本发明属于生物能源开发
技术领域：
：，具体地说，涉及一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法。
背景技术：
：：随着全球经济的持续发展，人类对能源的消耗量越来越大。当前能源的主要来源仍以煤炭、石油等化石能源为主。煤炭、石油属于不可再生能源，过度开采燃烧煤炭和石油已经使很多国家尝受到了前所未有的能源和环境压力，比如温室效应导致的全球气候变暖问题、pm2.5对人类健康的影响、酸雨造成的生态危害等。西方经济发达国家早一步意识到了传统能源枯竭的时代即将来临，有意识地将其能耗高的产业转移到其他国家，这无疑加剧了发展中国家能源枯竭的速度。为降低对煤炭、石油等能源的依赖，发展中国家也开始了新能源的开发工作，试图开发生物质能源来缓解煤炭和石油等不足带来的危机。木质纤维素是地球上最丰富的碳水化合物，绿色植物通过光合作用每年合成的生物质相当于人类当前全年能耗的10倍。生物质能源具有资源丰富、可再生、少污染等明显优势，研究生物质能的开发与利用对经济社会的发展具有重要意义。陆地棉(g.hirsutum)和海岛棉(g.barbadense)在我国栽培面积巨大，其秸秆是一种具有极高应用价值的可再生性纤维素资源。目前关于棉秆预处理对细胞壁组分和酶解产糖效率之间关系的研究鲜有报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法。该方法研究了汽爆后秸秆细胞壁组分及其精细结构和预处理降解效率，并探讨分析了它们之间的关系，为棉秆的有效利用提供了理论基础。其具体技术方案为：一种提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法，包括以下步骤：步骤1、材料预处理1.1汽爆处理1)材料准备将汽爆备用的棉秆切剪成5-8cm片段，并喷洒去离子水使材料湿度达到50％，处理后室温储存以备汽爆。2)汽爆处理将200.0000g的备用棉秆放置于汽爆罐中进行汽爆处理。汽爆参数：225℃，3minute，2.25mpa/3min。汽爆后经中药粉碎机粉碎并过40目筛，过筛后的茎秆样品置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。1.2生物质稀酸预处理及酶解；1.3生物质稀碱预处理及酶解；步骤2、细胞壁组分提取和测定2.1细胞壁主要多糖成分提取；2.2细胞壁木质素含量测定；2.3比色法测定六碳糖和五碳糖1)制作以葡萄糖为标准样品的六碳糖标准曲线取1.0000mg/ml葡萄糖标准溶液2.00ml，4.00ml，6.00ml，8.00ml，10.00ml于100.00ml容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00ml于10.00ml具塞玻璃试管中，加入2.00ml硫酸蒽酮试剂(0.2000g蒽酮溶于100.00ml浓硫酸)快速摇匀，在沸水中加热5min，自来水冷却至室温，620nm比色，1.00ml的蒸馏水作空白样品。2)制作以木糖为标准样品的五碳糖标准曲线取1.00mg/ml木糖标准溶液0.50ml，1.00ml，2.00ml，3.00ml，4.00ml于100.00ml容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00ml于10ml具塞玻璃试管中，先加入134.00μla试剂(a＝6.000g苔黑酚溶于100.00ml无水乙醇中)，再加入2.00mlb试剂(b＝0.1000gfecl3溶于100.00ml37％浓盐酸中)，混匀后，在沸水中加热20min，自来水冷却至室温，660nm比色，1.00ml的蒸馏水作空白样品。2.4纤维素结晶度测定(x-ray)使用广角x-射线粉末衍射仪表征纤维素的结晶度(segaletal.,1959)。测试条件为：cu靶，kα射线(λ＝0.15406)，管压40.00kv，管流40.00ma，扫描速度为10°/min，步长为0.02°，发散狭缝(ds)：1°，接收狭缝(rs)：0.30mm，防散射狭缝(ss)：1°，扫描范围5～45°。纤维素的结晶度通过比较基线以上2θ＝18°(iam)处的最低峰高和2θ＝22.5°(i200)处的最强峰高，来进行计算(bansaletal.,2010)。计算公式为(cri％＝100×(i200–iam)/i200)。2.5纤维素聚合度(dp)纤维素的聚合度(dp)采用粘度法测定，粘度计型号为0.7～0.8mm乌氏粘度计。相对粘度η相对与特性粘度[η]的关系根据美国药典(usp,2005)中粘度表计算得出，聚合度按照修正公式[η]＝190dp计算得到。2.6gc-ms测定单糖组成1)取2.50ml样品到5.00ml螺口玻璃管中，加入100.00ul2.00mg/ml的肌醇(is)，再加入500.00ul三氟乙酸(tfa)，120℃水解1h。2)冷却后，2100g离心5min，取2.00mltfa水解液40℃真空抽干，加蒸馏水至800.00ul，震荡溶解。3)溶液中加入0.40m新配的10％nabh4溶液(氨水配制)，于40℃水浴中保温30min，使糖完全还原为糖醇。再分别加入0.80ml冰醋酸，以中止过量的10％nabh4溶液得到还原液，这一步反应十分剧烈，需缓慢滴加。4)取还原液0.40ml，加0.60ml甲基咪唑和4.00ml醋酸酐，在室温下乙酰化反应10min，再分别加入10.00ml蒸馏水分解过量的醋酸酐，冷却至室温后，加入3.00ml二氯甲烷，震荡混匀，静置过夜。5)吸去上层水相后，加入20.00ml蒸馏水，震荡混匀，静置分层后吸掉水相，重复操作3次至无醋酸。得到下层二氯甲烷，加入适量的无水na2so4脱水干燥，上机检测。6)以上所有步骤均使用玻璃器材，不能使用塑料制品。2.7hplc测定木质素单体组成；步骤3、棉秆发酵3.1预处理上清液发酵称取0.5000棉秆秸秆粉末于15.00ml离心管，分别加10.00ml不同浓度naoh，充分浸湿秸秆后置于摇床中50℃、150r/min处理2h。冷却至室温后2100g，离心5min。上清液转移至20.00ml离心管，残渣用5.00ml单蒸水水洗两次并收集。大约2.00mlhcl(hcl浓度根据hcl和naoh的中和反应进行计算)将所有上清液中和至ph4.8，用ph4.8磷酸缓冲液定容至20.00ml。根据秸秆粉末的重量和naoh预处理产糖数据计算出预处理液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至4.0000g。把上述20.00ml预处理液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)。121℃高压灭菌20min。用ph4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取1.00ml加到发酵液(20.00ml)中，即接种量为0.2％(w/v)。37℃恒温培养箱里静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇。3.2酶解上清液发酵在上述碱性预处理后的残渣上加10.00ml蒸馏水，2100g，离心5min，重复5遍，直至把残渣水洗到中性。再加10.00mlph4.8磷酸缓冲液，2100g，离心5min，倒掉上清。残渣加5.00ml0.4％(w/v)纤维素复合酶，定容至10.00ml，50℃，150r/min处理48h。酶解后，2100g，离心5min，上清液定容至10.00ml用于发酵。根据秸秆粉末的重量和酶解效率数据计算出酶解液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至2.0000g。把上述10.00ml酶解液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)。121℃高压灭菌20min。用ph4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取0.50ml加到发酵液(10.00ml)中，即接种量为0.2％(w/v)。37℃恒温培养箱中静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇。3.3测定发酵液乙醇含量重铬酸钾法测定乙醇的方法：1)制备标准曲线分别取0.00μl、5.00μl、10.00μl、15.00μl、20.00μl、25.00μl、30.00μl无水乙醇于10.00ml具塞玻璃试管中，补蒸馏水至1.00ml，加入2.00ml5％k2cr2o7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却。再加7.00ml蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色。