来源于黄瓜的CsVDL基因及其在调控植物耐逆性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及来源于黄瓜的csvdl基因及其在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术：

在强光下植物可通过类胡萝卜素以非光化学猝灭的方式耗散掉过多的光能，防止光抑制或减轻过量光能引起的光破坏。在此过程中，经由紫黄质脱环氧化酶(vde)的作用，紫黄质(v)脱环氧化形成花药黄质(a)，进而形成玉米黄质(z)，研究表明z和a能够从叶绿素中吸收过多的激发能并以热能的形式耗散掉，从而保护光合器官免受强光的破坏。此外，紫黄质、花药黄质、玉米黄质和新黄质等是生物体内重要的类胡萝卜素，具有极高的抗氧化性，也是高等植物脱落酸(aba)合成途径中的重要前体物质。

黄瓜喜温暖而不耐高温强光，在生产中易受到干旱、低温等逆境胁迫，严重影响其植株生长发育和产品品质。因此弄清非生物逆境引起的黄瓜抗逆响应的生理与分子机制对于黄瓜育种及栽培等方面的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，为如下1)或2)或3)：

1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的dna分子：

(a1)编码区包括序列表中序列1的dna分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1的dna分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的dna分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的dna分子。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也是本发明保护的范围。

上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在促进植物合成aba中的应用也是本发明保护的范围；

或，

上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在减缓植物种子萌发中的应用也是本发明保护的范围。

抑制上述蛋白质，或，上述核酸分子表达的物质在抑制植物合成aba中的应用也是本发明保护的范围；

或抑制上述蛋白质，或，上述核酸分子表达的物质在促进植物种子萌发中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述物质为抑制csvdl基因的反义表达载体。

所述抑制csvdl基因的反义表达载体为将序列表中序列1所示的dna片段替换植物表达载体pbi121的hindiii和bamhi酶切位点间得到的载体；即序列1的第1位紧邻bamhi酶切位点，序列1的最后1位紧邻hindiii酶切位点，得到的载体。

本发明另一个目的提供一种培育aba含量升高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为提高目的植物中上述蛋白质的含量或活性，得到转基因植物；

所述转基因植物的aba含量高于所述目的植物；

本发明第3个目的是提供一种培育种子萌发快的植物的方法。

本发明提供的方法，为降低目的植物中上述蛋白质的含量或活性，得到转基因植物；

所述转基因植物的种子萌发率高于所述目的植物。

上述方法中，

所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量或活性为将上述蛋白质的编码核酸导入目的植物；

或，所述降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量或活性为将上述的物质导入目的植物。

上述植物是如下c1)至c4)中的任一种：

c1)双子叶植物；

c2)单子叶植物；

c3)十字花科植物；

c4)拟南芥。

本发明的实验证明，从黄瓜中克隆的csvdl基因，在反义表达csvdl基因的拟南芥种子中aba含量降低，种子萌发较快，过表达csvdl基因的拟南芥种子中aba含量升高，种子萌发较慢，表明，csvdl基因在影响植物aba合成和种子萌发方面具有十分重要作用，对于进一步研究植物抗逆作用相关分子生物学信息具有非常重要的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为southernbolt分析鉴定结果。

图2为黄瓜不同组织部位csvdl基因时空表达分析。

图3为非转基因和转基因拟南芥种子aba含量(a)和种子萌发率(b)分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、csvdl基因的获得

一、csvdl基因的克隆

提取黄瓜叶片的rna。以此rna为模板，反转录得到第一链cdna，进行pcr扩增。

上述pcr扩增的引物为如下正向引物和反向引物：

正向引物：5’-atgaaagtggagttgaatttcaatttcaat-3’；

反向引物：5’-ttatttaacctcaatcacattatgcaaagt-3’；

上述反应体系如下表1所示：

表1

pcr反应条件：先95℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

得到1596bppcr产物。

将pcr产物送去测序，结果该pcr产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸的基因的开放阅读框为序列1第1-1596位；该基因命名为csvdl；该基因编码的蛋白命名为csvdl，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

二、southernbolt分析鉴定

a.黄瓜基因组dna的提取

(1)dna提取液中加入亚硫酸氢钠至终浓度30mm，现用现加。

(2)将液氮研磨好的材料0.25g左右，加入271μl上述混合液。

(3)加入271μl核酸裂解液和108ul5％sds，振荡器混匀。

(4)65℃水浴20～60min，中间颠倒几次。

(5)加入600μl(氯仿：异戊醇＝24：1)混匀。

(6)离心(12000rpm，5min)取600μl上清，加入5μl蛋白酶和1μlrnaase37度水浴1h，加入600μl(氯仿：异戊醇＝24：1)

