3)具体可为：取步骤(2)得到的浓缩液，用乙酸乙酯萃取(重复萃取3次，每次均加入与浓缩液等体积的乙酸乙酯，每次23℃静置半小时并收集乙酸乙酯相)，收集有机相。

以上任一所述步骤(3)具体可为：取步骤(2)得到的浓缩液，先用乙酸乙酯萃取(重复萃取3次，每次均加入与浓缩液等体积的乙酸乙酯，每次23℃静置半小时并收集乙酸乙酯相)，剩余的水相用正丁醇萃取(重复萃取3次，每次均加入与浓缩液等体积的正丁醇，每次23℃静置半小时并收集正丁醇相)，收集有相机。

以上任一所述步骤(3)具体可为：取步骤(2)得到的滤液，用乙酸乙酯萃取(重复萃取3次，每次均加入与滤液等体积的乙酸乙酯，每次23℃静置半小时并收集乙酸乙酯相)，收集有机相。

以上任一所述步骤(3)具体可为：取步骤(2)得到的滤液，先用乙酸乙酯萃取(重复萃取3次，每次均加入与滤液等体积的乙酸乙酯，每次23℃静置半小时并收集乙酸乙酯相)，剩余的水相用正丁醇萃取(重复萃取3次，每次均加入与滤液等体积的正丁醇，每次23℃静置半小时并收集正丁醇相)，收集有相机。

以上任一所述步骤(4)具体可为：取步骤(3)得到的有机相，进行减压蒸馏(0.07mpa，60℃)以除去溶剂，得到膏状产物。

以上任一所述方法制备得到的提取物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护链格孢shm-1在制备细菌性植物病害的病原菌的拮抗剂中的应用。

本发明还保护以上任一所述提取物的应用，为如下(a)或(b)：

(a)制备细菌性植物病害的病原菌的拮抗剂；

(b)作为细菌性植物病害的病原菌的拮抗剂。

本发明还保护一种细菌性植物病害的病原菌的拮抗剂，其活性成分为链格孢shm-1或以上任一所述提取物。

以上任一所述细菌性植物病害的病原菌为马铃薯环腐病菌、细菌性角斑病菌或野油菜黄单胞菌。

本发明提供的链格孢shm-1能产生多种代谢物，对马铃薯环腐病菌的生长具有显著抑制作用，对角斑病菌和野油菜黄单胞菌也表现出一定的抑制能力，具有被开发为生物农药的潜能。本发明为防治马铃薯环腐病菌引起的病害提供了新的途径。

附图说明

图1为链格孢shm-1的菌落形态。

图2为链格孢shm-1在光学显微镜下的照片。

图3为链格孢shm-1的电镜照片。

图4为链格孢shm-1的系统发育树。

图5为链格孢shm-1对不同农业致病菌的拮抗效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

改良马丁液体培养基(ph6.2-6.6)：蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，蒸馏水补至1l。

改良马丁固体培养基(ph6.2-6.6)：与改良马丁液体培养基的差别仅在于每l多加入20g琼脂。

牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水补至1l。

mh琼脂培养基(ph7.2-7.4)：牛肉浸粉6g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂17g，蒸馏水补至1l。

察氏培养基(ca培养基)：硝酸钠3g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸亚铁0.5g，蔗糖30g、琼脂20g，蒸馏水补至1l。

马铃薯胡萝卜培养基(pca培养基)：马铃薯200g，胡萝卜200g，琼脂20g，蒸馏水补至1l。

马铃薯葡萄糖培养基(pda培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水补至1l。

实施例1、菌株的获得、鉴定和保藏

一、菌株的获得

1、取陕西省秦岭多年野生的桑黄的子实体，进行表面消毒。表面消毒的方法：清水冲洗干净，酒精漂洗5min，再用5％次氯酸钠浸泡10s，无菌水冲洗10次。

2、无菌滤纸吸去表面的水分，用灭菌的刀片切去液体接触的一面，再将内部切成小块移植于含50mg/l青霉素放入改良马丁固体培养基培养3天，然后挑取生长的单个菌落进行培养。