以1.00ml蒸馏水为对照。2)发酵液乙醇含量的测定发酵液补蒸馏水至50.00ml，蒸馏出约20.00ml。把上述样品按一定比例稀释后取1.00ml于10.00ml比色管，再加入2.00ml5％k2cr2o7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却。再加7.00ml蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色。以1.00ml蒸馏水为对照。步骤4、数据统计分析实验所得结果利用spss软件(软件版本：statistics17.0)进行双变量的spearman相关性分析和双尾方向的显著性水平检验，以p值小于0.05定义为具有统计学显著性差异；以p值小于0.01定义为具有统计学极显著性差异。标注：spearman等级相关，指根据等级指标来研究两个变量之间相互关系的一种方法。其对于数据基本条件的要求低于积差相关，只需要两变量的测定值是对的等级评定数据，或是由连续变量的观测值转化获得的等级数据，不管两个变量的样本容量大小及总体分布形态如何，都可以采用spearman等级相关来进行数据相关性的分析及研究。进一步，步骤1.2具体为：1)称取秸秆粉末0.3000g于15.00ml离心管，加入6.00ml0.25％，0.50％，1.00％，1.50％，2.00％，4.00％，8.00％，12.00％，16.00％(v/v)的h2so4溶液，120℃，处理20min。样品冷却至室温后再50℃，150r/min，处理2h。每份样品3个重复。加蒸馏水处理2h作为空白对照。2)处理完成后将样品3000g离心5min，取预处理液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。3)将剩余上清液去掉，加入10.00ml蒸馏水洗涤，3000g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣多次，测定ph值至中性。4)残渣用10.00ml0.2mph4.8的醋酸缓冲液洗涤1次，加入3.00ml3.2000g/l纤维素复合酶溶液，用ph4.8的醋酸缓冲液定容至6.00ml，最终酶浓度为1.6000g/l。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。加醋酸缓冲液处理48h作为空白对照。进一步，步骤1.3具体为：1)称取秸秆粉末0.3000g于15.00ml离心管中，加入6.00ml0.25％，0.50％，1.00％，1.50％，2.00％，4.00％，8.00％，12.00％，16.00％，20.00％(w/v)的naoh溶液，50℃，150r/min，处理2h。每份样品设置3个重复。加蒸馏水处理2h作为空白对照。2)处理完成后将样品3000g离心5min，取预处理液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。3)将剩余上清液去掉，加入10.00ml蒸馏水洗涤，3000g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣6次，最后检查ph，确保洗至中性。4)残渣最后用10.00ml0.20mph4.8的醋酸缓冲液洗1次，然后加入3.00ml纤维素复合酶溶液，用ph4.8的醋酸缓冲液定容至6.00ml，最终酶浓度为1.6000g/l。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。加醋酸缓冲液处理48h作为空白对照。进一步，步骤2.1具体为：1)可溶性糖提取：称取0.1000g左右样品于研钵中，每份材料取三个重复。加入1.00mlph7.0的0.50m磷酸缓冲液，研磨至匀浆后用0.50m磷酸缓冲液洗涤研钵和研棒，液体转入15.00ml离心管中，3000g离心5min，沉淀再用5.00ml缓冲液洗2次，5.00ml蒸馏水洗2次。2)氯仿-甲醇去除脂类：沉淀中加入5.00ml氯仿-甲醇(1:1，v/v)，室温，150r/min振荡1h后，离心，去上清，于沉淀中加入5.00ml甲醇洗1次，再用5.00ml丙酮洗1次，再用5.00ml蒸馏水洗1次，去掉上清。3)dmso提取淀粉：于沉淀中加入5.00mldmso-h2o(9:1，v/v)，室温振荡过夜(12h)，离心后，收集上清，沉淀用5.00mldmso-h2o洗2次，再用5.00ml蒸馏水洗3次。4)草酸铵提取果胶质：沉淀中加入5.00ml0.5％草酸铵，在沸水中加热1h，在这期间每隔10min摇动一次，以免沉淀在溶液表面堆集，离心，收集上清，沉淀再用5.00ml0.5％草酸铵洗1次，5.00ml蒸馏水洗2次。5)4mkoh提取半纤维素：于沉淀中加入5.00ml4mkoh(含1.0000mg/ml的nahb4)，在室温下提取1h，在这期间每隔10min轻轻摇动，离心，沉淀再用5.00ml浓度4mkoh洗1次，5.00ml蒸馏水洗2次，收集所有上清，测c5、c6。此步为碱溶半纤维素。注：4mkoh需现用现配，还原剂nahb4应该在试剂使用前添加不宜过早，注意密封保存。6)4mkoh提取上清(碱溶半纤维素)单糖组成gc-ms法测定：用3.00ml醋酸溶液将步骤5中提取的上清液(约20.00ml)中和至中性，随后蒸馏水透析(透析袋3500da)36h(每两小时换一次水)。将透析后的溶液在100.00ml量筒中定容至70.00ml，取液2.50ml于5.00ml玻璃管中。每管中分别加入100.00ulis(肌醇，2.00mg/ml)、500.00ultfa(三氟乙酸)，置于水浴锅中120℃水解1h，冷却至室温，2100g离心5min，取上清液2.00ml，gc/ms测定单糖含量。7)硫酸，tfa两步法提取总纤维素，碱不溶半纤维素及测定：于4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)中加入3.00ml67％(v/v)h2so4，混匀。25℃，150rpm，振荡1h。蒸馏水定容至10.00ml(终止水解反应)，冷却后，3000g离心5min，收集所有上清液，取样。比色法测定pentoses(p1)，hexoses(h1)。(三个重复)将4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)用蒸馏水洗涤至中性(10.00ml蒸馏水，5～6次)，将残渣用玻璃吸管转移至5.00ml玻璃管中，定容至2.50ml；每管中分别加入100.00ulis(2.00mg/ml)、500.00ultfa，水浴锅中120℃水解1h，冷却至室温，2100g离心5min，取上清液2.00ml，利用真空泵真空抽干(4～5天)，gc/ms测定单糖含量。gc-ms测定单糖总含量＝半纤维素pentose含量(p2)+半纤维素hexose(h2)含量(mannose+galactose)+glucose含量(g1)；总纤维素含量＝h1-p1*h2/p2；非晶体纤维素含量＝g1；碱不溶半纤维素＝p1+p1*h2/p2；8)乙酸-硝酸-水(8∶1∶2，v/v/v)法测定晶体纤维素：于4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)沉淀中加入5.00ml乙酸-硝酸-水(8∶1∶2，v/v/v)，混匀，在沸水中加热1h，在这期间每隔10min摇匀，以免溶液堆集在表面。冷却至室温后，3000g离心5min，沉淀继续用5.00ml蒸馏水洗2次。弃所有上清液(碱不溶半纤维素和非晶体纤维素)。在晶体纤维素沉淀中加入2.00ml67％(v/v)硫酸，振荡分散沉淀，25℃，150rpm，振荡1h。蒸馏水定容至10.00ml(终止水解反应)，冷却后，3000g离心5min，收集所有上清液，取样。比色法测定hexoses。进一步，步骤2.2具体为：1)称取0.5000g烘干后的秸秆w1，每个样品三个重复，用滤纸包好，放入索氏提取器中用苯-乙醇(67:33，v/v)抽提4h，抽提后的粉末在通风橱中风干。2)解开滤纸，将风干后材料完全转入250.00ml三角瓶中，加入10.00ml72％(w/w)的浓硫酸，放入摇床，30℃120r/min震荡1.5h，然后加入200.00ml蒸馏水，120℃，水解1h。3)将水解液用g3坩埚式过滤器过滤，蒸馏水洗冲洗三角瓶3次。残渣用蒸馏水洗至中性，确保硫酸完全除去，将滤液定容至250.00ml(v)，此时硫酸浓度为2.88％。4)将洗干净后的残渣和过滤器80℃干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温后，称重得w2(残渣+过滤器)。5)将称重后的过滤器和残渣放入马氏炉中，200℃预热30min，然后575±25℃灰化4h，取出后干燥器中冷却30min，称重得w3(灰分+过滤器)。