安徽白山羊的X精子分离方法与流程

本发明涉及山羊的x精子分离方法。

背景技术：

安徽白山羊属肉皮兼用型羊，是在暖温带半温润气候条件经过长期选育而形成的地方品种，分布于安徽省皖北地区和江淮之间北部，是黄淮山羊的一个地方群，在安徽省分布较广。该品种以性早熟、繁殖力高、板皮质量好而著称，但其个体小、生长速度慢，故作为肉羊生产。安徽白山羊体质结实，结构匀称，肉质鲜美、皮张质量好，是优良的地方畜牧品种。但是该品种繁殖率不高，扩繁速度不够快。因此，挑选x精子，提高后代母羊比例具有非常重要的意义。

精子分离术是由美国遗传与辅助生育研究所精子分离部的研究员发明的一种技术，使得妊娠前可以选择胎儿性别。关于动物的精子分离方法和应用，国外学者做了大量研究，有白蛋白梯度游动分离法、精子表面抗原免疫学分离法、自由电泳分离法、遗传学分离法、精子差异膜蛋白分离法、流氏细胞仪分离法等。lush试图利用精子的密度差异,通过离心分离精子的方法控制兔子后代的性别,结果不理想。此后,大多数分离精子的研究都通过“物理分离法”进行,以x和y精子之间存在的细微物理差异(密度、电荷、运动特性等)为依据进行分离。schilling等使用沉降下层的精液部分给母牛授精,得到70％雌性率；ericsson等报道用白蛋白柱法分离y精子,其分离率达到85％,人工授精后男婴出生率为79％；铃木达行用梯度离心法分离牛的精子,用分离的x精子层授精后到77.18％的母犊；cardon电泳分离兔精液时,用阳极精液授精,仔兔中有74.13％的雌性率等。但以上方法重复性差,不同试验之间存在很大的差异(甚至得到相反的结果),不足以指导生产。真正让人们看到希望的性别控制方法是近10多年出现的流式细胞仪分离精子的方法。此法在国外已用于畜牧业生产中,并产生了很好的效益,国内近年也有研究和少量使用,前景良好。经过染色后的精子通过流式细胞仪时，由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成了包含单个x精子或者y精子的微小液滴，高速射出喷嘴后逐个与激光交截。精子上的荧光染料hoechst33342被氩离子紫外激光(～350nm)激发会产生蓝色激发光(～460nm)。由于x精子所含有dna比y精子多，结合上比较多的hoechst33342，所激发出的荧光的强度就比y精子强。蓝色激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主控机，其根据荧光强度的差别分辨出哪个是x精子，哪个是y精子。同时，给被判别的包含单个x精子或者y精子的微小液滴加载正电荷或者负电荷。携带正电荷或者负电荷精子的液滴在电场力的引导下，分别落入不同的收集容器中，x精子和y精子得以分离。1989年美国xy公司首次应用流式细胞仪成功将xy精子分离，并达到一定的精确度，自此以后，经过11年的不断技术更新和开发，该项技术从2000年开始从实验室成功进入商业化生产应用，至今已利用分离x精子对10787头青年母牛进行了人工授精，受孕率达到53％。xy精子分离方法已应用于牛、马等哺乳动物。

上述这些方法都存在着所需设备昂贵，难以在普通繁殖场推广的特点。因此需要发明一种新的简单有效的x精子分离方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种简单有效的x精子分离方法。

本发明提供了一种x精子分离方法，包括：对采集的精液进行液化；对液化后的精液进行孵化；在离心管中依次加入80％、60％和40％的percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的精液进行离心，倒掉上清液，用pbs溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的x精子。

在上述x精子分离方法中，其中，对采集的精液进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。

在上述x精子分离方法中，其中，对液化后的精液进行孵化包括：用移液管取1ml液化后的精液，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3ml预热至37℃的pbs溶液，试管倾斜45度，放于co2培养箱，孵化35min。

在上述x精子分离方法中，其中，在离心管中依次加入80％、60％和40％的percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％的percoll溶液各2ml。

在上述x精子分离方法中，其中，取孵化后的精液进行离心包括：从放于co2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间，吸取2ml精液悬液，1000r/min离心8min。

在上述x精子分离方法中，其中，用pbs溶液重悬包括用1ml预热至37℃的pbs溶液重悬。

在上述x精子分离方法中，其中，在移入所述密度梯度离心管的最上层之后，250r/min离心30min，之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。

在上述x精子分离方法中，还包括：在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后，1000r/min离心8min，之后用预热至37℃的pbs溶液调整精子密度至7500万/ml。

本发明的方法能够有效地对x精子进行分离，进而对后代的性别进行有效地选择。

附图说明

图1示出了本发明分离的x精子与未经分离的精子授精后得到的后代性别的结果图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下面详细描述精子的选择与结果验证流程。

1.采精种公羊选择与管理

1.1种公羊的选择。种公羊应选择个体等级优秀，符合种用要求，年龄在2岁～5岁龄，体质健壮、睾丸发育良好、性欲旺盛的种羊。正常使用时，精子的活力在0.7～0.8，畸形精子少，正常射精量为0.8毫升～1.2毫升，密度中等以上。

1.2种公羊的管理。放牧饲养时，要选派责任心强、有放牧经验的放牧员放牧，每天的放牧距离不少于7.5千米。种公羊要单独饲养，圈舍宽敞、清洁干燥、阳光充分、远离母羊圈舍。饲料应多样化，保证青绿饲料和蛋白质饲料的供给。配种季节，每天保证喂给2个～3个新鲜的鸡蛋(带壳喂给)。