3、进一步进行连续纯化，获得一株纯培养的菌株，将其命名为shm-1菌株。

二、菌株的鉴定

1、菌落形态

挑取shm-1菌株单菌落接种至pda、pca、ca培养基平板中央，28℃培养2-4d，观察形态。照片见图1。菌落形态特征：28℃培养4天菌落直径达2-5cm，生长快速，中央呈致密棕褐色凸起，致密或疏松的绒毛状，初时菌落灰白色、然后变为深色，由于产生色素的缘故，背面常为褐色至黑色边缘白色，无褶皱，无渗出物。

2、光学显微镜观察

shm-1菌株在光学显微镜100倍镜下照片见图2。

3、电镜观察

(1)将shm-1菌株接种于改良马丁固体培养基，将灭菌处理的盖玻片以45°夹角插入菌落生长的培养基中，让细菌爬片生长。

(2)将盖玻片轻轻拔出，用0.1m二甲砷酸钠缓冲液快速冲洗两次，放到预装有2％戊二醛溶液中固定2h(有菌丝的一面朝上)。

(3)用2％戊二醛溶液固定2h后，换0.1m二甲砷酸钠缓冲液冲洗三次(间隔两小时换一次)，最后0.1m二甲砷酸钠缓冲液4℃固定12h以上，依次用30％、50％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，每次脱水时间为10-15min。

(4)用95％叔丁醇溶液置换2次，每次15min，再用100％叔丁醇溶液置换15min，置换完毕后将样品放置-20℃冰箱中预冷20min。

(5)冷冻干燥处理，离子溅射仪喷镀后，将制作好的样品，放置于扫描电镜hitachis-3400n，在10千伏下观察细胞形态。

照片见图3。shm-1菌株呈现球状，无鞭毛。

4、its序列测定

采用通用引物its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)进行pcr扩增。pcr扩增体系(25μl)：10×taqbuffer2.5μl，dntps(2.5mmol/l)2.0μl，taqdna聚合酶0.2μl，上、下游引物(10μmol/l)各1.0μl，dna模板2.0μl，双蒸水补足至25μl。pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸5min，16℃保存。

将pcr扩增产物纯化回收并进行测序，如序列表的序列1所示。

将序列1进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与shm-1菌株进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，见图4。

综合步骤1至4的结果，shm-1菌株属于链格孢(alternariaalternata)。

三、菌株的保藏

链格孢shm-1，全称为链格孢(alternariasp.)shm-1，已于2018年6月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.15984。

实施例2、菌株的应用

细菌性角斑病菌(pseudomonassyringaepv.lachrymans)：ncppb1097；提及细菌性角斑病菌的参考文献：张靓,田茜,刘风权,朱水芳,赵文军.六种重要瓜类种传细菌可视基因芯片筛查方法研究[j].农业生物技术学报,2013,21(1):120-126.。提及马铃薯环腐病菌(clavibactermichiganense)的参考文献：汪万春,袁钧,郑春生,高文娜.马铃薯环腐病菌lamp检测方法的建立[j].植物检疫,2014,28(1):29-32.。提及野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)的参考文献：张建国,黄勋娟.一株野油菜黄单孢菌产黄原胶的性质[j].食品科学,2014,35(23):29-32.。供试菌为：马铃薯环腐病菌、细菌性角斑病菌和野油菜黄单胞菌。

1、挑取链格孢shm-1单菌落于改良马丁固体培养基上，28℃培养5d，然后用直径为6mm的打孔器打取菌丝块。

2、将步骤1得到的菌丝块转接到装有150ml改良马丁液体培养基的三角瓶中，每瓶接种2块，28℃、180rpm振荡培养14d。

3、完成步骤2后，取培养体系，用4层纱布过滤，收集滤液。

4、取步骤3得到的滤液，减压(0.07mpa)浓缩至原体积的1/10，即为浓缩液。

5、取步骤4得到的浓缩液，先用乙酸乙酯萃取(重复萃取3次，每次均加入与浓缩液等体积的乙酸乙酯，每次23℃静置半小时并收集乙酸乙酯相)，剩余的水相用正丁醇萃取(重复萃取3次，每次均加入与浓缩液等体积的正丁醇，每次23℃静置半小时并收集正丁醇相)。