酸不溶木质素的含量为：ail％＝(w2-w3)×100/w16)取步骤3所得滤液1.00ml，用2.88％的硫酸稀释10倍(视样品而定)，保证吸光度在0.2-0.7之间，稀释倍数记为d。紫外分光光度计比色，测定吸光值，光波长205nm，空白为2.88％的硫酸。7)酸溶木质素的含量为：asl％＝a×d×v/(1000×k×w1)×100a：吸收值d：稀释倍数v：滤液的总体积k：酸溶木质素的吸收系数，取110w1：样品质量8)样品总木质素的含量为：lignin(％)＝ail(％)+asl(％)。进一步，步骤2.5具体为：1).纤维素样品提取：参照晶体纤维素样品及总纤维素样品的提取方法。2).铜乙二胺溶液的配置：配置方法见附录。3).粘度计的校准：在(25±0.1)℃下，测定65％甘油，蒸馏水及稀释一倍的铜乙二胺溶液在校准粘度计中的流出时间，然后再测定同一甘油水溶液在测定用粘度计中的流出时间，从而求出测定用粘度计常数。4).称取0.4000g左右(w)提取的纤维素干粉于15.00ml聚四氟乙烯离心管中，用移液管准确加入10.00ml(v)铜乙二胺溶液，常温溶解2h。同时取10.00ml铜乙二胺溶液加入空离心管中作为对照。5).溶解好的纤维素铜乙二胺溶液及对照在3000g离心5min。将离心管置于(25±0.1)℃精密玻璃水浴锅中，经过半小时的温度平衡后进行测定。6).测定时，先将待测溶液加入粘度计容器刻至刻度线处，然后夹住橡皮管，用吸耳球将溶液吸入粘度计毛细管上端的球体中。7).当液面达到球体上部小球一半液面时放开吸耳球，并松开橡皮管，待液面落至上部刻线的瞬时开始计时，至液面流出球体达到下部刻线时停表，记下流出时间(t)，重复计时三次。8).按相同方法测定对照在同一粘度计中的流出时间(t0),重复计时三次。9).计算纤维素溶液的相对粘度(η相对)：η相对＝t/t010).根据美国药典(usp,2005)粘度表中η相对～[η]·c的关系，查表得出[η]·c的值，式中[η]为特性粘度。11).根据溶解纤维素的重量(w)和铜乙二胺的体积(v)计算出浓度(c):c＝w/t。12).测定总纤维素dp时，受木质素等影响，纤维素溶解不完全，可将不溶残渣称重，计算溶液浓度为c＝△w/t，式中c的单位均为g/100ml。13).由步骤10和11的结果，计算出特性粘度[η]，按照grobe修正的公式：[η]＝190dp计算出纤维素聚合度dp。进一步，步骤2.7具体为：1)称取0.1000g秸秆粉末，苯乙醇(67:33，v/v)抽提4h，后风干至恒重，得到细胞壁残留物(cwr)。2)称取0.0500gcwr于25.00ml的聚四氟乙烯密封罐中，加入2mnaoh溶液5.00ml，硝基苯0.50ml和1枚磁力转子。将密封罐放入不锈钢保护层中。3)将整套装置密封，于170℃磁力搅拌锅中反应3.5h，转子的转速为15r/min。4)反应完成后，将密封罐迅速冷却。将罐中反应混合液完全转移至100.00ml磨口三角瓶中，密封罐用2mnaoh溶液冲洗干净。5)用30.00ml二氯甲烷/乙酸乙酯的混合液(1:1，v/v)对反应液萃取3次，去掉过量的硝基苯及其衍生物，保留水相。6)将水相用6m盐酸调ph至3-4后，再次用30.00ml二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液(1:1，v/v)萃取3次。收集有机相，旋转蒸发，得到固体残渣。7)将残渣用10.00ml色谱甲醇重新溶解，用0.22μm孔径滤膜过滤，取滤液用hplc进行检测。8)hplc检测木质素单体的条件为：(1)色谱柱类型：universalc18反相柱，4.60mm×250.00mm；(2)流动相：甲醇/水/冰乙酸＝16:63:1；(3)流速：1.10ml/min；(4)波长：280nm。与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明通过对陆地棉和海岛棉棉秆的研究比较发现，海岛棉比陆地棉更适宜于作为能源植物，并利用其生物质能转化生产生物乙醇。确定了影响棉秆降解效率的细胞壁组分关键性结构因子是纤维素的聚合度，汽爆+0.25％h2so4二步法通过极大地降低纤维素聚合度，使得降解效率系原样提高了5-6倍。附图说明图1为提高棉秆生物质降解及糖醇转化效率的研究方法的流程示意图；图2为原样棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解产糖效率；图2-a原样棉秆材料不同浓度酸预处理酶解产糖效率；图2-b原样棉秆材料不同浓度碱预处理酶解产糖效率；图3为原样棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解总糖；图3-a原样棉秆材料不同浓度酸预处理酶解总糖图3-b原样棉秆材料不同浓度碱预处理酶解总糖图4为汽爆后的棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解产糖效率；图4-a汽爆后的棉秆材料不同浓度酸预处理酶解产糖效率；图4-b汽爆后的棉秆材料不同浓度碱预处理酶解产糖效率；图5为汽爆后的棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解总糖；图5-a汽爆后的棉秆材料不同浓度酸预处理酶解总糖；图5-b汽爆后的棉秆材料不同浓度碱预处理酶解总糖；图6为汽爆处理后棉秆材料0.50％naoh和0.50％h2so4预处理酶解残渣电镜扫描图片，其中，图6a：汽爆后海岛棉棉秆0.50％h2so4预处理酶解残渣电镜扫描图；图6b:汽爆后海岛棉棉秆0.50％naoh预处理酶解残渣电镜扫描图；图6c:汽爆后陆地棉棉秆0.50％h2so4预处理酶解残渣电镜扫描图；图6d:汽爆后陆地棉棉秆0.50％naoh预处理酶解残渣电镜扫描图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。1材料和方法本实验通过测定陆地棉和海岛棉秸秆原样及汽爆后的细胞壁三大组分(纤维素、半纤维素和木质素)，及其各个不同浓度的酸碱预处理酶解后的产糖效率。进一步测定了半纤维素单糖，木质素单体的组成，纤维素结晶度和聚合度，并用扫描电镜观察了汽爆后的两种棉秆的酸碱预处理酶解后残渣的细胞壁结构。最后对棉秆预处理上清液和酶解液补糖发酵的糖醇转化效率进行了测定。通过比较分析两种棉秆汽爆后及原样的降解效率，糖醇转化效率，细胞壁组分及其结构，试图从精细结构层面上找出引起降解效率和糖醇转化发生变化的关键性结构因子。1.1实验材料1.1.1棉秆材料陆地棉和海岛棉为华中农业大学生物质与生物能源研究中心收集提供。种植收获于湖北省武汉市华中农业大学实验田。所有材料收割完成后均进行枝叶和茎秆分离，仅保留茎秆作为实验材料。将收集的茎秆置于60℃恒温干燥箱脱水烘干，一部分留作汽爆材料待用，一部分经中药粉碎机粉碎并过40目筛，过筛后的茎秆样品置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。2.1.1.2发酵菌种本实验所用发酵菌种是耐高温高活性酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，购自安琪酵母股份有限公司。1.2主要仪器与试剂仪器：多管架自动平衡离心机(湘仪tdz5-ws)、旋转蒸发器(上海亚荣re-52aa)、循环水真空泵(上海东玺shz-d型)、syp智能玻璃恒温水浴锅、分光光度计(mapadav-1100d)、鼓风干燥箱(dhg90a-101as)、电子天平(岛津aoy120)、恒温摇床(中科hql150b)，蒸汽爆破仪(theqbs-200setestbed)。试剂：纤维素复合酶(宁夏和氏璧公司)，蒽酮和甲基咪唑(上海sigma-aldrich公司)，细胞壁测定相关试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司。1.3实验方案具体实验方案如下。1.4预处理方法1.4.1汽爆处理方法1)材料准备将汽爆备用的棉秆切剪成5-8cm片段，并喷洒去离子水使材料湿度达到50％，处理后室温储存以备汽爆。2)汽爆处理将200.0000g的备用棉秆放置于汽爆罐中进行汽爆处理。汽爆参数：225℃，3minute，2.25mpa/3min。汽爆后经中药粉碎机粉碎并过40目筛，过筛后的茎秆样品置于50℃恒温干燥箱中烘干至恒重。1.4.2生物质稀酸预处理及酶解1)称取秸秆粉末0.3000g于15.00ml离心管，加入6.00ml0.25％，0.50％，1.00％，1.50％，2.00％，4.00％，8.00％，12.00％，16.00％(v/v)的h2so4溶液，120℃，处理20min。样品冷却至室温后再50℃，150r/min，处理2h。每份样品3个重复。加蒸馏水处理2h作为空白对照。