用于C5aR1基因敲除的sgRNA、载体以及构建方法和检测方法与流程

本发明涉及基因敲除领域，具体而言，涉及用于c5ar1基因敲除的sgrna、载体以及构建方法和检测方法。
背景技术：
：慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,copd)是一种慢性气道炎症性疾病，气道重塑(airwaywallremodeling)是其主要的病理特点之一，也是疾病进展难愈的重要原因。慢性阻塞性肺病的发生与气道和肺对有害气体或颗粒的慢性炎症反应增强有关。目前认为，气道重塑除了在气道炎症基础上的异常修复过程外，还可能与氧化损伤、蛋白酶-抗蛋白酶失衡以及凋亡及凋亡细胞的清除异常等机制有关。虽然临床上使用吸入糖皮质激素等针对气道炎症的治疗，但治疗效果仍不满意，提示已知的copd气道重塑机制仍不完善，亟需进一步明确气道重塑的其他机制，探索和寻找新的治疗靶点，干预和逆转疾病过程。过敏毒素c5a(complementcomponent5a，c5a)是补体系统中的一员，大量证据证实了c5a在急性炎症反应中发挥了非常重要的作用，但其在慢性炎症反应中的作用鲜有提及。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：在前期工作中，发明人发现气道诱导痰c5a水平不仅在copd急性加重的患者中升高，在稳定期copd患者气道诱导痰中同样升高，提示c5a不仅在急性炎症中发挥作用，在copd稳定期的慢性气道炎症的维持和发展中也可能具有重要的作用，但其具体作用和作用机制仍不清楚。深入地研究c5a在气道重塑中的作用和分子机制，对于寻找新的copd气道重塑的治疗靶点具有重要意义。基于上述内容，本发明的目的在于提供构建c5ar1基因敲除小鼠的方法，其包括设计用于c5ar1基因敲除的sgrna及其载体，进而通过注射相应的sgrna与cas9蛋白，得到c5ar1基因敲除的小鼠，以用于上述的研究。本发明提供了用于c5ar1基因敲除的sgrna，所述sgrna的核酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。本发明经过对待敲除序列的分析，共涉及了14个sgrna，经过活性检测，得到这两条sgrna，经过后续实验验证，其与cas9蛋白配合，得到c5ar1基因敲除的小鼠。本发明还提供了用于c5ar1基因敲除的t7-sgrna，所述t7-sgrna的核酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明提供的用于c5ar1基因敲除的sgrna，采用载体进行转录，其用于转录的序列如seqidno.3和seqidno.4所示，经转录，得到足量用于注射的sgrna。本发明还提供一种载体，含有上述的t7-sgrna。该载体用于转录用于c5ar1基因敲除的sgrna，得到足量用于注射的sgrna。本发明还提供了一种构建c5ar1基因敲除小鼠的方法，如seqidno.1所示的sgrna与cas9蛋白或如seqidno.2所示的sgrna与cas9蛋白转入到小鼠受精卵中，后续经过基因型检测，得到c5ar1敲除的模型小鼠。进一步地，所述转入采用显微注射的方式。进一步地，如seqidno.3所示的sgrna和如seqidno.4所示的sgrna分别连入表达载体上进行体外转录，得到用于显微注射的sgrna；所述表达载体为携带t7启动子质粒的载体。本发明还提供了用于检测上述的构建c5ar1基因敲除小鼠的方法得到的c5ar1基因敲除小鼠的引物序列，所述引物序列如seqidno.5-7所示。本发明设计的引物，引物序列如seqidno.5-6配合，只能扩增出野生型的等位基因。引物序列如seqidno.5和7配合，这对引物用于确认基因敲除的发生，两条引物分别设计在敲除序列的两侧。理论上，对于杂合子动物，使用这对引物进行pcr时会得到2个产物：野生型等位基因的pcr产物、突变型等位基因的pcr产物；但实际上，这两个产物的长度有时差别很大，野生型等位基因的pcr产物比较长，而突变型等位基因的pcr产物比较短，pcr时可能无法扩增出野生型等位基因上的pcr产物，也就不能确认动物的具体基因型(包括野生型、杂合、纯合)，而且不能确认突变基因序列在基因组中的具体位置及突变碱基数。结合上述引物的结果，可以有效确定动物的具体基因型：纯合子/杂合子/野生型。本发明还提供了一种检测上述的构建c5ar1基因敲除小鼠的方法得到的c5ar1基因敲除小鼠的试剂盒，含有上述的引物序列。进一步地，所述试剂盒还包括dntps、dna聚合酶、缓冲液、双蒸水中的任一种或几种。本发明提供的试剂盒，为c5ar1基因敲除小鼠的检测提供便利。本发明还提供了一种检测上述的构建c5ar1基因敲除小鼠的方法得到的c5ar1基因敲除小鼠的方法，上述的引物序列以待检测物的基因组作为模板，进行pcr扩增，得到的产物测序，判断所述待检测物的检测位点的基因型。进一步地，所述待检测物为鼠尾基因组。进一步地，pcr扩增体系为20-25μl。进一步地，pcr扩增的退火温度为62℃。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明经过对待敲除序列的分析，共涉及了14个sgrna，经过活性检测，得到这两条sgrna，经过后续实验验证，其与cas9蛋白配合，得到c5ar1基因敲除的小鼠。(2)本发明还提供了用于c5ar1基因敲除的t7-sgrna，其连入载体进行转录，得到足量用于注射的sgrna。(3)本发明还提供了一种构建c5ar1基因敲除小鼠的方法，方法简便，能有效得到c5ar1基因敲除的小鼠。