6、将步骤5得到的乙酸乙酯相合并后进行减压蒸馏(0.07mpa，60℃)以除去溶剂，得到棕色膏状产物，命名为产物甲。每1l培养体系约得到0.7g膏状产物。

7、将步骤5得到的正丁醇相合并后进行减压蒸馏(0.09mpa，70℃)以除去溶剂，得到棕色膏状产物，命名为产物乙。每1l培养体系约得到0.5g膏状产物。

8、用dmso溶解产物甲，得到150mg·ml^-1的溶液，命名为溶液甲。用dmso溶解产物乙，得到100mg·ml^-1的溶液，命名为溶液乙。

9、将马铃薯环腐病菌加入牛肉膏蛋白胨培养基中制备待测菌液，使待测菌液中马铃薯环腐病菌浓度为0.25×10⁶cfu/ml。将菌液均匀涂布于mh琼脂培养基平板(每个平板0.4ml)，然后在上面均匀放置4个直径8mm无菌滤纸片。得到平板1至平板6。平板1至平板3：两个滤纸片上各滴加10μl溶液甲、一个滤纸片上滴加10μldmso(阴性对照)、一个滤纸片上滴加10μl0.25mg/ml青霉素溶液(阳性对照)。平板4至平板6：两个滤纸片上各滴加10μl溶液乙、一个滤纸片上滴加10μldmso(阴性对照)、一个滤纸片上滴加10μl0.25mg/ml青霉素溶液(阳性对照)。然后28℃静置培养2d。

将细菌性角斑病菌加入牛肉膏蛋白胨培养基中制备待测菌液，使待测菌液中细菌性角斑病菌浓度为1×10⁶cfu/ml。将菌液均匀涂布于mh琼脂培养基平板(每个平板0.4ml)，然后在上面均匀放置4个直径8mm无菌滤纸片。得到平板7至平板9。平板7至平板9：一个滤纸片上滴加10μl溶液甲、一个滤纸片上滴加10μl溶液乙、一个滤纸片上滴加10μldmso(阴性对照)、一个滤纸片上滴加10μl0.5mg/ml链霉素溶液(阳性对照)。然后28℃静置培养2d。

将野油菜黄单胞菌加入牛肉膏蛋白胨培养基中制备待测菌液，使待测菌液中野油菜黄单胞菌浓度为1×10⁵cfu/ml。将菌液均匀涂布于mh琼脂培养基平板(每个平板0.4ml)，然后在上面均匀放置4个直径8mm无菌滤纸片。得到平板10至平板12。平板10至平板12：一个滤纸片上滴加10μl溶液甲、一个滤纸片上滴加10μl溶液乙、一个滤纸片上滴加10μldmso(阴性对照)、一个滤纸片上滴加10μl0.5mg/ml链霉素溶液(阳性对照)。然后28℃静置培养2d。

示例性结果见图5，a为平板1，b为平板4,c为平板7，d为平板10。平板1至平板3中，溶液甲的抑菌圈直径为16.9mm-17.1mm；阴性对照无抑菌圈；阳性对照的抑菌圈直径平均为20.2mm。平板4至平板6中：溶液乙的抑菌圈直径为9.2mm-10.9mm；阴性对照无抑菌圈；阳性对照的抑菌圈直径平均为19.4mm。平板7至平板9中：溶液甲的抑菌圈直径平均为9.4mm；溶液乙的抑菌圈直径平均为10.1mm；阴性对照无抑菌圈；阳性对照的抑菌圈直径平均为20.8mm。平板10至平板12中：溶液甲无抑菌圈；溶液乙的抑菌圈直径平均为11.2mm；阴性对照无抑菌圈；阳性对照的抑菌圈直径平均为30.0mm。链格孢菌shm-1得到的溶液甲对马铃薯环腐病菌的抑制作用显著。

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<110>宁夏医科大学

<120>一株链格孢菌及其在拮抗马铃薯环腐病致病菌中的应用

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