2)处理完成后将样品3000g离心5min，取预处理液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。3)将剩余上清液去掉，加入10.00ml蒸馏水洗涤，3000g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣多次，测定ph值至中性。4)残渣用10.00ml0.2mph4.8的醋酸缓冲液洗涤1次，加入3.00ml3.2000g/l纤维素复合酶溶液，用ph4.8的醋酸缓冲液定容至6.00ml，最终酶浓度为1.6000g/l。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。加醋酸缓冲液处理48h作为空白对照。1.4.3生物质稀碱预处理及酶解1)称取秸秆粉末0.3000g于15.00ml离心管中，加入6.00ml0.25％，0.50％，1.00％，1.50％，2.00％，4.00％，8.00％，12.00％，16.00％，20.00％(w/v)的naoh溶液，50℃，150r/min，处理2h。每份样品设置3个重复。加蒸馏水处理2h作为空白对照。2)处理完成后将样品3000g离心5min，取预处理液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。3)将剩余上清液去掉，加入10.00ml蒸馏水洗涤，3000g离心5min，倒掉上清。重复洗涤残渣6次，最后检查ph，确保洗至中性。4)残渣最后用10.00ml0.20mph4.8的醋酸缓冲液洗1次，然后加入3.00ml纤维素复合酶溶液，用ph4.8的醋酸缓冲液定容至6.00ml，最终酶浓度为1.6000g/l。放入摇床，150r/min，50℃酶解48h。取酶解液1.00ml，稀释一定倍数，测定c6、c5糖含量。加醋酸缓冲液处理48h作为空白对照。1.5细胞壁组分提取和测定1.5.1细胞壁主要多糖成分提取细胞壁主要多糖成分提取过程按以下方法进行(pengetal.,2000)。1)可溶性糖提取：称取0.1000g左右样品于研钵中，每份材料取三个重复。加入1.00mlph7.0的0.50m磷酸缓冲液，研磨至匀浆后用0.50m磷酸缓冲液洗涤研钵和研棒，液体转入15.00ml离心管中，3000g离心5min，沉淀再用5.00ml缓冲液洗2次，5.00ml蒸馏水洗2次。2)氯仿-甲醇去除脂类：沉淀中加入5.00ml氯仿-甲醇(1:1，v/v)，室温，150r/min振荡1h后，离心，去上清，于沉淀中加入5.00ml甲醇洗1次，再用5.00ml丙酮洗1次，再用5.00ml蒸馏水洗1次，去掉上清。3)dmso提取淀粉：于沉淀中加入5.00mldmso-h2o(9:1，v/v)，室温振荡过夜(12h)，离心后，收集上清，沉淀用5.00mldmso-h2o洗2次，再用5.00ml蒸馏水洗3次。4)草酸铵提取果胶质：沉淀中加入5.00ml0.5％草酸铵，在沸水中加热1h，在这期间每隔10min摇动一次，以免沉淀在溶液表面堆集，离心，收集上清，沉淀再用5.00ml0.5％草酸铵洗1次，5.00ml蒸馏水洗2次。5)4mkoh提取半纤维素：于沉淀中加入5.00ml4mkoh(含1.0000mg/ml的nahb4)，在室温下提取1h，在这期间每隔10min轻轻摇动，离心，沉淀再用5.00ml浓度4mkoh洗1次，5.00ml蒸馏水洗2次，收集所有上清，测c5、c6。此步为碱溶半纤维素。注：4mkoh需现用现配，还原剂nahb4应该在试剂使用前添加不宜过早，注意密封保存。6)4mkoh提取上清(碱溶半纤维素)单糖组成gc-ms法测定：用3.00ml醋酸溶液将步骤5中提取的上清液(约20.00ml)中和至中性，随后蒸馏水透析(透析袋3500da)36h(每两小时换一次水)。将透析后的溶液在100.00ml量筒中定容至70.00ml，取液2.50ml于5.00ml玻璃管中。每管中分别加入100.00ulis(肌醇，2.00mg/ml)、500.00ultfa(三氟乙酸)，置于水浴锅中120℃水解1h，冷却至室温，2100g离心5min，取上清液2.00ml，gc/ms测定单糖含量。7)硫酸，tfa两步法提取总纤维素，碱不溶半纤维素及测定：于4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)中加入3.00ml67％(v/v)h2so4，混匀。25℃，150rpm，振荡1h。蒸馏水定容至10.00ml(终止水解反应)，冷却后，3000g离心5min，收集所有上清液，取样。比色法测定pentoses(p1)，hexoses(h1)。(三个重复)将4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)用蒸馏水洗涤至中性(10.00ml蒸馏水，5～6次)，将残渣用玻璃吸管转移至5.00ml玻璃管中，定容至2.50ml；每管中分别加入100.00ulis(2.00mg/ml)、500.00ultfa，水浴锅中120℃水解1h，冷却至室温，2100g离心5min，取上清液2.00ml，利用真空泵真空抽干(4～5天)，gc/ms测定单糖含量。gc-ms测定单糖总含量＝半纤维素pentose含量(p2)+半纤维素hexose(h2)含量(mannose+galactose)+glucose含量(g1)；总纤维素含量＝h1-p1*h2/p2；非晶体纤维素含量＝g1；碱不溶半纤维素＝p1+p1*h2/p2；8)乙酸-硝酸-水(8∶1∶2，v/v/v)法测定晶体纤维素：于4mkoh处理残渣(步骤5提取后材料)沉淀中加入5.00ml乙酸-硝酸-水(8∶1∶2，v/v/v)，混匀，在沸水中加热1h，在这期间每隔10min摇匀，以免溶液堆集在表面。冷却至室温后，3000g离心5min，沉淀继续用5.00ml蒸馏水洗2次。弃所有上清液(碱不溶半纤维素和非晶体纤维素)。在晶体纤维素沉淀中加入2.00ml67％(v/v)硫酸，振荡分散沉淀，25℃，150rpm，振荡1h。蒸馏水定容至10.00ml(终止水解反应)，冷却后，3000g离心5min，收集所有上清液，取样。比色法测定hexoses。1.5.2细胞壁木质素含量测定1)称取0.5000g烘干后的秸秆w1，每个样品三个重复，用滤纸包好，放入索氏提取器中用苯-乙醇(67:33，v/v)抽提4h，抽提后的粉末在通风橱中风干。2)解开滤纸，将风干后材料完全转入250.00ml三角瓶中，加入10.00ml72％(w/w)的浓硫酸，放入摇床，30℃120r/min震荡1.5h，然后加入200.00ml蒸馏水，120℃，水解1h。3)将水解液用g3坩埚式过滤器过滤，蒸馏水洗冲洗三角瓶3次。残渣用蒸馏水洗至中性，确保硫酸完全除去，将滤液定容至250.00ml(v)，此时硫酸浓度为2.88％。4)将洗干净后的残渣和过滤器80℃干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温后，称重得w2(残渣+过滤器)。5)将称重后的过滤器和残渣放入马氏炉中，200℃预热30min，然后575±25℃灰化4h，取出后干燥器中冷却30min，称重得w3(灰分+过滤器)。酸不溶木质素的含量为：ail％＝(w2-w3)×100/w16)取步骤3所得滤液1.00ml，用2.88％的硫酸稀释10倍(视样品而定)，保证吸光度在0.2-0.7之间，稀释倍数记为d。紫外分光光度计比色，测定吸光值，光波长205nm，空白为2.88％的硫酸。7)酸溶木质素的含量为：asl％＝a×d×v/(1000×k×w1)×100a：吸收值d：稀释倍数v：滤液的总体积k：酸溶木质素的吸收系数，取110w1：样品质量8)样品总木质素的含量为：lignin(％)＝ail(％)+asl(％)1.5.3比色法测定六碳糖和五碳糖1)制作以葡萄糖为标准样品的六碳糖标准曲线取1.0000mg/ml葡萄糖标准溶液2.00ml，4.00ml，6.00ml，8.00ml，10.00ml于100.00ml容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00ml于10.00ml具塞玻璃试管中，加入2.00ml硫酸蒽酮试剂(0.2000g蒽酮溶于100.00ml浓硫酸)快速摇匀，在沸水中加热5min，自来水冷却至室温，620nm比色，1.00ml的蒸馏水作空白样品。2)制作以木糖为标准样品的五碳糖标准曲线取1.00mg/ml木糖标准溶液0.50ml，1.00ml，2.00ml，3.00ml，4.00ml于100.00ml容量瓶中，加水定容，再分别取上述各溶液1.00ml于10ml具塞玻璃试管中，先加入134.00μla试剂(a＝6.000g苔黑酚溶于100.00ml无水乙醇中)，再加入2.00mlb试剂(b＝0.1000gfecl3溶于100.00ml37％浓盐酸中)，混匀后，在沸水中加热20min，自来水冷却至室温，660nm比色，1.00ml的蒸馏水作空白样品。