用于检测和/或辅助检测致手足口病毒EV71的引物组、试剂和试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组、试剂和试剂盒及检测方法。
背景技术：
：手足口病常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，该病可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，一般预后良好，但也有出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒共有20多种，其中，柯萨奇病毒a组16型(coxsackievirusa16，cva16)与肠道病毒71型(enterovirustype71，ev71)均为手足口病的主要致病原。ev71所致的手足口病通常症状更典型、并发症的发生率和致死率均较高。由于不同型病毒所导致的手足口病的治疗方式不同，及时准确区分不同型致病病毒对患儿的治疗尤为重要。目前对于致手足口病毒的检测有各种不同的方法，但是，都有各自的缺点。细胞病变效应检测法实验周期太长且灵敏度低。免疫荧光法和westernblot法对于病毒感染量有一定要求，较低的感染量无法检测病毒。实时荧光聚合酶链反应(realtimepolymerasechainreaction，real-timepcr)、一步法rt-pcr、巢式pcr法均为基于传统pcr的方法，需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。因此，开发一种简便、快捷、成本低并且适用范围广的检测方法具有重要意义。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组，本发明的第二目的在于提供上述引物组在制备检测和或辅助检测致手足口病毒ev71的产品中的应用，本发明的第三目的在于提供一种试剂，本发明的第四目的在于提供一种试剂盒，本发明的第五目的在于提供一种致手足口病毒ev71的检测方法，以缓解现有技术中缺少一种可以快速、简便、准确检测ev71的方法的技术问题。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组，所述引物组包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。上述引物组在制备检测和或辅助检测致手足口病毒ev71的产品中的应用。进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括上述引物组。进一步地，所述试剂包括阳性对照样品；优选地，所述阳性对照样品为含有seqidno.3所示核苷酸序列的dna质粒。进一步地，所述引物组中seqidno.1所示核苷酸序列和seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度均独立的为0.38-0.58μmol/l；优选地，所述阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μl。一种试剂盒，包括上述引物组。进一步地，所述试剂盒包括阳性对照样品；优选地，所述阳性对照样品为含有seqidno.3所示核苷酸序列的dna质粒；优选地，所述引物组中seqidno.1所示核苷酸序列和seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度均独立的为0.38-0.58μmol/l；优选地，所述阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μl。进一步地，所述试剂盒包括含冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液；优选地，所述试剂盒还包括rna反转录用品。一种致手足口病毒ev71的检测方法，将上述引物组作为引物，以待检测样品作为模板，进行rpa扩增，检测并测序扩增产物；优选地，rpa扩增的条件包括：35-39℃扩增50-70min。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明针对致手足口病毒ev71的保守序列，设计特异性rpa扩增引物组，引物组包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。该引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短，灵敏度与普通pcr相当，同时极大地降低了成本。含有上述引物组的试剂或试剂盒等产品同样具有简便、快捷并准确检测ev71的优点。基于该引物组建立了致手足口病毒ev71的检测方法，可对致手足口病毒ev71进行定性检测。该方法利用上述的引物组，不需要特殊的仪器，可以灵敏、准确、简便和快速对致手足口病毒ev71的筛选及快速诊断，便于在基层医疗检疫机构推广。附图说明图1为本发明实施例4中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的试剂盒的验证结果；图2为本发明实施例5中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组特异性检测结果；图3为本发明实施例6中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组灵敏度检测结果；图4为本发明实施例6中普通pcr灵敏度检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组，包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。本发明针对致手足口病毒ev71的保守序列，设计特异性rpa扩增引物组，引物组包括seqidno.1所示的核苷酸序列和seqidno.2所示的核苷酸序列。该引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短，灵敏度与普通pcr相当，同时极大地降低了成本。上述引物组在制备检测和或辅助检测致手足口病毒ev71的产品中的应用。