(7)10000rpm离心5min，取上清。

(8)加650μl负20℃遇冷的异戊醇，混匀(轻轻上下翻转直到看到白色絮状dna,效果好的话絮状上应该有很多小的气泡。)

(9)13000rpm离心5min，弃上清。

(11)加100μl70％乙醇清洗dna，离心弃去乙醇，晾干。

(11)100μl1/10te或者h2o洗脱。(洗脱液要先65度水浴预热10～30min

b.分别用saci、xbai、hindiii、ecorv进行酶切，黄瓜基因组dna的酶切体系为：50μl10×buffer，50μlbsa，7μldna，5μl内切酶，补足ddh2o到500μl。酶切三个小时后，补加2μl酶然后酶切过夜，以充分酶切基因组dna。

c.杂交

(1)电泳：纯化后的酶切产物在1v/cm的电压下，0.8％的琼脂糖凝胶电泳6～8h。

(2)洗胶：在变性液(1.5mnacl、0.5mnaoh)中洗涤两次，每次20min；再用灭菌水洗涤一次；最后用中性液(1mtris·cl、1.5mnaclph7.4)洗涤两次每次20min。

(3)转膜：取一个瓷盘，在上面放一块玻璃板做桥，盛器内的20×ssc(3mnacl0.3m、柠檬酸钠ph7.0)转移滤液，在玻板表面盖一张3mm的滤纸做纸桥，滤纸两边浸没于20×ssc溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。在滤纸上从下到上依次放置胶(胶的底部朝上)―膜(杂交膜)―滤纸―吸水纸―玻璃板―重物，转膜过夜。

(4)洗膜：2×ssc中漂洗5min，吸水纸吸干，80℃烤箱下烘烤2～3h。

(5)杂交：将标记好的探针(标记方法参照试剂盒说明书，引物同上述克隆基因全长序列1引物)，100℃煮10min，迅速冰浴10min备用；取5mlhyb高效杂交液，加入处理后的探针，与烘烤后的杂交膜一起装入杂交袋中，封口65℃水浴震荡过夜。

(6)洗膜：膜放在2×ssc、0.1％sds溶液中，在室温下震荡洗涤两次，每次5min；用镊子将膜转入0.1×ssc、0.1％sds溶液中，50℃水浴震荡洗涤两次，每次15min；洗涤缓冲液中(0.1m马来酸、0.15mnacl、0.3％吐温-20)震荡洗涤5min。

(7)信号检测(参照试剂盒说明书)：10×阻断液孵育30min；抗体缓冲液中孵育30min；洗涤缓冲液中洗涤30min；15ml检测缓冲液中平衡5min；避光条件下新鲜制备的显色缓冲液中显色，当条带亮度达到一定预期亮度后，用双蒸水洗涤以终止显色反应，照相。

结果如图1所示，可以看出，southernbolt分析鉴定黄瓜基因组中csvdl基因的拷贝数为1。

三、csvdl基因时空表达情况

分别取黄瓜植株根、茎、老叶、幼叶、功能叶、花和果实部位样品，将幼叶定义为植株顶端未展开的叶片，成熟叶片取从顶端向下数第三片完全展开的叶片，老叶为从下向上数第二片叶子。

分别提取黄瓜各组织器官rna，反转录合成第一链cdna后，以cs18srrna为内参，进行半定量pcr分析csvdl的时空表达情况。

csvdl基因半定量pcr的引物同上述克隆基因全长序列1引物；

cs18srrna半定量pcr的引物序列如下：

正向引物：5’-gcccgttgctctgatgat-3’

正向引物：5’-agcgtaggcttgctttga-3’；

结果如图2所示，可以看出，黄瓜csvdl基因在黄瓜幼叶中表达量最高，其次是黄瓜老叶、功能叶和果实中表达量较高，在根和茎中表达量最低。

实施例2、csvdl基因的功能研究

一、转csvdl拟南芥的构建

1、重组载体

过表达csvdl的重组载体pbi121-csvdl为将序列表中序列1所示的csvdl基因替换植物表达载体pbi121(lü,etal.,2017.lüj.,suix.,mas.,lix.,liuh.,zhangz.,suppressionofcucumberstachyosesynthasegene(cssts)inhibitsphloemloadingandreduceslowtemperaturestresstolerance.plantmolecularbiology,2017,95:1-15)的hindiii和bamhi酶切位点间，即序列1的第1位紧邻hindiii酶切位点，序列1的最后1位紧邻bamhi酶切位点，得到的载体。