1.5.4纤维素结晶度测定(x-ray)使用广角x-射线粉末衍射仪表征纤维素的结晶度(segaletal.,1959)。测试条件为：cu靶，kα射线(λ＝0.15406)，管压40.00kv，管流40.00ma，扫描速度为10°/min，步长为0.02°，发散狭缝(ds)：1°，接收狭缝(rs)：0.30mm，防散射狭缝(ss)：1°，扫描范围5～45°。纤维素的结晶度通过比较基线以上2θ＝18°(iam)处的最低峰高和2θ＝22.5°(i200)处的最强峰高，来进行计算(bansaletal.,2010)。计算公式为(cri％＝100×(i200–iam)/i200)。1.5.5纤维素聚合度(dp)纤维素的聚合度(dp)采用粘度法测定，粘度计型号为0.7～0.8mm乌氏粘度计。相对粘度η相对与特性粘度[η]的关系根据美国药典(usp,2005)中粘度表计算得出，聚合度按照修正公式[η]＝190dp计算得到。(蒋应梯等，2005)。1).纤维素样品提取：参照晶体纤维素样品及总纤维素样品的提取方法。2).铜乙二胺溶液的配置：配置方法见附录。3).粘度计的校准：在(25±0.1)℃下，测定65％甘油，蒸馏水及稀释一倍的铜乙二胺溶液在校准粘度计中的流出时间，然后再测定同一甘油水溶液在测定用粘度计中的流出时间，从而求出测定用粘度计常数。4).称取0.4000g左右(w)提取的纤维素干粉于15.00ml聚四氟乙烯离心管中，用移液管准确加入10.00ml(v)铜乙二胺溶液，常温溶解2h。同时取10.00ml铜乙二胺溶液加入空离心管中作为对照。5).溶解好的纤维素铜乙二胺溶液及对照在3000g离心5min。将离心管置于(25±0.1)℃精密玻璃水浴锅中，经过半小时的温度平衡后进行测定。6).测定时，先将待测溶液加入粘度计容器刻至刻度线处，然后夹住橡皮管，用吸耳球将溶液吸入粘度计毛细管上端的球体中。7).当液面达到球体上部小球一半液面时放开吸耳球，并松开橡皮管，待液面落至上部刻线的瞬时开始计时，至液面流出球体达到下部刻线时停表，记下流出时间(t)，重复计时三次。8).按相同方法测定对照在同一粘度计中的流出时间(t0),重复计时三次。9).计算纤维素溶液的相对粘度(η相对)：η相对＝t/t010).根据美国药典(usp,2005)粘度表中η相对～[η]·c的关系，查表得出[η]·c的值，式中[η]为特性粘度。11).根据溶解纤维素的重量(w)和铜乙二胺的体积(v)计算出浓度(c):c＝w/t。12).测定总纤维素dp时，受木质素等影响，纤维素溶解不完全，可将不溶残渣称重，计算溶液浓度为c＝△w/t，式中c的单位均为g/100ml。13).由步骤10和11的结果，计算出特性粘度[η]，按照grobe修正的公式：[η]＝190dp计算出纤维素聚合度dp。1.5.6gc-ms测定单糖组成1)取2.50ml样品到5.00ml螺口玻璃管中，加入100.00ul2.00mg/ml的肌醇(is)，再加入500.00ul三氟乙酸(tfa)，120℃水解1h。2)冷却后，2100g离心5min，取2.00mltfa水解液40℃真空抽干，加蒸馏水至800.00ul，震荡溶解。3)溶液中加入0.40m新配的10％nabh4溶液(氨水配制)，于40℃水浴中保温30min，使糖完全还原为糖醇。再分别加入0.80ml冰醋酸，以中止过量的10％nabh4溶液得到还原液，这一步反应十分剧烈，需缓慢滴加。4)取还原液0.40ml，加0.60ml甲基咪唑和4.00ml醋酸酐，在室温下乙酰化反应10min，再分别加入10.00ml蒸馏水分解过量的醋酸酐，冷却至室温后，加入3.00ml二氯甲烷，震荡混匀，静置过夜。5)吸去上层水相后，加入20.00ml蒸馏水，震荡混匀，静置分层后吸掉水相，重复操作3次至无醋酸。得到下层二氯甲烷，加入适量的无水na2so4脱水干燥，上机检测。6)以上所有步骤均使用玻璃器材，不能使用塑料制品。1.5.7hplc测定木质素单体组成1)称取0.1000g秸秆粉末，苯乙醇(67:33，v/v)抽提4h，后风干至恒重，得到细胞壁残留物(cwr)。2)称取0.0500gcwr于25.00ml的聚四氟乙烯密封罐中，加入2mnaoh溶液5.00ml，硝基苯0.50ml和1枚磁力转子。将密封罐放入不锈钢保护层中。3)将整套装置密封，于170℃磁力搅拌锅中反应3.5h，转子的转速为15r/min。4)反应完成后，将密封罐迅速冷却。将罐中反应混合液完全转移至100.00ml磨口三角瓶中，密封罐用2mnaoh溶液冲洗干净。5)用30.00ml二氯甲烷/乙酸乙酯的混合液(1:1，v/v)对反应液萃取3次，去掉过量的硝基苯及其衍生物，保留水相。6)将水相用6m盐酸调ph至3-4后，再次用30.00ml二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液(1:1，v/v)萃取3次。收集有机相，旋转蒸发，得到固体残渣。7)将残渣用10.00ml色谱甲醇重新溶解，用0.22μm孔径滤膜过滤，取滤液用hplc进行检测。8)hplc检测木质素单体的条件为：(1)色谱柱类型：universalc18反相柱，4.60mm×250.00mm；(2)流动相：甲醇/水/冰乙酸＝16:63:1；(3)流速：1.10ml/min；(4)波长：280nm。1.6棉秆发酵方法1.6.1预处理上清液发酵称取0.5000棉秆秸秆粉末于15.00ml离心管，分别加10.00ml不同浓度naoh，充分浸湿秸秆后置于摇床中50℃、150r/min处理2h。冷却至室温后2100g，离心5min。上清液转移至20.00ml离心管，残渣用5.00ml单蒸水水洗两次并收集。大约2.00mlhcl(hcl浓度根据hcl和naoh的中和反应进行计算)将所有上清液中和至ph4.8，用ph4.8磷酸缓冲液定容至20.00ml。根据秸秆粉末的重量和naoh预处理产糖数据计算出预处理液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至4.0000g。把上述20.00ml预处理液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)。121℃高压灭菌20min。用ph4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取1.00ml加到发酵液(20.00ml)中，即接种量为0.2％(w/v)。37℃恒温培养箱里静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇。1.6.2酶解上清液发酵在上述碱性预处理后的残渣上加10.00ml蒸馏水，2100g，离心5min，重复5遍，直至把残渣水洗到中性。再加10.00mlph4.8磷酸缓冲液，2100g，离心5min，倒掉上清。残渣加5.00ml0.4％(w/v)纤维素复合酶，定容至10.00ml，50℃，150r/min处理48h。酶解后，2100g，离心5min，上清液定容至10.00ml用于发酵。根据秸秆粉末的重量和酶解效率数据计算出酶解液所含的六碳糖，再补加葡萄糖至2.0000g。把上述10.00ml酶解液倒入装有葡萄糖的8cm×18cm试管，即发酵起始六碳糖浓度为20.0％(w/v)。121℃高压灭菌20min。用ph4.8磷酸缓冲液配制4.0％(w/v)酵母种子液，于38℃水浴锅中复水活化30min，取0.50ml加到发酵液(10.00ml)中，即接种量为0.2％(w/v)。37℃恒温培养箱中静置发酵48h，发酵结束后置于4℃冰箱保存，逐一蒸馏测定乙醇。1.6.3测定发酵液乙醇含量重铬酸钾法测定乙醇的方法：1)制备标准曲线分别取0.00μl、5.00μl、10.00μl、15.00μl、20.00μl、25.00μl、30.00μl无水乙醇于10.00ml具塞玻璃试管中，补蒸馏水至1.00ml，加入2.00ml5％k2cr2o7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却。再加7.00ml蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色。以1.00ml蒸馏水为对照。2)发酵液乙醇含量的测定发酵液补蒸馏水至50.00ml，蒸馏出约20.00ml。把上述样品按一定比例稀释后取1.00ml于10.00ml比色管，再加入2.00ml5％k2cr2o7，混匀后沸水浴10min，迅速冷却。再加7.00ml蒸馏水混匀后，在600nm可见光波长处比色。以1.00ml蒸馏水为对照。1.7数据统计分析实验所得结果利用spss软件(软件版本：statistics17.0)进行双变量的spearman相关性分析和双尾方向的显著性水平检验，以p值小于0.05定义为具有统计学显著性差异；以p值小于0.01定义为具有统计学极显著性差异。