1.3种公羊采精调教。有些初次配种的公羊，采精时可能会遇到困难，此时可采取以下方法进行调教：一是观摩诱导法。即在其他公羊配种或采精时，让被调教公羊站在一旁观看，然后诱导它爬跨。二是睾丸按摩法。即在调教期每日定时按摩睾丸10分钟～15分钟，经几天后则会提高公羊性欲。三是发情母羊刺激法。用发情母羊做台羊，将发情母羊阴道黏液或尿液涂在公羊鼻端，刺激公羊性欲。四是药物刺激法，即对性欲差的公羊，隔日每只注射丙睾丸素1毫升～2毫升，连续注射3次后可使公羊爬跨。

2.采精前的准备

2.1选择发情好的健康母羊作台羊，后躯应擦干净，头部固定在采精架上。

2.2种公羊在采精前，用湿布将包皮周围擦干净。

2.3假阴道的准备：将消毒过的、酒精完全挥发后的内胎，用生理盐水棉球或稀释液棉球从里到外擦拭，在假阴道一端扣上消过毒并用生理盐水或稀释液冲洗后甩干的集精瓶(温度低于25℃时，集精瓶夹层内要注入30～35℃温水)。在外壳中部生水孔注入150毫升左右的50～55℃温水，拧上气卡塞，套上双连球打气，使假阴道的采精口形成三角形，并拧好气卡。最后把消毒好的温度计插入假阴道内测温，温度在39～42℃，在假阴道内胎的前1/3，涂抹稀释液或生理盐水作润滑剂，就可立即用于采精。

3.采精

3.1安装好假阴道并使其内部温度适当。

3.2将发情旺盛的母羊保定在采精架内。

3.3一切准备就绪后，再将公羊赶至采精场并避免公羊靠近母羊，等待约一分钟左右。

3.4采精员手持假阴道蹲在母羊右侧一旁。

3.5当公羊跳爬母羊臂部后，立即用左手掌扶住包皮导引公羊阴茎，右手将假阴道固定在母羊臂部右侧，使公羊阴茎伸入假阴道内，公羊向前一冲，说明已经射精。待公羊跳下，立即放掉假阴道内空气，并垂直放置。

3.6取出集精杯，使假阴道内的精全部进入集精杯内。

应该理解，以上采精方法仅是示例性的，还可以采用其他合适的采精方法，只要不损坏精子的活性即可。

4.原精液检查

包括公羊品种、编号、采精日期、采精用时、检验室温度、射精量、色泽、气味、浓度、活力、ph值、精子畸形率。山羊的射精量一般在0.5～1毫升，色泽为乳白色，云雾状，有少量尿液混入时是浅黄色，如为深黄色则不可用。气味为无味或微腥。

5.x精子分离

5.1液化按上述方法采集精液后，37℃水浴锅液化20min。

5.2上游法初步分离

用移液管取1ml液化后精液，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3ml预热至37℃的pbs溶液，试管倾斜45度，放于co2培养箱，孵化35min。

5.3密度梯度离心

首先配制密度梯度离心管。在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％(质量百分数)的percoll细胞分离液(sigma公司，货号：40501es60)各2ml。再从5.2的试管刻度0和刻度2之间，缓慢吸取2ml精液悬液，1000r/min离心8min，倒掉上清液。用1ml预热至37℃的pbs溶液重悬后缓慢放入密度梯度离心管的最上层。250r/min离心30min后，用移液管在离心管的最下一层吸取1ml悬液，1000r/min离心8min后，用预热至37℃的pbs溶液调整精子密度至7500万/ml。所得精子基本为x精子。

6母羊的同步发情

取20只健康空怀母羊，用孕激素阴道栓至于母羊阴道内，第16天取出后，肌肉注射促性腺激素1000单位/只。第20天左右开始同步发情。用试情公羊检查母羊群两次，上下午各一次，试情公羊用试情布兜住腹部，避免发生自然交配。如果母羊接受公羊爬跨，证明已经发情。

7.人工授精

将母羊保定在采精器或专用保定架内，外阴部及肛门用0.3％的高锰酸钾冲洗后，用灭菌纸巾擦干，再将阴道插管插入母羊阴道内，其前端抵达子宫颈；左手虎口部托于母羊下腹部，以拇指和中指、食指摸到阴道插管的前端。以左手拇指、食指、中指固定子宫颈位置，右手握持输精器末端通过阴道插管内腔插入，前端抵子宫颈处调整输精器的位置探询子宫颈口。左手、右手配合将输精器前端轻轻插入子宫体内1-2cm，固定不动。助手将吸有精液的注射器插接在输精器上，推动注射器把精液缓慢地注入子宫内。输入精子0.5-1.0亿。输精次数，连日输精2--3次，每日一次。10只母羊输入分离后的x精子，10只母羊输入未经分离的精液。精心护理，统计下一代的性别比，并分析各项技术经济指标。

应该理解，上述人工授精方法仅是示例性的，可以采用其他合适的人工授精方法，只要能够有效授精即可。

8.数理统计

实验结果以均数±标准差表示，用graphpadprism6分析系统完成处理过程。正常组与寡精组间的差异性分析用t检验。

结果

10只输入x精子的母羊共产23只羊羔，其中公羊4只，所占比例为17.4％，母羊19只，所占比例为82.6％。对照组10只母羊共产羊羔21只，公羊11只，母羊10只，所占比例分别为52.4％和47.6％。经2wayanova分析，组间差异显著(p<0.001)，结果如图1所示。由此可知，本发明的x精子分离方法能够有效地对x精子进行分离，进而对后代的性别进行更有效地选择。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。