在本发明一个优选地实施方式中，产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括上述引物组。该试剂采用上述引物组作为检测引物，可以快速鉴定待测样品中是否有ev71，可以应用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71，检测机体是否感染了致手足口病毒ev71或者鉴定某种病毒是否为ev71。在本发明一个优选地实施方式中，试剂包括阳性对照样品。设置阳性对照样品可以做到对试剂的实时质控，避免产品本身质量问题导致的检测结果不准确。在本发明一个优选地实施方式中，阳性对照样品为含有seqidno.3所示核苷酸序列的dna质粒。该段序列含有上述引物组的序列，可以快速准确扩增得到阳性产物，该阳性对照样品具有良好的稳定性和准确性。在本发明一个优选地实施方式中，引物组中seqidno.1所示核苷酸序列和seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度均独立的为0.38-0.58μmol/l。该浓度范围内，引物组可以特异性检测得到准确结果，避免试剂的浪费。引物组中的seqidno.1所示核苷酸序列的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/l、0.43μmol/l、0.48μmol/l、0.53μmol/l或0.58μmol/l；引物组中的seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/l、0.43μmol/l、0.48μmol/l、0.53μmol/l或0.58μmol/l。在本发明一个优选地实施方式中，阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μl。该浓度下既可以保证阳性对照样品的检出率，又避免了试剂的浪费。阳性对照样品的终浓度典型但非限制性的为0.1ng/μl、0.15ng/μl、0.2ng/μl、0.25ng/μl或0.3ng/μl。本发明提供一种试剂盒，包括上述的引物组。该试剂盒利用上述引物组中的引物，对待测样本进行检测，特异性高，灵敏度好，可以应用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71，检测机体是否感染了致手足口病毒ev71或者鉴定某种病毒是否为ev71。一些优选地实施方式中，试剂盒包括阳性对照样品。设置阳性对照样品可以做到对试剂盒的实时质控，避免产品本身质量问题导致的检测结果不准确。一些优选地实施方式中，阳性对照样品为含有seqidno.3所示核苷酸序列的dna质粒。该段序列含有上述引物组的序列，可以快速准确扩增得到阳性产物，该阳性对照样品具有良好的稳定性和准确性。一些实施方式中，引物组中seqidno.1所示核苷酸序列和seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度均独立的为0.38-0.58μmol/l；阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μl。引物组中的seqidno.1所示核苷酸序列的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/l、0.43μmol/l、0.48μmol/l、0.53μmol/l或0.58μmol/l；引物组中的seqidno.2所示核苷酸序列的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/l、0.43μmol/l、0.48μmol/l、0.53μmol/l或0.58μmol/l；阳性对照样品的终浓度典型但非限制性的为0.1ng/μl、0.15ng/μl、0.2ng/μl、0.25ng/μl或0.3ng/μl。在一些实施方式中，试剂盒包括含冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液，其中，醋酸镁溶液的浓度优选为280mmol/l。这些试剂均可为但不限为市售的商品。在一些实施方式中，试剂盒还包括rna反转录用品。一种致手足口病毒ev71的检测方法，将上述引物组作为引物，以待检测样品作为模板，进行rpa扩增，检测并测序扩增产物。该检测方法基于上述引物组建立，可对致手足口病毒ev71进行定性检测，不需要特殊的仪器，可以灵敏、准确、简便和快速对致手足口病毒ev71的筛选及快速诊断，便于在基层医疗检疫机构推广。一些优选地实施方式中，rpa扩增的条件包括：35-39℃扩增50-70min。该检测方法仅需要一对引物即可完成扩增，避免了复杂的引物设计过程，反应温度恒定，在较低的温度下进行，不需要特殊的热循环设备，同时反应时间短，快速出结果。该检测方法可以应用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71，检测机体是否感染了致手足口病毒ev71或者鉴定某种病毒是否为ev71。扩增温度典型但非限制性的为35℃、36℃、37℃、38℃或39℃；扩增时间典型但非限制性的为50min、55min、60min、65min或70min。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的致手足口病毒ev71、致手足口病毒cva16为辽宁省疾病预防控制中心提供，a/b/c型轮状病毒、副溶血弧菌为盘锦市疾病预防控制中心提供。实施例1引物组、阳性对照样品的设计针对致手足口病毒ev71的保守序列，设计检测致手足口病毒ev71的rpa引物组，产物大小为126bp；设计阳性对照样品中的阳性对照序列，该序列包含引物组涉及的全部序列。具体引物组和阳性对照序列如下表所示：表1引物组和阳性对照序列实施例2用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的试剂盒该试剂盒包括上述实施例1中的引物组和阳性对照样品，还包括含冻干酶粉管、再水化缓冲液(rehydrationbuffer)、醋酸镁溶液(280mmol/l)。上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(rehydrationbuffer)和醋酸镁溶液(280mmol/l)均来源于rpa扩增试剂盒twistampbasickits。