标注：spearman等级相关，指根据等级指标来研究两个变量之间相互关系的一种方法。其对于数据基本条件的要求低于积差相关，只需要两变量的测定值是对的等级评定数据，或是由连续变量的观测值转化获得的等级数据，不管两个变量的样本容量大小及总体分布形态如何，都可以采用spearman等级相关来进行数据相关性的分析及研究。2结果与分析2.1原样与汽爆后棉秆细胞壁组分本实验测定了陆地棉和海岛棉秸秆原样及汽爆后的细胞壁三大组分含量，即纤维素、半纤维素和木质素，并比较分析了原样和汽爆后的两种棉秆材料之间的细胞壁组分差异(表1)，及同种棉秆原样和汽爆处理后的细胞壁组分差异(表2.2)。如表1所示，陆地棉和海岛棉原样的细胞壁三大组分，即纤维素、半纤维素和木质素的含量分别是39.88％，17.21％，25.59％和32.02％，14.36％，24.50％。汽爆后的细胞壁三大组分分别是43.46％，7.52％，24.83％和40.58％，6.19％，24.46％。通过比较两种棉秆的原样材料的细胞壁组分，发现陆地棉和海岛棉的纤维素、半纤维素和木质素都存在显著差异，差异系数分别是24.56％，19.62％和4.45％。而经过汽爆处理后，两种棉秆材料的三大组分只有半纤维素存在显著差异(21.54％)。结果表明不管是原样还是汽爆处理，陆地棉和海岛棉半纤维素都存在显著差异，而由于汽爆处理，纤维素和木质素的差异被消除。表1原样和汽爆后的两种棉秆材料细胞壁组分相对含量差异table1cellwallcompositioninrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.实验比较分析了原样和汽爆处理后两种棉秆的细胞壁三大组分。如表2所示，汽爆处理后，陆地棉和海岛棉的半纤维素差异分别达到128.81％，132.49％，是三大组分中变异最大的，表明汽爆处理主要是除去了细胞壁中的绝大部分的半纤维素，这与当前的研究报道是一致的(ballesterosetal.,2006；talebniaetal.,2010)；汽爆后材料的纤维素较原材料有显著提高，分别为8.97％，26.75％；木质素含量没有明显变化。表2两种棉秆材料原样和汽爆后细胞壁组分相对含量差异table2cellwallcompositioninrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.2.2不同预处理方法的降解效率生物质酶解产糖效率是指纤维素复合酶酶解产生的六碳糖占总纤维素含量的百分比，用c6(％cellulose)表示(xuetal.,2012)。本实验通过比色法测定了陆地棉和海岛棉原样和汽爆处理秸秆材料的各个浓度酸碱预处理酶解产糖效率(c6和c5)。2.2.1原样陆地棉和海岛棉不同酸碱预处理降解效率测定本实验将陆地棉和海岛棉原样秸秆材料利用浓度为0.00％、0.50％、1.00％、2.00％、4.00％、8.00％、12.00％、16.00％h2so4和0.00％、0.50％、1.00％、2.00％、4.00％、8.00％、12.00％、16.00％、20.00％naoh进行预处理后，纤维素酶酶解产糖，用五碳糖和六碳糖(％纤维素)表示，即c5和c6(％cellulose)。从图2、表3可以看出，陆地棉和海岛棉的各个浓度酸碱预处理酶解效率存在巨大的差异，然而陆地棉和海岛棉的各个预处理酶解产总糖却没有差异(图3)。海岛棉和陆地棉酸预处理酶解效率变化范围分别为7.14％-22.62％，5.75％-18.10％；碱预处理酶解效率变化范围为7.14％-77.65％，5.75％-59.43％。从图2可以看出，不管是不同浓度的酸还是碱预处理，海岛棉的酶解效率均高于陆地棉，其中在12.00％h2so4和16.00％naoh处理时的差异达到最大，同时陆地棉和海岛棉的酶解效率均达到最大，表明海岛棉比陆地棉更适合生产生物能源。从表3中可以看到，不管是陆地棉还是海岛棉，它们的碱处理酶解效率均远远高于酸处理酶解效率，表明碱预处理方法是这两种原样棉秆相对更好的方法。两种棉秆预处理酶解产糖存在差异，这为我们进一步研究细胞壁对棉秆酶解产糖的影响提供了基础。表3原样棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解产糖效率table3hexoseyield(％cellulose)releasedfromenzymatichydrolysisafterpretreatmentwithnaohorh2so4inrawcottonstalksamples*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。**or*significantdifferencebetweenpretreatmentsofh2so4ornaohatconcentrationsof0.00％and0.25％insteamexplodedsamplesofg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species(t-test)atp<0.01orp<0.05(n＝3).nosignificantdifferencebetweenpretreatmentsatconcentrationof0.25％and1.00％.2.2.2汽爆后陆地棉和海岛棉不同酸碱预处理降解效率测定本实验用较低浓度的酸碱预处理，测定了汽爆处理后陆地棉和海岛棉秸秆材料分别利用浓度为0.00％、0.25％、0.50％、1.00％、1.50％h2so4和0.00％、0.25％、0.50％、1.00％、1.50％naoh预处理后的酶解产糖效率。如图4、表4所示，汽爆后棉秆材料不同浓度的酸碱预处理酶解效率变化不大，海岛棉和陆地棉酸预处理酶解效率变化范围分别是34.52％-39.59％，29.56％-37.45％；碱的变化范围分别是28.66％-34.52％，29.56％-30.66％；同时两种棉秆的预处理酶解总产糖变化也不大。从图5，表4中可以看到，一方面，两种棉秆材料经过汽爆处理后的碱预处理降解效率没有差异，而酸预处理时，海岛棉酶解效率均高于陆地棉。另一方面，两种棉秆材料经过汽爆处理后，用很低浓度的酸碱预处理(都是0.25％)就达到了最高的酶解效率，表明汽爆处理既提高了酶解效率，也降低了酸碱的用量从而减少有机试剂对环境的污染。表4汽爆后棉秆材料不同浓度酸碱预处理酶解产糖效率table4hexoseyield(％cellulose)releasedfromenzymatichydrolysisafterpretreatmentwithnaohorh2so4insteamexplodedcottonstalksamples*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。**or*significantdifferencebetweenpretreatmentsofh2so4ornaohatconcentrationsof0.00％and0.25％insteamexplodedsamplesofg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species(t-test)atp<0.01orp<0.05(n＝3).nosignificantdifferencebetweenpretreatmentsatconcentrationof0.25％and1.00％.本实验通过比较原样和汽爆处理后的材料的预处理降解效率之间的差异，分析汽爆处理的优势及细胞壁结构对预处理降解效率的影响。2.3纤维素结构特征本实验测定了两种棉秆材料汽爆处理前后的原样及4mkoh提取后残渣纤维素结晶度，并测定了它们的纤维素聚合度。如表5、表6所示，一方面，两种棉秆汽爆前后的原样纤维素结晶度都比4mkoh提取后的粗纤维的低，说明在强碱的提取过程中，由于大部分的半纤维素被去除，从而使纤维素更多的暴露出来，所以导致粗纤维的结晶度变高。另一方面，比较发现两种棉秆材料汽爆处理前的纤维素结晶度都显著低于汽爆处理后，可能由于汽爆处理能除去部分吸附在纤维素上的半纤维素和木质表5原样和汽爆后的两种棉秆材料纤维素结晶度table5cri(crystallineindex)oforiginalandcrystallinelignocelluloseinrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.original:biomasssampleswithnofurthertreatment.素，从而使更多的纤维素暴露出来，这与汽爆处理后材料降解效率高于原样材料的结果不相符，表明结晶度不是影响棉秆降解效率的关键细胞壁因子，还有其它决定降解效率的结构因子。