一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒与流程

文档序号:20699962发布日期:2020-05-12 15:32阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的试剂盒,包括若干个用于检测不同目的蛋白的试剂、建库pcr上游引物、建库pcr下游引物、测序引物甲和测序引物乙;

每个用于检测目的蛋白的试剂包括单链dna分子甲、目的蛋白抗体甲、单链dna分子乙和目的蛋白抗体乙;

所述单链dna分子甲从5’末端到3’末端依次包括dna片段1、dna片段2和dna片段3;

所述单链dna分子乙从5’末端到3’末端依次包括dna片段4、dna片段5和dna片段6;

所述dna片段3和所述dna片段6反向互补;

每个用于检测目的蛋白的试剂中,所述dna片段2和所述dna片段5的核苷酸序列均不同,用于检测不同的目的蛋白;

所述建库pcr上游引物从5’末端到3’末端依次包括dna片段a和dna片段b;所述dna片段b和所述dna片段1完全一致;

所述建库pcr下游引物从5’末端到3’末端依次包括dna片段c和dna片段d;所述dna片段d和所述dna片段4的5’末端完全一致;

所述测序引物甲从5’末端到3’末端依次包括dna片段x和dna片段y;所述dna片段x与所述dna片段c反向互补,所述dna片段y与所述dna片段a完全一致;

所述测序引物乙与所述dna片段4序列反向互补。

2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:

所述dna片段1和所述dna片段4均为20-35个核苷酸组成的单链dna分子;

所述dna片段2和所述dna片段5均为5-9个核苷酸组成的单链dna分子;

所述dna片段3和所述dna片段6均为5-11个核苷酸组成的单链dna分子;

所述dna片段a为15-30个核苷酸组成的单链dna分子;

所述dna片段c为15-30个核苷酸组成的单链dna分子。

3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:

所述单链dna分子甲为30-50个核苷酸组成的单链dna分子;

所述单链dna分子乙为30-50个核苷酸组成的单链dna分子;

所述建库pcr上游引物为45-50个核苷酸组成的单链dna分子;

所述建库pcr下游引物为45-50个核苷酸组成的单链dna分子;

所述测序引物甲为40-50个核苷酸组成的单链dna分子。

4.如权利要求1至3任一所述的试剂盒,其特征在于:所述建库pcr下游引物还包括barcode标记序列;所述barcode标记序列位于所述dna片段c的下游、所述dna片段d的上游。

5.如权利要求1至4任一所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括用于检测dna标准品的试剂;所述用于检测dna标准品的试剂包括dna标准品、建库pcr上游引物-标准品和建库pcr下游引物-标准品;

所述dna标准品含有特异dna分子;所述特异dna分子从5’末端到3’末端依次包括dna片段m、随机dna片段和dna片段n;

所述建库pcr上游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述dna片段a和dna片段m;所述dna片段m和所述dna片段m完全一致;

所述建库pcr下游引物-标准品从5’末端到3’末端依次包括所述dna片段c和dna片段n;所述dna片段n和所述dna片段n的3’末端反向互补。

6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:所述建库pcr下游引物-标准品还包括barcode标记序列;所述barcode标记序列位于所述dna片段c的下游、所述dna片段n的上游。

7.权利要求1至6任一所述试剂盒在检测待测样本中不同目的蛋白含量中的应用。

8.一种检测待测样本中不同目的蛋白含量的方法,包括步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)和步骤(d):

所述步骤(a)包括如下步骤:

(a-1)将权利要求1至4中任一所述目的蛋白抗体甲和所述单链dna分子甲连接,得到探针1;将权利要求1至4中任一所述目的蛋白抗体乙和所述单链dna分子乙连接,得到探针2;

(a-2)完成步骤(a-1)后,将探针1和探针2混合,得到混合探针;

(a-3)按照步骤(a-1)和(a-2)的方法,制备不同的混合探针,不同的混合探针组成混合探针组;混合探针组中的每个混合探针用于检测一种目的蛋白;

所述步骤(b)包括如下步骤:

(b-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入待测样本,混匀,延伸,得到延伸产物;

(b-2)分别以步骤(b-1)得到的各个延伸产物为模板,以权利要求1至4中任一所述建库pcr上游引物和所述建库pcr下游引物进行pcr扩增,得到pcr扩增产物;

(b-3)分别取步骤(b-2)得到的pcr扩增产物,以权利要求1至4中任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序,得到待测样本中不同目的蛋白对应的dna拷贝数;

所述步骤(c)包括如下步骤:

(c-1)向混合探针组中的各个混合探针中加入各目的蛋白标准溶液,混匀,延伸,得到延伸产物;

(c-2)分别以步骤(c-1)得到的各个延伸产物为模板,以权利要求1至4中任一所述建库pcr上游引物和所述建库pcr下游引物进行pcr扩增,得到pcr扩增产物;

(c-3)分别取步骤(c-2)得到的pcr扩增产物,以权利要求1至4中任一所述测序引物甲和测序引物乙进行测序,得到各目的蛋白标准溶液中不同目的蛋白对应的dna拷贝数;

所述步骤(d):根据各目的蛋白标准溶液中目的蛋白的浓度和相应的拷贝数绘制标准曲线,将所述所述步骤(b-3)得到的拷贝数代入所述标准曲线,得到各待测样本中不同目的蛋白的含量。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:

所述步骤(a-1)中,所述连接通过偶联剂进行;所述偶联剂可以提供与目的蛋白抗体和单链dna分子反应的化学基团。

10.如权利要求8所述的方法,其特征在于:

所述步骤(b-1)包括如下步骤:

(b-1-1)将待测样本和混合探针组中的各个混合探针混合,孵育;

(b-1-2)向完成步骤(b-1-1)的体系中加入dna聚合酶和dntp,得到反应体系f;

(b-1-3)取反应体系f,延伸,得到延伸产物;

所述步骤(c-1)包括如下步骤:

(c-1-1)将各目的蛋白标准溶液和混合探针组中的各个混合探针混合,孵育;

(c-1-2)向完成步骤(c-1-1)的体系中加入dna聚合酶和dntp,得到反应体系m;

(c-1-3)取反应体系m,延伸,得到延伸产物。


技术总结
本发明公开了一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒。本发明的发明人结合PEA和DNA测序技术可实现对多样本多蛋白含量的同时检测,具体方法为:针对不同种类的抗体标记不同序列的ss‑DNA(蛋白条码),由ss‑DNA序列的不同来区分蛋白种类;借助PEA技术将蛋白信息转化为DNA信息;建库时针对不同的样本再加上一段不同的Barcode标记序列(样本条码),用于区分不同样本;测序仪分别检测出样本条码序列、蛋白条码序列以及蛋白条码序列的数目,由此便实现了多个样本多种蛋白含量的同时检测。本发明具有重要的应用价值。

技术研发人员:赵芳;李舟;章文蔚;刘二凯;张长领;陈奥
受保护的技术使用者:深圳华大生命科学研究院
技术研发日:2018.11.02
技术公布日:2020.05.12
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