抑制csvdl基因的反义表达载体pbi121-csvdl-a为将序列表中序列1所示的dna片段反向替换植物表达载体pbi121的hindiii和bamhi酶切位点间，即序列1的第1位紧邻bamhi酶切位点，序列1的最后1位紧邻hindiii酶切位点，得到的载体。

2、重组农杆菌

将上述1得到的重组载体pbi121-csvdl导入农杆菌eha105中，得到重组农杆菌eha105/pbi121-csvdl。

将上述1得到的反义表达载体pbi121-csvdl-a导入农杆菌eha105中，得到重组农杆菌eha105/pbi121-csvdl-a。

3、转csvdl拟南芥的构建

将上述重组农杆菌eha105/pbi121-csvdl和eha105/pbi121-csvdl-a分别利用蘸花法转化野生型拟南芥col-0(arabidopsisthaliana)，得到t0代转csvdl拟南芥种子和t0代转csvdl-a拟南芥种子。

拟南芥转化参照clough等[cloughsj,bentaf.(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacteriym-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.theplantjournal,16(6),735～743]的蘸花法进行。将过夜培养的重组农杆菌菌液，用浸染液稀释至od值为1～2,把将要开花的花蕾浸泡在农杆菌浸染液中2分钟，25～28℃暗培养20小时。然后，将转化的植株开花结果后，收集种子。

4、转csvdl拟南芥的筛选和检测

将t0代转csvdl拟南芥种子和t0代转csvdl-a拟南芥种子，进行表面消毒后，种植在含有卡那霉素的ms培养基上进行筛选，在卡那霉素抗性培养基上能够正常生长的拟南芥植株转接到花盆，得到t0代转csvdl拟南芥和t0代转csvdl-a拟南芥。

分别提取t0代转csvdl拟南芥和t0代转csvdl-a拟南芥叶片dna，用同上述克隆基因全长序列1引物进行扩增。

得到1956bp的为阳性t0代转csvdl拟南芥；

得到1956bp的为阳性t0代转csvdl-a拟南芥。

将阳性t0代植株继续培养使其开花结果，继续筛选到t3代植株种子。

csvdl为黄瓜中基因，将该基因在拟南芥植株中异源表达，拟南芥野生型对照植株中没有该基因的表达。

二、功能检测

将t3代转csvdl拟南芥种子(过表达)和t3代转csvdl-a拟南芥种子(反义)用80％甲醇抽提；具体方法如下：

称取样品0.5g,加入1ml的80％甲醇，冰域研磨匀浆，转入10ml试管中，分次用1ml提取液冲洗研钵，一并转入试管中，摇匀，浸提4h后1000g离心15min，收集上清。沉淀中加入1ml的80％甲醇摇匀，浸提1h后，1000g离心15min，合并上清，弃去残渣，用氮气吹干除去甲醇。

用酶联免疫法测定种子中aba含量，由中国农业大学王保民教授实验室帮助完成，酶联免疫法检测aba使用agdia公司植物aba酶联免疫检测试剂盒(immunoassaykitforaba，货号:pdk09347/0096)，aba含量计算及检测方法参见说明书。以野生型拟南芥为对照。

结果如图3a所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，反义表达csvdl基因的t3代转csvdl-a拟南芥种子中aba含量降低，过表达csvdl基因的t3代转csvdl拟南芥种子中aba含量升高。

将t3代转csvdl拟南芥种子(过表达)和t3代转csvdl-a拟南芥种子(反义)播种到不含蔗糖的ms培养基上培养，统计萌发率。

结果如图3b所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，反义表达csvdl基因的t3代转csvdl-a拟南芥种子萌发较快，过表达csvdl基因的t3代转csvdl拟南芥种子萌发较慢。

序列表

<110>中国农业大学

<120>来源于黄瓜的csvdl基因及其在调控植物耐逆性中的应用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1596