表6两种棉秆材料原样和汽爆后纤维素结晶度table6cri(crystallineindex)oforiginalandcrystallinelignocelluloseinrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesgbarbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.original:biomasssampleswithnofurthertreatment.比较两种棉秆之间汽爆处理前后材料的聚合度以及同种材料间的聚合度。如表7、表8所示，两种棉秆材料原样的纤维素聚合度都显著的高于汽爆处理后的材料(表8)；经过汽爆处理后，两种棉秆之间的纤维素聚合度差异被消除(表7)。原因在于汽爆处理能将纤维素链打断，从而降低纤维素聚合度以提高降解效率，表明在棉秆中，影响降解效率的细胞壁关键因子是纤维素的聚合度。表7原样和汽爆后的两种棉秆材料纤维素聚合度table7dp(degreeofpolymerization)ofcrystallinelignocelluloseinrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.表8两种棉秆材料原样和汽爆后纤维素聚合度table8dp(degreeofpolymerization)ofcrystallinelignocelluloseinrawandsteamexplodedcottonstalksamplesa：组间数据的差异百分比；*和**：表示显著性检测p<0.05和p<0.01。apercentageoftheincreasedordecreasedlevelbetweenthetwosamplesofeachspecies:subtractionoftwovaluesdividedbylowvalue.**significantdifferentbetweenrawandsteamexplodedbiomasssamplesg.barbadense(gb)andg.hirsutum(gh)species.2.4半纤维素单糖组成本实验通过gc-ms法测定了半纤维素的七种单糖组成，计算了半纤维素分支度，比较分析了两种棉秆材料之间汽爆前后的半纤维素单糖组成。如表9、表10所示，不管是原样还是汽爆处理后，海岛棉的半纤维素xyl/ara都低于陆地棉，分析两种棉秆中xyl、ara、xyl/ara之间的比值，结果发现海岛棉中含有更高的ara，更低的xyl，当然xyl/ara的比列也就更低。这与海岛棉的降解效率更高是一致的，可能由于半纤维素的单糖能与纤维素直接连接，通过影响纤维素的聚合度进而影响降解效率。表9原样和汽爆后的两种棉秆材料半纤维素单糖组成table9monosaccharidecompositionoftotalhemicelluloses(％total)inrawandsteamexplodedcottonstalksamples表10原样和汽爆后的两种棉秆材料半纤维素单糖组成table10monosaccharidecompositionoftotalhemicelluloses(μmol/gdrymatter)inrawandsteamexplodedcottonstalksamples2.5木质素单体组成本实验通过hplc测定了木质素三种单体组成，计算了木质素单体之间的比例，比较分析了两种棉秆材料之间汽爆处理前后的木质素单体组成。如表11所示，在两种棉秆原样材料中，木质素h单体的比例只占1.08％，0.60％，g和s单体所占比例差不多，分别约为53.％和46％，s/g，h/g也没有差异。而两种棉秆材料汽爆处理后，h单体的比例有了很大幅度的提高，s/h有很大幅度下降，从之前的42.02-76.08降低到3.21-8.46。如前所述，汽爆处理后的降解效率，由处理前的7％左右提高到35％，表明木质素单体s/h是影响降解效率的负因子。表11原样和汽爆后的两种棉秆材料木质素单体组成table11monomercompositionoflignin(％total)inrawandsteamexplodedcottonstalksamples2.6不同预处理酶解糖醇转化效率本实验测定了原样材料1.00％、16.00％naoh，1.00％、12.00％h2so4预处理和酶解总的上清溶液糖醇转化效率；汽爆处理后材料1.00％naoh，1.00％h2so4预处理和酶解总的上清溶液糖醇转化效率；原样材料1.00％naoh，1.00％h2so4酶解后的上清溶液及汽爆处理后材料直接酶解的糖醇转化效率。如表12所示，首先，陆地棉和海岛棉两种棉秆之间在各种预处理条件下的预处理+酶解总上清和酶解上清的糖醇转化没有明显差异。其次，两种棉秆原材料的高浓度酸碱预处理+酶解的总上清的糖醇转化效率分别为海岛棉27.97％(12.00％h2so4)、21.84％(16.00％naoh)，陆地棉24.54％(12.00％h2so4)、22.25％(16.00％naoh)，均显著低于材料低浓度处理的50.41％(1.00％h2so4)、44.61％(1.00％naoh)和48.65％(1.00％h2so4)、42.28％(1.00％naoh)，表明高浓度酸碱预处理由于产生了更多的抑制物，从而降低了糖醇转化效率。另外，两种棉秆汽爆处理后材料的糖醇转化效率分别为海岛棉65.07％(1.00％h2so4)、45.87％(1.00％naoh)，陆地棉62.74％(1.00％h2so4)、50.09％(1.00％naoh)，显著高于原材料的两种预处理+酶解总上清的糖醇转化效率。同样，汽爆处理后两种材料的直接酶解上清的糖醇转化效率为41.06％，41.54％，也远远高于原材料的高浓度酸碱预处理酶解上清的27.01％(12.00％h2so4)、33.72％(16.00％naoh)和27.21％(12.00％h2so4)、34.55％(16.00％naoh)。结果表明经过汽爆处理后，两种棉秆材料的糖醇转化效率都显著高于各种直接酸碱预处理酶解的糖醇转化效率，原因在于汽爆处理除去了绝大部分的半纤维素及部分木质素从而减少了抑制物的产生，提高了糖醇转化的效率。汽爆+低浓度酸碱二步法处理能显著提高棉秆材料的糖醇转化效率。表12原样和汽爆后的两种棉秆材料糖醇转化效率table12thesugar-ethanolconversionrate(％)inrawandsteamexplodedcottonstalksamples2.7扫描电镜观察图6是陆地棉和海岛棉棉秆汽爆后材料利用0.50％naoh和0.50％h2so4预处理后酶解残渣的电镜扫描图片。从图中可以看出陆地棉和海岛棉两种材料经过低浓度的酸碱预处理和纤维素复合酶酶解过后，它们的残渣表面表现出一定程度的差异。如图中箭头所示，酸处理具有高产糖效率的材料比碱处理低产糖效率的材料细胞壁破坏程度更高，残渣表面更加粗糙。这表明酶解产糖效率高的材料其细胞壁结构在预处理过程和酶解过程中越容易被破坏，而且这些粗糙的表面结构一方面增加了纤维素和酶的接触面积，另一方面也更利于纤维素酶向细胞壁的内部渗透，加速纤维素的降解，增加产糖效率。3讨论3.1汽爆处理对细胞壁组分的影响木质纤维素是地球上含量最丰富的碳水化合物，绿色植物等通过光合作用每年合成的生物质约2.2×1011吨，相当于人类当前每年全部能耗的10倍。与传统的化石能源相比，生物质能源具有可再生、资源丰富、易于储藏、环境污染少等明显优势。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素及木质素三大组分构成。纤维素和半纤维素等多糖可以降解转化为乙醇，而含有复杂苯环结构的木质素与多糖形成的复杂交联结构使木质纤维素形成了一个天然的生物质抗降解屏障，使细胞壁能够抵御各种病原微生物或者酶类的降解作用。木质纤维素的抗降解屏障是制约木质纤维素乙醇发展的根本原因。目前，汽爆处理越来越被大家关注，成为了木质纤维素生产乙醇的关注热点。这是因为汽爆处理不仅是一种经济的、环境友好的预处理方法，而且它还能除去大部分的半纤维素及部分木质素，从而进一步增大木质纤维素的孔径及接触面积。尽管有许多不同的物理、化学等预处理方法大量运用到不同植物生物质处理过程中，但是关于棉秆的预处理研究鲜有报道(moiseretal.,2005；xuetal.,2012,zhangetal.,2013；lietal2013；wuetal.,2013；lietal.,2014；jiaetal.,2014)。本研究测定并比较分析了汽爆处理前后细胞壁三大组分的差异。如表1，2.2所示，原样陆地棉和海岛棉秸秆的三大细胞壁组分，即纤维素、半纤维素、木质素呈显著或极显著差异，经过汽爆处理后，两种棉秆之间只有半纤维素呈现极显著差异。