(4)本发明还提供了用于检测c5ar1基因敲除小鼠的引物、试剂盒和方法，为c5ar1基因敲除小鼠的检测提供便利。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1中ege-wfz-004基因敲除策略示意图；图2为本发明实施例1中cas9/sgrna的活性检测结果图；图3为本发明实施例2中t7启动子质粒载体上体外转录sgrna的电泳检测图；图4为本发明实施例2中鉴定引物设计示意图；图5为本发明实施例2中f0代基因分型检测结果图；图6为本发明实施例2中f1代基因分型ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-mut-r检测结果图；图7为本发明实施例2中f1代基因分型ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-wt-r检测结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1ege-wfz-004基因敲除模式小鼠的设计1、相关信息的了解以及打靶策略设计ege-wfz-004基因在7号染色体反链上，全长约12.59kb。geneid:12273。ege-wfz-004基因有3个转录本。分析ege-wfz-004基因结构，选择将整个编码区删除。sgrnas分别设计在intron1-2和3’utr下游的非保守区，大约造成5.5kb的基因组缺失，从而达到ege-wfz-004基因敲除的目的。采用百奥赛图公司基于crispr/cas9开发的ege系统制备模式小鼠。具体敲除策略如图1所示。2、ege-wfz-004基因敲除模式小鼠的制备2.1靶序列的测序确认不同品系，靶基因序列可能有所差异。为了保证所设计cas9/sgrna的效率，首先需要对c57bl/6鼠尾靶位点序列进行pcr扩增并测序验证，以保证sgrna识别序列与c57bl/6鼠尾dna序列完全一致。pcr引物如表1所示。表1pcr引物对c57bl/6鼠尾dna进行pcr及测序，结果证明：c57bl/6鼠尾靶序列与genebank和ensembl所给序列完全一致。2.2cas9/sgrna设计及活性检测2.2.1cas9/sgrna的设计基于sgrna的设计原则，在5’靶位点和3’靶位点区域各设计7条sgrna，如表2和表3所示。表25’靶位点表33’靶位点对表2和表3设计的sgrna进行序列的调整，得到的序列如表4所示。表4sgrna的序列sgrnaguidernasequenceege-wfz-004-sgrna1ggatcctggtgtcctcggtege-wfz-004-sgrna2ggtcacatttccagcccaccgege-wfz-004-sgrna3ggcccaaagttggtataaagacege-wfz-004-sgrna4ggaactgtgaccgatatctgege-wfz-004-sgrna5ggcccaatatgtttatacaccaege-wfz-004-sgrna6ggtctttataccaactttege-wfz-004-sgrna7ggagtagcaagcttacagtcege-wfz-004-sgrna8ggattgatggtagggtgcttaege-wfz-004-sgrna9ggccaggtgtcccctccttaaege-wfz-004-sgrna10ggcacaggggactcccttaaggege-wfz-004-sgrna11ggctgtaaaaccagcttaege-wfz-004-sgrna12ggccacaagagggagacaactege-wfz-004-sgrna13ggcagccattacaaatcattege-wfz-004-sgrna14ggcatgtatgtccagcatgtg2.2.2cas9/sgrna质粒的构建按照表4设计sgrna序列合成相应引物，通过gibsonassembly的方式连入pcs-3g载体，连接产物转化后送样测序验证正确。2.3cas9/sgrna的活性检测sgrna的活性检测，采用百奥赛图的crispr/cas9活性检测方法-ucatm方式进行。其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点(具体实验方法详见公司网站)。得到的检测结果如图2所示。综合考虑，选择ege-wfz-004-sgrna4和ege-wfz-004-sgrna13进行下一步实验。实施例2实施例1得到的ege-wfz-004-sgrna4和ege-wfz-004-sgrna13设计连入带t7启动子质粒载体上进行体外转录的序列，具体如下：ege-wfz-004-t7-sgrna4：ctatttctagctctaaaaccagatatcggtcacagttcctatagtgagtcgtatta；ege-wfz-004-t7-sgrna13：ctatttctagctctaaaacaatgatttgtaatggctgcctatagtgagtcgtatta。ege-wfz-004-t7-sgrna4和ege-wfz-004-t7-sgrna13分别连入带t7启动子质粒载体上进行转录，得到的rna如图3所示。得到的rna用于显微注射。1、cas9/sgrna的显微注射将cas9/sgrna分别显微注射到小鼠(c57bl/6n)受精卵中，共注射332个，注射后f0小鼠出生有45个。2、f0代小鼠基因型检测鉴定引物设计如图4所示。图4中，箭头代表引物设计的位置及方向。ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-mut-r：这对引物用于确认基因敲除的发生，两条引物分别设计在敲除序列的两侧。理论上，对于杂合子动物，使用这对引物进行pcr时会得到2个产物：野生型等位基因的pcr产物、突变型等位基因的pcr产物；但实际上，这两个产物的长度有时差别很大，野生型等位基因的pcr产物比较长，而突变型等位基因的pcr产物比较短，pcr时可能无法扩增出野生型等位基因上的pcr产物，也就不能确认动物的具体基因型(包括野生型、杂合、纯合)，而且不能确认突变基因序列在基因组中的具体位置及突变碱基数。ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-wt-r：这对引物只能扩增出野生型等位基因的pcr产物，结合ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-mut-r的pcr结果，将可以确定动物的具体基因型：纯合子/杂合子/野生型。得到的引物如表5所示。表5引物序列注：wt-野生型等位基因；mut-突变型等位基因。pcr条件：enzyme:kod-fx，体系为20μl。引物：ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-mut-r，得到的pcr产物检测图如图5所示。通过pcr实验及测序结果，表明#e3z4-003,#e3z4-004,#e3z4-006,#e3z4-008,#e3z4-009,#e3z4-012,#e3z4-017,#e3z4-018,#e3z4-022,#e3z4-026,#e3z4-028,#e3z4-031,#e3z4-032,#e3z4-033,#e3z4-035,#e3z4-036,#e3z4-037,#e3z4-040and#e3z4-045为f0代阳性小鼠。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0小鼠为嵌合体。故以f0小鼠鼠尾进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待f1小鼠鼠尾检测后确定。3、f1代小鼠基因型鉴定将上述阳性f0小鼠分别与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的f1代小鼠,交配结果如表6所示。表6交配结果注：“-”表示未统计。检测所用的引物同上，不同的是，pcr条件：enzyme:taq。检测结果如图6和7所示。图6中，primers:ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-mut-r；图7中，primers:ege-wfz-004-wt-f/ege-wfz-004-wt-r。经测序，图6中的f1代阳性基因分型如表7所示。表7f1代阳性基因分型mouseidfatheridmotheridgendergenotype1e3z4-006e3z4-003c57bl/6n♀△5468in3/+1e3z4-008e3z4-003c57bl/6n♀△5468in3/+1e3z4-011e3z4-033c57bl/6n♂△5469in6/+1e3z4-016e3z4-033c57bl/6n♀△5469in6/+1e3z4-018e3z4-033c57bl/6n♀△5469in6/+1e3z4-020e3z4-033c57bl/6n♀△5469in6/+通过pcr鉴定与测序结果，表明1e3z4-006,1e3z4-008,1e3z4-011,1e3z4-016,1e3z4-018,1e3z4-020为f1代阳性小鼠。其中，1e3z4-006和1e3z4-008缺失了5468个碱基，额外插入了3个碱基；1e3z4-011,1e3z4-016,1e3z4-018,1e3z4-020缺失了5469个碱基，额外插入了6个碱基。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。sequencelisting<110>北京大学第三医院<120>用于c5ar1基因敲除的sgrna、载体以及构建方法和检测方法<130>2018<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ggaactgtgaccgatatctg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggcagccattacaaatcatt20<210>3<211>56<212>dna<213>人工序列<400>3ctatttctagctctaaaaccagatatcggtcacagttcctatagtgagtcgtatta56<210>4<211>56<212>dna<213>人工序列<400>4ctatttctagctctaaaacaatgatttgtaatggctgcctatagtgagtcgtatta56<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5ctgggtttggagtctgtggcttcat25<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6tccactgtataccaggctagtccca25<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<400>7ctgaaccagaggcttgtgcgtgtt24当前第1页12