<212>dna

<213>1

<400>1

atgaaagtggagttgaatttcaatttcaattcaggaaccagtatcgggaatggatggcct60

ctcaacccccatttccatttcttcctttcgcatcgaaaacccacttatttccctactctg120

tcgatgcccagccaccggcctactgtttctcgtcggctgctcacagttccaccgcccgta180

gttgcggaggcgaacaagaatatggcgatggcagatactccggtgagaatagtagcgatt240

gttggtgaaggaagcattagccccctgaaatccactccttgggaagaagttatgctgcac300

accgcaaaacgactaaaatgggtcgatgaatgctatgaaatgcacgtctttgctgataat360

gtttgtaacgtaactcgtcaagatactgaaaccattcaaatcatatgtgaagcggatatt420

ttggtggttgttgctgtcacaactaaggattcagtcttatggatacgcttgaactgcgaa480

aacatccaaaacattatttgctttgaatctgcagctgagttggttaacaaattagggggt540

atatcctttcttagtgaaaccaaaggaaatttactggaaaacttttttggaaattctcag600

ctgatggagaaaagaaagaaatctgaggaagtagtgcagactgtatttgaggcatgggat660

cgtcgaaattccgacgatataaggttctgtttgttggttataatcaatgcatatataaag720

cctgttcccatactgaaaaatctaagatcaaaaggtttttcaactctaaattgcatggta780

aagaattgtggaaggcaaatattgaattgcttgatggatgctaattgtagaaaagctctt840

caatgcttgaatcaatgcagcccagtggatcaagtatgcaactacagatgtattgcttca900

tatgaaagtccaaatcttgaagcattttcattatgtgtgctgcaaaagcacaattgtctg960

gacttggatgctaaagttcccgaaaagccttacgtgcctccaatcgagagatttcgaggg1020

aaggagatatgccacgaaacggcagaggatctttttattggttggttagggagtttggag1080

tggagttggcgtgtcgtagctgggcaaaatcctgcttatgatcagtttccatgtcaatac1140

caattgttttacagagggaaagcgagaggatcgttttggtacgaaccggtattcatggtg1200

aaaacattggaaggaaagttggtgtggaggcgacgacggtatcgagtaaagagggggaaa1260

attgcaggaacattcttgttcagtgtgttggataatggtgttgtttcaaatgagttttgg1320

agcattgtagatgtatgtgatgatctatcttggggtttgtttcattataatggagctgct1380

cgagctgcgggacagtcgtatacgggcgcagttcttgttagtcgagatggtaaataccct1440

gaaaatgatcttcaaaaagagagaattgttgctgctttggagaaatgtggaataaaagag1500

tgggaactctttgcagttgataactcctcttgtttagatccaccccttggaattccagat1560

ggttcaactttgcataatgtgattgaggttaaataa1596

<210>2

<211>531

<212>prt

<213>2

<400>2

metlysvalgluleuasnpheasnpheasnserglythrserilegly

151015

asnglytrpproleuasnprohisphehisphepheleuserhisarg

202530

lysprothrtyrpheprothrleusermetproserhisargprothr

354045

valserargargleuleuthrvalproproprovalvalalagluala

505560

asnlysasnmetalametalaaspthrprovalargilevalalaile

65707580

valglygluglyserileserproleulysserthrprotrpgluglu

859095

valmetleuhisthralalysargleulystrpvalaspglucystyr

100105110

glumethisvalphealaaspasnvalcysasnvalthrargglnasp

115120125

thrgluthrileglnileilecysglualaaspileleuvalvalval

130135140

alavalthrthrlysaspservalleutrpileargleuasncysglu

145150155160

asnileglnasnileilecysphegluseralaalagluleuvalasn

165170175

lysleuglyglyileserpheleusergluthrlysglyasnleuleu

180185190

gluasnphepheglyasnserglnleumetglulysarglyslysser

195200205

glugluvalvalglnthrvalpheglualatrpaspargargasnser

210215220

aspaspileargphecysleuleuvalileileasnalatyrilelys

225230235240

provalproileleulysasnleuargserlysglypheserthrleu

245250255

asncysmetvallysasncysglyargglnileleuasncysleumet

260265270

aspalaasncysarglysalaleuglncysleuasnglncysserpro

275280285

valaspglnvalcysasntyrargcysilealasertyrgluserpro

290295300

asnleuglualapheserleucysvalleuglnlyshisasncysleu

305310315320

aspleuaspalalysvalproglulysprotyrvalproproileglu

325330335

argpheargglylysgluilecyshisgluthralagluaspleuphe

340345350

ileglytrpleuglyserleuglutrpsertrpargvalvalalagly

355360365

glnasnproalatyraspglnpheprocysglntyrglnleuphetyr

370375380

argglylysalaargglyserphetrptyrgluprovalphemetval

385390395400

lysthrleugluglylysleuvaltrpargargargargtyrargval

405410415

lysargglylysilealaglythrpheleupheservalleuaspasn

420425430

glyvalvalserasngluphetrpserilevalaspvalcysaspasp

435440445

leusertrpglyleuphehistyrasnglyalaalaargalaalagly

450455460

glnsertyrthrglyalavalleuvalserargaspglylystyrpro

465470475480

gluasnaspleuglnlysgluargilevalalaalaleuglulyscys

485490495

glyilelysglutrpgluleuphealavalaspasnsersercysleu

500505510

aspproproleuglyileproaspglyserthrleuhisasnvalile

515520525

gluvallys

530