另一方面，汽爆处理使陆地棉和海岛棉棉秆的半纤维素分别极显著下降了129％、132％，木质素只降低了3％左右，而两种棉秆的纤维素含量却呈不同程度的升高，陆地棉增加了9％，海岛棉则为27％。表明两种棉秆在经过汽爆处理不但除去了绝大部分的半纤维素，而且还使其纤维素得以富集，提高了其相对含量，其中海岛棉纤维素含量得到了更大提高。3.2影响降解效率的细胞壁组分木质纤维素生产乙醇主要经过预处理、酶解、发酵三个步骤。其中，预处理和酶解产糖是最为关键的步骤，它们将细胞壁的复杂网络结构(抗降解屏障)打破，将不能被微生物利用的多糖成分酶解成为单糖。衡量一个材料是否能作为能源植物的重要因素就是其降解产糖的效率，这也是原材料细胞壁结构特点的体现。本实验主要是研究降解效率与细胞壁组分之间的关系，其中最重要的指标就是纤维素的转化效率即降解效率(xuetal.,2012；wuetal.,2013)。如表3、2.4，图1、2.2、2.3、2.4所示，陆地棉和海岛棉经过汽爆处理后，降解效率分别是29.6％、34.5％，比不经过任何处理的高5-6倍。汽爆后的材料只需要利用低浓度的酸(0.25％h2so4)处理，降解效率就能达到比较高的水平，进一步提高酸处理的浓度其降解效率没有显著提高。另外，用低浓度的碱(0.25％naoh)处理，海岛棉的降解效率显著提高，但是陆地棉没有变化。此外，高浓度的碱处理后的降解效率没有显著提高。可能是由于碱处理和汽爆处理具有相似的作用，主要是除去半纤维素(xuetal.2012；lifetal.,2013；limetal.,2014)，因此不能提高其降解效率。蒸汽爆破是一种物理与化学的联合预处理方式，在第一阶段高温高压的气相蒸煮下半纤维素中的乙酰基发生高温自水解，产生一些酸性物质(主要是乙酸)，使得半纤维素中的糖苷键被打破，部分水解为单糖和低聚糖。木质素中的β-o-4键发生断裂，导致其部分解聚和软化。木质素和半纤维素对纤维素的保护作用遭到破坏后，纤维间的交联结构被破坏，剩下的固相纤维素结构呈现疏松多孔的表面特征，显著增加了纤维素酶对纤维素的可及率，因此也极大的提高了纤维素的降解效率。汽爆后再进行稀酸处理，进一步使得半纤维素从木质纤维素中溶解，并且降解为木糖和糠醛。通过实验表明，对于棉秆材料，汽爆+0.25％h2so4二步法处理能得到较高的纤维素降解转化效率。并且海岛棉的降解效率远远高于陆地棉，是更为理想的生物质利用种植物。3.3二步法处理对发酵抑制物的影响在生产过程中，发酵这一步会受到木质纤维素预处理过程中产生的抑制物影响，抑制微生物转化生产乙醇。这些抑制物主要由于纤维素、半纤维素和木质素降解而产生的，以呋喃类、芳香类和有机酸为主。其中，五碳糖和六碳糖降解产生呋喃类和羧酸类化合物，木质素降解成芳香类化合物。有报道指出酸碱预处理生物质材料会产生大量的有毒的化学成分，从而抑制利用酵母发酵生产乙醇。因此评价预处理方法的优劣一方面要考虑酶解效率的高低，另一方面预处理过程中产生的抑制物对酶解和发酵的影响也是重要的参考因素。通过研究细胞壁结构，并改变其结构组成来降低预处理过程中的抑制物的释放，探明这类抑制物与微生物乙醇转化之间的关系及其影响，对发展木质纤维素乙醇产业具有重要意义。在本研究中，用预处理及酶解上清溶液发酵生产乙醇，根据糖醇转化效率检测发酵抑制物的指标。如表12所示，陆地棉和海岛棉棉秆经过汽爆处理后，用1.0％h2so4预处理和酶解的总上清溶液糖醇转化效率达到最高(63％，65％)。而两种棉秆原样材料只经过1.00％h2so4处理的总上清，其糖醇转化效率只有49％、50％，表明汽爆处理能够除去较多的发酵抑制物以提高糖醇转化效率。此外，虽然高浓度(16.00％)的酸预处理酶解的降解效率很高，但是两种棉秆材料的糖醇转化效率却很低，比汽爆处理再用1.00％h2so4处理的低了3倍。因此，汽爆+稀酸二步法处理不但可以提高两种棉秆的降解效率，减少环境污染，还可以除去一部分发酵抑制物提高其糖醇转化效率，是一种理想的预处理方法。3.4影响棉秆降解效率的细胞壁结构关键因子为了探明影响降解效率的细胞壁关键因子，在本研究中测定了细胞壁的精细结构，即纤维素的结晶度、聚合度，半纤维素的单糖组分，木质素的单体组分(表5，2.6，2.7，2.8，2.9，2.10，2.11)。1)纤维素结晶度(cri)与聚合度(dp)纤维素是植物细胞壁的最主要的组成成分，也是地球上含量最为丰富的高分子化合物。纤维素结晶度和聚合度是纤维素的两个重要的结构特征，它们对纤维素的降解有重要的作用，结晶度越高或聚合度越大，纤维素的降解效率也就越低(esteghlalianetal.,2001；zhangetal.,2012)。组成纤维素的基本分子元件是吡喃式d型葡萄糖，以β-1,4-糖苷键相连，约含有500～14000个葡萄糖残基，其化学结构分子式为(c6h10o5)n。具有一定构象的纤维素高分子链按一定的秩序堆砌，便成为纤维素的微晶体，因此纤维素结构具有结晶区和非结晶区。结晶区是分子链有序排列形成的致密区域；非结晶区是指排列比较松散紊乱的区域，纤维素酶容易将其降解(puri,1984；ariolietal.,1997)。结晶度是指结晶区占纤维素整体的比例，不同物种间差距极大。聚合度是指单个纤维素链的葡萄糖分子数量，一般用平均聚合度表示。正是由于纤维素具有高度结晶和高度聚合的空间结构，从而制约了纤维素酶的降解效率。纤维素结晶度是影响降解效率的负因子，已在很多植物中报道。在本研究中，海岛棉的原样纤维素结晶度比陆地棉的低，同样其降解效率高于陆地棉的降解效率。两种棉秆材料经汽爆处理后，其结晶度并没有差异。两种棉秆材料原样的聚合度都显著的高于汽爆处理后的材料；而两种棉秆之间的纤维素聚合度差异被消除。结果表明，汽爆处理提高了两种棉秆材料的纤维素结晶度，显著降低了其聚合度。可能由于纤维素中的β-1,4-糖苷键具有缩醛键的性质，汽爆处理使糖苷键断裂，降低了纤维素聚合度从而提高了棉秆的降解效率。表明纤维素的聚合度才是影响汽爆处理后棉秆材料降解效率的细胞壁组分关键性的结构因子。2)半纤维素支链比木聚糖是草本植物细胞壁中半纤维素的主要组成部分，主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖组成，其中木糖和阿拉伯糖的含量最高，(girioetal.,2010；lietal.,2013；wuetal.,2013)。半纤维素分支度是木糖/阿拉伯糖(xyl/ara)反向比率，是半纤维素的一个重要的特征，据报道xyl/ara在芒草、小麦、水稻、甜高粱、玉米中与酶解产糖效率呈负相关，与纤维素呈正相关。在棉秆细胞壁中还没有xyl/ara与酶解产糖效率和纤维素结构特征的关系的报道。实验测定分析了半纤维素单糖组成，木质素单体组成，如表9，2.10，2.11所示。无论在两种棉秆原样材料和汽爆处理后，海岛棉的半纤维素支链比xyl/ara比都陆地棉的低，而降解效率都高于陆地棉，这与当前报道是一致的。在纤维素微纤丝的表面覆盖着半纤维素，二者通过氢键的形式与微纤丝交联形成复杂的网络结构，此为细胞壁内高层次上的结构。汽爆+稀酸二步法处理通过去除了大部分半纤维素，降低了纤维素的聚合度进而提高了材料的降解效率。3)木质素单体木质素是细胞壁的主要组成成分，由于结构的多样性，复杂性，它是一种非常稳定且复杂的细胞壁成分(meralietal.,2013；sunetal.,2013；fuetal.,2011；chenanddixon,2007；grabber,2005；ralphetal.,2004)。关于木质素单体影响降解效率的研究报道比较多，通常其扮演着双重角色，如在芒草和木本植物中s/g被报道是负因子，在杨树中被报道是正因子；而在水稻和小麦中报道h或h/g是影响降解效率的正因子(studeretal.,2011；fuetal.,2011；grabber,2005；goujonetal.,2003；baucheretal.,1999)。这是由于在植物中，木质素的组成与结构因物种、科属、部位和生长时期等不同而存在差异，甚至所处的自然环境也会影响木质素的组成与结构，导致木质素的三个单体，即h，g，s的组成比例不同。在本研究中，两种棉秆材料在汽爆处理前后只有h单体的比例有了很大幅度的提高，s/h有很大幅度下降，从之前的42.02-76.08降低到3.21-8.46。如前所述，汽爆处理后的降解效率，由处理前的7％左右提高到35％，表明单体s/h的比例是影响降解效率的负因子。4小结通过对陆地棉和海岛棉棉秆的研究比较发现，海岛棉比陆地棉更适宜于作为能源植物，并利用其生物质能转化生产生物乙醇。确定了影响棉秆降解效率的细胞壁组分关键性结构因子是纤维素的聚合度，汽爆+0.25％h2so4二步法通过极大地降低纤维素聚合度，使得降解效率系原样提高了5-6倍。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
：的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12