实施例3致手足口病毒ev71的检测方法(a)rpa扩增以待测样品的cdna为模板，以rpa-ev71-f和rpa-ev71-r引物组作为引物，进行rpa扩增，同时设置空白对照(模板为无核酸酶水)。rpa扩增体系如下：向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入再水化缓冲液29.5μl、去离子水12.5μl、rpa-ev71-f和rpa-ev71-r引物各2.4μl(引物的终浓度均为0.48μmol/l)，待测样品或阳性对照样品1μl，最后再加入醋酸镁溶液(280mmol/l)2.5μl。rpa扩增反应条件：将上述rpa扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应60min，得到rpa扩增产物。(b)rpa扩增产物的电泳检测rpa反应结束后，分别向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳，采用3％琼脂糖凝胶，120v，50min，凝胶成像系统观察结果。(c)对rpa扩增产物进行测序。实施例4用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的试剂盒的验证a)、rna的提取及cdna的合成参照试剂盒操作(rneasyminikit，货号为74104，qiagen)提取致手足口病毒ev71的rna。并参照试剂盒(goscriptreversetranscriptionsystem，货号为a5001，promega)的操作，以获得的rna为模板，反转录获得cdna。将获得的cdna保存于-20℃备用。b)、rpa扩增以步骤a)获得的cdna为模板，采用实施例3中的检测方法进行检测。结果如图1(m：maker；1：阳性对照样品；2：致手足口病毒ev71；3：阴性对照)所示：致手足口病毒ev71的rpa扩增产物含有1个条带，大小为126bp，而阴性对照无条带。说明本发明的用于致手足口病毒ev71的rpa引物及rpa试剂盒可以有效检测致手足口病毒ev71。实施例5引物组的特异性检测采用实施例4中的反转录方法，得到致手足口病毒cva16、致手足口病毒ev71和a/b/c型轮状病毒的cdna，采用实施例3中的检测方法rpa扩增检测致手足口病毒cva16、致手足口病毒ev71、a/b/c型轮状病毒和副溶血弧菌。结果如图2(m:maker；1：致手足口病毒ev71；2：致手足口病毒cva16样本；3：a型轮状病毒；4：b型轮状病毒；5：c型轮状病毒；6：副溶血弧菌；7：阴性对照)所示：从图中可以看出，只有致手足口病毒ev71的扩增产物含有1个大小为126bp的条带，致手足口病毒cva16、a/b/c型轮状病毒、副溶血弧菌均无条带。说明本发明的rpa引物特异性高。实施例6引物组的灵敏检测将致手足口病毒ev71的cdna进行梯度稀释，分别得到稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒ev71的cdna。rpa扩增：分别以上述得到的稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒ev71的cdna为模板，采用rpa-ev71-f和rpa-ev71-r引物组按照实施例3中的检测方法进行rpa扩增。pcr扩增：分别以上述得到的稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒ev71的cdna为模板，采用ev71-f和ev71-r引物进行pcr扩增。参照2×primestarhs(premix)产品说明书(takara，r040a)，每个pcr体系50μl，包括2×primestarhs(premix)25μl，上、下游引物各1μl(10μmol/l)，cdna2μl，补充水至50μl，pcr扩增条件为：98℃，10s；56℃5s；72℃1kb/min；共35个循环。pcr扩增引物序列见表2。表2pcr引物序列名称序列(5’-3’)序列号ev71-fcaaatgccagtgacgagagcatgseqidno.4ev71-ragagggagatctatctctccaacseqidno.5分别对rpa扩增产物和pcr扩增产物进行检测，在凝胶成像系统上观察结果。rpa电泳结果如图3(m:maker；泳道1-6依次为：模板cdna分别稀释1、10、102、103、104、105倍)所示。pcr电泳结果如图4(m:maker；泳道1-6依次为：模板cdna分别稀释1、10、102、103、104、105倍)所示。从图3和图4中可以看出，本发明的rpa方法与普通pcr的灵敏度相当。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。sequencelisting<110>辽宁佰昊生物科技有限公司<120>用于检测和/或辅助检测致手足口病毒ev71的引物组、试剂和试剂盒及检测方法<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>52<212>dna<213>人工序列<400>1aattctaatacgactcactatagggccagtgacgagagcatgattgagacac52<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<400>2tccaactaatcccgccctgctgaagaaact30<210>3<211>124<212>dna<213>人工序列<400>3caaatgccagtgacgagagcatgattgagacacgctgtgttcttaactcgcacagtacag60ctgagaccactcttgatagtttcttcagcagggcgggattagttggagagatagatctcc120ctct124<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4caaatgccagtgacgagagcatg23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5agagggagatctatctctccaac23当前第1页12